肌病的诊断方法.pdf

本发明提供了确定他汀类所诱导肌病的诊断方法。该方法尤其适用于确定前兆、早期征兆以及症状性肌病。该方法包括从生物样品(如血液或血清)收集脂质组学谱，并将所得到的脂质组学谱与参照脂质组学标志物进行比较。已通过将促炎性肌肉组织基因表达谱与高剂量他汀类治疗相关的脂质组学谱相结合建立了所述参照脂质组学标志物。本发明还涉及用于实施确定他汀类所诱导肌病之方法的试剂盒。

1.  一种用于确定他汀类所诱导肌病的方法，其包括以下步骤
a)提供来自他汀类治疗前或治疗期间个体的生物样品；
b)从所述生物样品收集脂质组学模式；
c)将所收集的脂质组学模式与参照脂质组学标志物进行比较，其中已通过将促炎性肌肉组织基因表达谱与高剂量他汀类治疗相关的脂质组学谱相结合建立了所述参照脂质组学标志物。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于确定所述个体发生他汀类所诱导肌病的风险。

3.  根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于确定所述个体中他汀类所诱导肌病的早期征兆。

4.  根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用于在表现出肌病症状的个体中确定他汀类所诱导肌病。

5.  根据权利要求1所述的方法，其中所述促炎性基因表达谱是花生四烯酸5-脂加氧酶激活蛋白(ALOX5AP)基因(Uniprot ID：P20292)途径。

6.  根据权利要求1所述的方法，其中所述参照脂质组学标志物是选自表1所示脂质中的一种或多种脂质。

7.  根据权利要求1所述的方法，其中所述参照脂质组学标志物是选自表2所示脂质中的一种或多种脂质。

8.  根据权利要求1所述的方法，其中从收集自与(b)中收集脂质组学谱相同个体的脂质组学谱建立所述参照脂质组学标志物，并且所述参照脂质组学标志物在所述个体开始他汀类治疗前建立。

9.  根据权利要求1所述的方法，其中从收集自健康普通人群的脂质组学谱建立所述参照脂质组学标志物。

10.  根据权利要求1所述的方法，其中所述ALOX5AP基因的表达还用作生物标志物。

11.  用于进行权利要求1所述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括所述参照脂质组学标志物和进行分析所用的必要试剂。

