风轮菜中黄酮类化合物的分离方法及黄酮组合物.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510291110.2 (22)申请日 2015.05.29 C07H 17/07(2006.01) C07H 1/08(2006.01) C07D 311/30(2006.01) C07D 311/32(2006.01) C07D 311/40(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/14(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路 151 号中国医学科。

2、学院药用植物研究所 申请人 安徽科创药物研究所有限责任公司 (72)发明人 许旭东 余世春 钟明亮 朱寅荻 马国需 吴海峰 张小坡 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 吴贵明 张永明 (54) 发明名称 风轮菜中黄酮类化合物的分离方法及黄酮组 合物 (57) 摘要 本发明提供了一种风轮菜中黄酮类化合物的 分离方法及黄酮组合物。该分离方法包括 ： 对风 轮菜地上部分总黄酮类物质进行硅胶柱色谱分离 得到第 1-320 流分 ； 对第 133-176 流分进行硅胶 柱色谱分离并经薄层检测合并相同组分得到 13 个流分， 对第231-260流分及第295-31。

3、0流分进行 MCI 柱色谱分离并经薄层检测合并相同组分分别 得到 7 个和 8 个流分， 对第 12-48 流分及第 49-55 流分进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析分别得到 3 个 和 2 个流分 ； 然后依次对上述各组得到的流分进 行 C18 反相高效液相色谱分离得到 33 种化合物。 该方法从风轮菜分离到的黄酮类成分更全面， 为 其在治疗心血管疾病方面的药物用途奠定了物质 基础和理论依据。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 106279318 A 2017.01.04 CN 106279318 A 1。

4、/2 页 2 1.一种风轮菜中黄酮类化合物的分离方法， 其特征在于， 所述分离方法包括以下步 骤 ： 从风轮菜的干燥地上部分提取总黄酮类物质 ； 对所述总黄酮类物质采用硅胶柱色谱进行分离， 在所述分离过程中， 以体积比为 100 ： 5 100 ： 25 的氯仿和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱， 依次得到第 1 流分至第 320 流分 ； 对所述第 1 流分至第 320 流分中的第 133-176 流分进行硅胶柱色谱分离， 以体积比依 次为 9:1、 4:1、 2:1、 1:1 和 1:2 的氯仿和丙酮为洗脱剂进行洗脱， 并经薄层检测合并相同组 分， 得到 A1 至 A13 共 13 个流分 ； 然。

5、后以体积比为 60:40 的甲醇和水作为洗脱剂， 依次对所 述13个流分进行C18反相高效液相色谱分离， 分别得到化合物2、 3、 4、 5、 8、 9、 10、 14、 16、 20、 26、 32 和 35 ； 对所述第 1 流分至第 320 流分中的第 231-260 流分进行 MCI 柱色谱分离， 以所述体积 比为 60:40 的甲醇和水为洗脱剂进行洗脱， 并经薄层检测合并相同组分， 得到 B1 至 B7 共 7 个流分 ； 然后依次对所述7个流分进行C18反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂 进行洗脱， 分别得到化合物 6、 21、 22、 28、 29、 30 和 33 ；。

6、 对所述第1流分至第320流分中的第295-310进行MCI柱色谱分离， 以体积比为60:40 的甲醇 - 水为洗脱剂进行洗脱， 并经薄层检测合并相同组分， 得到 C1 至 C8 共 8 个流分 ； 依 次对所述8个流分进行C18反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂进行洗脱， 分别 得到化合物 11、 12、 15、 17、 23、 24、 27 和 34 ； 对所述第 1 流分至第 320 流分中的第 12-48 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖 凝胶柱层析， 并以体积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后经薄层追踪检测合并 相同组分， 得到 D1、。

7、 D2 和 D3 共 3 个流分 ； 对所述 D2 流分进行 C18 反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂进行洗脱， 得到化合物 13 和 19 ； 对所述 D3 流分进行反相高效液相 色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂进行洗脱， 得到化合物 25 ； 对所述第 1 流分至第 320 流分中的第 49-55 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖 凝胶柱层析， 以体积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后以甲醇和水作为洗脱剂 进行 C18 反相高效液相色谱分离， 得到化合物 1 和 18。 2.根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于， 对所述总黄酮类物。

8、质采用硅胶柱色 谱进行分离的过程中， 利用体积比分别为100 ： 5、 100 ： 10、 100 ： 15、 100 ： 20和100 ： 25的所述 氯仿和甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱， 依次得到第 1 流分至第 320 流分。 3.根据权利要求 1 或 2 所述的分离方法， 其特征在于， 所述分离法方法还包括 ： 对所述第 1 流分至第 320 流分中的第 49-55 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖 凝胶柱层析， 以体积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后以甲醇和水作为洗脱剂 进行 C18 反相高效液相色谱分离， 得到化合物 1 和 18。 4.根据权。

9、利要求 3 所述的分离方法， 其特征在于， 所述分离方法进一步包括 ； 对所述第 1 流分至第 320 流分中的第 79-86 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖 凝胶柱层析， 以体积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后以甲醇和水作为洗脱剂 进行 C18 反相高效液相色谱分离， 得到化合物 7 和 31。 5.根据权利要求 1 所述的分离方法， 其特征在于， 所述从风轮菜的干燥地上部分提取 总黄酮类物质的步骤包括 ： 权 利 要 求 书 CN 106279318 A 2 2/2 页 3 取风轮菜的干燥地上部分， 用水提取得到水提液 ； 将所述水提液进行压缩、 。

10、干燥， 得到水提物 ； 将所述水提物进行大孔树脂层析， 以乙醇和水为洗脱剂进行梯度洗脱， 得到洗脱物 ； 以 及 将所述洗脱物进行碱提酸沉法富集， 然后精制得到所述总黄酮类物质。 6.根据权利要求 5 所述的分离方法， 其特征在于， 所述