肌病的诊断方法
技术领域
本发明涉及用于确定他汀类(statin)所诱导肌病的诊断方法。该方法尤其适用于确定警告、早期征兆以及症状性肌病。该方法包括收集脂质生物学标志物谱并将其与参照脂质组学标志物进行比较。该方法还包括所述生物标志物谱的化学计量建模和统计分析。本发明还涉及用于实施确定他汀类所诱导肌病之诊断方法的试剂盒。
背景技术
高水平的血液胆固醇是导致动脉粥样硬化和心血管疾病的主要风险因素之一。临床上可以用3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶抑制剂(合称他汀类)使升高的胆固醇水平降低。他汀类已在大量的临床试验中显示出有效降低胆固醇血液水平。当前有大量不同的他汀类存在。高胆固醇值在欧洲和美国非常常见，使用他汀类来降低胆固醇值正显著增加。在欧盟成员国中，他汀类的使用从1997年至2002年平均增长了30％。
最近的临床数据显示，他汀类治疗具有副作用。与他汀类有关的最主要且最重要的副作用是肌病。肌病是多种肌肉相关问题的总称，所述肌肉相关问题例如肌肉疼痛(肌痛)、衰弱和痉挛(Paul D.Thompson等，Am J Cardiol 2006，97(增刊)：69C-76C)。他汀类诱导肌病的确切机制尚不清楚。最近的研究显示，临床可接受剂量的阿托伐他汀和辛伐他汀导致血浆泛醌的水平降低。泛醌是参与线粒体电子传递并因此参与组织能量代谢的辅酶。他汀类(如阿托伐他汀和辛伐他汀)对骨骼肌明显具有影响(等，Clin Pharmacol Ther 2005：78：60-8)。
代谢组学是致力于系统研究细胞、组织和体液(biofluid)中小分子(即代谢物)的学科。代谢物是细胞调节过程的终产物，其水平可被视为生物系统针对遗传或环境变化的放大反应。几十年来，临床医生已依赖了代谢组学中包含的小部分信息，例如测量葡萄糖以监测糖尿病以及测量胆固醇以监测心血管健康。已开发新的精密的代谢组学分析平台和信息工具以提供广泛和灵敏的代谢组测量。
已知脂质作为结构组分(例如细胞膜)、能量储存组分以及作为信号分子起到重要作用。脂质被广义定义为疏水或两亲性小分子，其全部或部分来源于基于碳负离子的硫酯缩合和/或基于碳正离子的异戊二烯单元缩合。脂质组学可被看作是代谢组学的子领域，其目的是通过在分子水平上测量和表征广泛的脂质谱(脂质组学谱)来阐明与脂质有关的生物学过程。传统的临床脂质测量对三酰甘油、胆固醇和脂蛋白的总量进行定量。然而，血清脂质谱在分子水平上更加复杂。目前的脂质组学平台可以对多个脂质类别的100余种不同脂质分子进行定量表征，如鞘磷脂、磷脂、固醇酯、酰基甘油、固醇、胆汁酸、脂肪酸、类二十烷酸和类固醇。
现今，肌病主要根据患者的症状进行诊断。升高的肌酸激酶(creatinekinase，CK)可用于检测具有肌肉症状的患者。然而，CK水平可由于其它原因(如运动)而升高，并且其不是他汀类所诱导肌病的可靠生物学标志物。当下，尚没有诊断非症状性肌病的诊断方法或临床检测。并且，在接受他汀类治疗时无法估计患者发生肌病的风险。本发明公开了用于确定他汀类所诱导肌病的风险和早期征兆的方法。
发明概述
本发明公开了用于确定他汀类所诱导肌病的方法，其包括以下步骤
a)提供来自他汀类治疗前或治疗期间之个体的生物样品；
b)从所述生物样品收集脂质组学谱；
c)对所收集的脂质组学谱与参照脂质组学标志物进行比较，其中已通过将促炎性基因表达谱与高剂量他汀类治疗相关的脂质组学谱相结合建立了所述参照脂质组学标志物。
该方法尤其适用于确定他汀类所诱导肌病的风险或早期预兆。该方法还可用于在表现出肌病临床症状的个体中确定他汀类所诱导肌病。
本发明的另一方面是提供用于确定他汀类所诱导肌病的试剂盒。
附图说明
图1表示血清脂质组学数据的偏最小二乘判别分析(partial leastsquares discriminant analysis，PLS/DA)。来自安慰剂(N＝11)、阿托伐他汀(N＝14)(A)和辛伐他汀(N＝12)(B)组治疗8周后的结果，其中分析中包含132种已鉴定脂质作为变量。对于每种分子和每位受试者来说，其8周治疗期后的水平通过减去治疗前所有受试者的中值水平并除以相应的标准偏差来计算。在模型中使用4种潜变量(Q²＝0.46)。标签为患者ID编号。不同组的轮廓线用于指引。潜变量(LV)1和3的分数表明特异性针对他汀类治疗(LV1)的血清脂质变化以及他汀类特异性变化(LV3)。
图2表示针对从图1中通过变量投影重要性(variable importance inthe projection，VIP)分析所选择的辛伐他汀(B)或阿托伐他汀(A)组中最重要脂质的LV3载荷(loading)。只显示了两组中至少之一的VIP值大于2的脂质。
图3表示针对组合的肌肉基因表达和血清脂质数据进行的PLS/DA分析。来自安慰剂(N＝5)、阿托伐他汀(N＝6)(A)和辛伐他汀(N＝6)(B)组的受试者接受介入后的结果。分析中包括来自4条富集途径的总共38种基因和132种脂质作为变量。在多变量分析前对数据进行自动换算。该模型中使用3个潜变量(Q²＝0.50)。标签为患者ID编号。该PLS/DA分数图表明，介入之后在分子谱中观察到所述治疗之间的治疗特异性差异。
发明详述
本发明的目的是提供他汀类所诱导肌病的早期生物学标志物。所述早期生物学标志物可用于在实际肌病任何症状发生前确定由于用他汀类进行胆固醇降低治疗而发生肌病的风险。该生物标志物还可用于他汀类所诱导肌病的早期征兆。当检测出肌病早期征兆时，可以对胆固醇降低药物进行调整。另外，该生物标志物可在肌病临床症状已出现时用于确定他汀类所诱导肌病。本发明人已出乎意料地发现了脂质组学生物标志物可用作他汀类所诱导肌病的生物标志物。
本发明提供了用于确定患者发生他汀类所诱导肌病的风险和早期征兆的方法。该方法基于对所建立的个体脂质谱与参照脂质组学标志物进行比较。通过将基因表达分析数据与血清脂质组学数据相结合来建立所述参照脂质组学标志物。已通过肌肉活检的全基因组微阵列分析检测了与高剂量他汀类治疗相关的基因表达谱。将来自微阵列分析和脂质组学分析的信息进行结合并进行统计学修正以提供可用于他汀类所诱导肌病的脂质组学标志物。
本发明公开了用于确定肌病的方法。该方法用于在任何临床可观察征兆发生前确定肌病的早期征兆。本方法的优势在于可以在任何身体肌病症状发生前对他汀类治疗进行调整或停止。
本发明的另一方面是提供用于在已患临床肌病症状的个体中确定他汀类所诱导肌病的方法。本发明的方法可用作针对已经历肌肉疼痛和其它肌病症状的患者中对肌病的生化诊断方法。该方法可用作其它肌病临床诊断以外的验证性诊断方法。在怀疑患有肌病的患者中通常测量肌酸激酶(CK)水平。该公开的方法可与CK水平测量平行使用。因为CK水平可由于例如运动和身体活动后小的肌肉损伤而升高，所以CK水平不是可靠的肌病生物标志物。本发明提供了比CK水平更可靠的他汀类所诱导肌病的生物标志物。
本发明提供了用于确定他汀类所诱导肌病的方法，其包括以下步骤
a)提供来自他汀类治疗前或治疗期间个体的生物样品；
b)从所述生物样品收集脂质组学谱；
c)对所收集的脂质谱与参照脂质组学标志物进行比较，其中已通过将促炎性基因表达谱与高剂量他汀类治疗相关的脂质组学谱相结合而建立了所述参照脂质组学标志物。
所收集的脂质组学谱与参照脂质组学标志物之间的差异指示着他汀类所诱导肌病或与之相关联。所收集的脂质组学谱与参照脂质组学标志物之间的差异还可用于确定发生他汀类所诱导肌病的易感性或风险。
本发明的方法可用于确定发生由他汀类治疗所致的他汀类所诱导肌病的风险。
另外，本发明的方法可用于确定他汀类所诱导肌病的早期征兆。早期征兆可以在个体中出现肌病实际症状前确定。
此外，本发明的方法可用于在已表现出肌病征兆的个体中确定他汀类所诱导肌病。本方法可以作为临床诊断肌病的生化验证。
所述生物样品可以是全血、血清、血浆样品或组织样品。从患者取血样是常规临床操作的一部分。取血样可以与例如测量患者的胆固醇水平一起进行。可以使用本领域技术人员熟知的技术来制备所收集的血样以及分离血清或血浆。
可以使用各种化学的以及高分辨率的分析技术实施从所述生物样品收集脂质组学谱。合适的分析技术包括但不仅限于质谱和核共振谱(nuclear resonance spectroscopy)。可以使用任何能够分辨单个脂质或脂质类别并提供其结构信息的高分辨率技术来收集生物样品的脂质谱。
本发明的一个实施方案是使用质谱(MS)收集脂质组学谱。MS设备可以与高效分离方法(如HPLC或UPLC(超高效液相色谱))联用。
用于收集脂质谱的分析技术应能够定量或测量单个脂质或脂质类别的确切量或至少相对量。当将所收集脂质谱与参照脂质组学生物标志物进行比较时，使用所收集脂质组学谱中的单个脂质或脂质类别的量。
所述参照脂质组学生物标志物可以建立自接受他汀类治疗的同一个体，或者其可以来自一般人群。如果使用同一个体来创建参照脂质组学标志物，则在他汀类治疗前从该个体收集样品。然后从该个体的该第一脂质谱来创建参照脂质组学标志物。该脂质组学标志物用作基线或起点。可以在他汀类治疗期间收集一系列脂质组学谱。然后，将这些脂质组学谱与在他汀类治疗前创建的参照脂质组学标志物进行比较。
所述参照脂质组学标志物还可创建自一般人群。如果使用一般人群，则将来自人群的若干脂质谱相组合，然后从此组合创建脂质组学标志物。
优选地，所述参照脂质组学标志物为选自表1、更优选表2所示脂质中的一种或多种脂质。
通过如下所述将基因表达数据与脂质组学分析相结合创建所述参照脂质组学标志物。将单一脂质或脂质类别的水平或量与参照脂质组学生物标志物中的单一脂质或脂质类别的水平或量进行比较，以确定他汀类所诱导肌病。

为了了解肌肉中他汀类应答相关的途径，我们在肌肉活检中进行了全基因组微阵列分析。该活检样品取自三组个体。所述组为仅接受安慰剂的个体、接受阿托伐他汀治疗的个体以及接受辛伐他汀治疗的个体。微阵列实验在他汀类治疗后未观察到任何副作用(如肌肉疼痛或肌酸激酶升高)的个体中进行。
表2

首先进行单基因分析以显示肌肉中受他汀类治疗影响的基因。在阿托伐他汀组中仅记录到轻微的变化，因为观察到5种基因的表达在介入治疗期间显著改变。在辛伐他汀组中，基因表达变化显著。基于分层聚类分析(hierarchical cluster analysis)，选择20种基因用于进一步的RT-PCR对照，从而鉴定出他汀类对人骨骼肌影响的基于基因表达的指纹(fingerprint)。
因为在单基因表达中所记录的差异一般来说相当有限，所以我们进行基因集合丰度分析(gene set enrichment analysis，GSEA)以阐明在单基因分析中可能未出现的受影响的代谢途径。在GSEA中，与标准相比，在阿托伐他汀或安慰剂组中似乎没有途径受到显著影响(FDR<0.25)。令人感兴趣地，在辛伐他汀组中，143条途径在高剂量辛伐他汀治疗中上调(FDR<0.25)。由于有大量的受影响途径，我们将我们的系统分析限制在最受影响的途径(FDR<0.10)中。
为了研究高剂量他汀类治疗如何影响血浆脂质谱以及骨骼肌中发现的代谢变化是否反应在血浆脂质组中，我们应用了脂质组学分析。分析了安慰剂、辛伐他汀和阿托伐他汀组的介入之前和之后的受试者样品。在数据处理后，鉴定了总共132种脂质分子并对其进行数据分析。
偏最小二乘判别分析(PLS/DA)表明脂质谱中存在药物特异性变化(图1)。与由所述两种药物通用的他汀类治疗所致变化相关的第一潜变量(LV1)的差异预期与他汀类介入组中甘油三酯和胆固醇酯的降低有关。辛伐他汀和阿托伐他汀脂质谱之间的差异可见于第三潜变量(LV3)中。在变量投影重要性分析后，鉴定出每个介入组最重要的脂质种类。图2中显示了在辛伐他汀和阿托伐他汀组中针对最重要脂质在阿托伐他汀-辛伐他汀差异(LV3)方向上的载荷列表。明显地，这两种他汀类之间最主要的血浆脂质谱差异似乎是脂质类别特异性的，其中在辛伐他汀组中多种磷脂酰乙醇胺和长链甘油三酯上调，而醚磷脂酰胆碱和胆固醇酯的下调。
基因表达分析显示出在高剂量辛伐他汀介入组中骨骼肌中与炎症和线粒体损伤有关的途径上调。我们研究了任何这些变化是否与血清脂质组中观察到的差异有关。
我们基于GSEA分析选择了一部分基因。选择了来自PLC、tubby、类二十烷酸生物合成以及sodd途径的基因，其基于FDR q-值排在第2至第5位。包括总共38种基因表达谱及132种脂质。针对肌肉基因表达与血浆脂质谱数据组合的PLS/DA分析表明，三个治疗组之间存在明显差异(图3)。所述载荷表明，治疗后的辛伐他汀组主要与类二十烷酸合成途径的多个基因的变化以及多种磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂分子种类的变化相关联。由于偏最小二乘分析(partial least squares analysis)使所测变量的方差矩阵(例如基因表达与脂质谱数据的组合)乘积和所测数据与目的性质的相关性最大化(例如治疗组)，因此这些结果清楚地显示在辛伐他汀组中上调基因(途径)和脂质组学标志物之间存在高度相关性。
本发明的另一方面提供了用于实现确定他汀类所诱导肌病之方法的试剂盒。该试剂盒包含参照脂质以形成脂质组学参照生物标志物和必要的试剂。
来自脂质组学分析的脂质根据“脂质代谢和途径策略(Lipid Maps)”(http://www.lipidmaps.org)来命名。例如，将含有16:0脂肪酸链的溶血磷脂酰胆碱命名为单酰甘油磷脂酰胆碱GPCho(16:0/0:0)。在脂肪酸组成未确定的情形中，对总的碳数和双键数作标记。例如，磷脂酰胆碱类GPCho(16:0/20:4)表示为GPCho(36:4)。然而，GPCho(36:4)可代表其它分子种类如GPCho(20:4/16:0)或GPCho(18:2/18:2)。这样的同质异构体(mass isomer)可通过层析进行分离。
以下实施例对本发明进行举例说明，但不意在限制本发明的范围。
实施例
进行基因表达和脂质组学分析的患者
来自早前针对高剂量他汀类治疗对骨骼肌代谢影响的研究(8)中37位受试者的血浆样品用于血浆脂质组分析。受试者的年龄在31～69岁之间，他们的平均血清总胆固醇浓度为5.9±0.9mmol/L，并且血清甘油三酯低于4.5mmol/L。选择来自18位年龄匹配男性(用阿托伐他汀(n＝6)、辛伐他汀(n＝6)或安慰剂(n＝6)进行治疗)的肌肉样本用于全基因组广泛表达分析(whole genome wide expressionanalysis)。
进行研究的患者以前从未接受过他汀类治疗。他们被告知在研究期间遵循其日常饮食习惯。在初次筛选中排除掉患有家族性高胆固醇血症的患者和血清总胆固醇>7.0mmol/L的患者。另一些排除标准包括：使用一并调节脂质的药物或抗氧化维生素、肾或肝功能不良以及使用已知影响阿托伐他汀或辛伐他汀代谢的药物。该研究方案被坦佩雷大学医院伦理委员会所接受，并获得所有参与人的书面同意。
实施例1.基因表达分析
基因表达
根据所给的说明书，使用人-6表达微珠芯片分析对46,000种已知基因、候选基因和剪接变体(Illumina，San Diego，CA，USA)进行微阵列实验。使用Ultra-Turrax(IKA Turrax T8/S8N-5G，IKA-Werke，Staufen，Germany)对活检样品进行匀浆。使用TRIzol(#15596-018，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)提取总RNA。根据所给的说明书，利用Qiagen试剂盒(#74106和#79254，Qiagen GmbH，Hilden，Germany)进行DNA酶处理和第二次RNA纯化。
根据说明书，使用Ambion的Illumina RNA扩增试剂盒(货号I1755，Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)将200ng等分试样的来自每个样品的总RNA扩增为cDNA。过夜(14h)进行从cDNA到cRNA的体外转录(IVT)反应，其包含用于标记cRNA产物的生物素-11-dUTP(PerkinElmer，货号PC 3435-0402-生物素-11-dUTP，>95％，NEL539001EA，PerkinElmer Life And Analytical Sciences，Inc.，Boston，MA，USA)。在扩增之前和之后，用Nanodrop ND-1000分光光度仪(Nanodrop Technologies，Wilmington，DE，USA)检测RNA/cRNA的浓度，并利用BioRad的Experion自动电泳系统和RNA StdSens分析试剂盒(BioRad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)来控制RNA/cRNA质量。
在用于BeadStation的Illumina全基因组基因表达步骤(文件#11176837Rev.F，Illumina Inc.)后，将1500ng的每种样品cRNA与Illumina的Sentrix小鼠-6表达微珠芯片阵列(Illumina，Inc.，SanDiego，CA，USA)在55℃杂交过夜(18h)。用1μg/ml的Cyanine3-链霉抗生物素蛋白(Amersham Biosciences#146065)检测经杂交的生物素化cRNA。用Illumina微珠阵列读数仪扫描微珠芯片。
用Inforsense Knowledge Discovery Environment(Inforsense，London，UK)使用非线性三次样条归一化对获自Illumina平台的原始强度数据进行归一化。Inforsense KDE平台还用于进行单基因分析包括倍数变化计算和过滤探针。
根据所使用的选择标准(1.5倍变化和p值<0.05)，在安慰剂组中一种基因的表达显著变化。在阿托伐他汀组中仅观察到轻微的变化，因为观察到5种基因的表达在介入期间显著改变。然而，在辛伐他汀组中，111种基因的表达变化显著。26种基因的表达下调，85种基因的表达上调。
实施例2.RT-PCR分析
基于分层聚类分析(如实施例1中所述)，选择20种基因用于进一步的RT-PCR对照，从而鉴定出他汀类对人骨骼肌影响的基于基因表达的指纹。
通过实时定量TaqMan PCR验证在辛伐他汀组中记录的微阵列表达结果(n＝5，其中一例没有足够的肌肉RNA用于PCR)。使用之前纯化的cRNA作为cDNA合成的原料。将1000ng-18μl等分试样的cRNA与1μl Promega随机引物(C1181，Promega U.S.，Madison，WI，USA)混合并在+70℃孵育10分钟。加入以下试剂使总反应体积为25μl：1μl的10μM dNTP混合物(F09892，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)、1μl的Promega M-MLV逆转录酶200U/μl(M3682)和4μl的M-MLV逆转录(RT)5×反应缓冲液。最后，以如下顺序进行孵育：逆转录10分钟，45℃50分钟以及70℃10分钟。
使用10μl体积进行PCR反应，其由2μl等分试样的1:10稀释的cDNA样品和Abgene ABsolute 2×QPCR ROX混合物(AB-1139，Abgene，Epsom，UK)组成。引物浓度为300nM，通用探针文库(Exiqon，，Denmark)的探针浓度为100nM，通常的长探针浓度为200nM。最后在rtPCR系统(ABI Prism 7700序列检测系统，ApliedBiosystems)中进行PCR反应，其包括以下流程：95℃15分钟，40个循环的95℃15秒，以及60℃ 1分钟。
RT-PCR分析表明，在辛伐他汀组中似乎有5种基因是他汀类早期肌病前效应的最灵敏候选标志物，所述基因分别为：ALOX5AP(+3.6倍，p＝0.041)、CCL5(+11.9倍，p＝0.011)、COL3A1(+27.1倍，p＝0.026)、MYL5(+8.0倍，p＝0.021)、MYBPH(+49.0倍，p＝0.027)。
实施例3.血浆的脂质组学分析
将包含11个脂质类别的一等分试样内标混合物(10ml)和0.05M氯化钠(10ml)加至血浆样品(10ml)，用氯仿/甲醇(2:1，100ml)提取脂质。涡旋混匀(2分钟)、静置(1小时)和离心(10000RPM，3分钟)后，分离出下层并将含有3种经标记标准脂质的标准混合物(10ml)加至提取物(内标和外标均列于附录中)。随机确定进行LC/MS分析的样品顺序。
使用Waters Q-Tof Premier质谱仪联合Acquity超高效液相色谱(LC)^TM(UPLC)来分析脂质提取物。柱保持在50℃，其是包含1.7mm颗粒的Acquity UPLCTM BEH C18 10×50mm。二元溶剂系统(binary solvent system)包括：A.水(1％1M NH₄Ac、0.1％HCOOH)；B.LC/MS级(Rathburn)乙腈/异丙醇(5:2，1％ 1M NH₄Ac、0.1％ HCOOH)。梯度从65％A/35％B开始，在6分钟内到达100％B并再保持7分钟。包括5分钟重新平衡步骤的总运行时间为18分钟。流速为0.200ml/分钟，注入量为0.75ml。样品组织器(sample organizer)的温度设置为10℃。
在Waters Q-Tof Premier质谱仪上使用ESI+模式进行脂质谱测定。使用0.2秒的扫描持续时间收集质量范围为m/z300～1200的数据。原料温度设为120℃，并于250℃使用氮气作为脱溶剂气体(desolvationgas)(800L/h)。取样锥(sampling cone)和毛细管的电压分别为39V和3.2kV。使用利血平(50mg/L)作为锁喷雾(lock spray)参照化合物(5ml/分钟；10秒扫描频率)。
使用MZmine软件(版本0.60)来处理数据(14)。使用内部光谱文库(internal spectrallibrary)来鉴定脂质。使用如下的多个内部标准进行归一化。使用1-十七酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱对除去胆固醇酯以外的所有单酰基脂质(如单酰甘油和溶血磷脂)进行归一化，用1，2-双十七酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱对除去磷脂酰乙醇胺和乙醇胺缩醛磷脂之外的所有二酰基脂质进行归一化，用1，2-双十七酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺对磷脂酰乙醇胺和乙醇胺缩醛磷脂进行归一化，用十七烷酸甘油三酯对甘油三酯和胆固醇酯进行归一化。
使用串联质谱法鉴定所选的脂质分子种类。使用ESI+模式运行MS/MS，碰撞能斜坡(ramp)从15至30V，质量范围从m/z150起始。其它条件如上所示。
在脂质组学分析和数据处理后，鉴定了总共132种脂质分子并对其进行数据分析。
偏最小二乘判别分析(PLS/DA)(17)表明脂质谱中存在药物特异性变化(图1)。与由所述两种药物通用的他汀类治疗所致变化相关的沿第一潜变量(LV1)的差化预期与他汀类介入组中甘油三酯和胆固醇酯的降低有关(补充材料)。辛伐他汀和阿托伐他汀脂质谱之间的差异可见于第三潜变量(LV3)中。在变量投影重要性(VIP)分析后，鉴定出每个介入组最重要的脂质种类。图2中显示了在辛伐他汀和阿托伐他汀组中对最重要脂质在阿托伐他汀-辛伐他汀差异(LV3)方向上的载荷列表。明显地，这两种他汀类之间最主要的血浆脂质谱差异似乎是脂质类别特异性的，其中在辛伐他汀组中多种磷脂酰乙醇胺和长链甘油三酯上调，而胆碱缩醛磷脂和胆固醇酯下调。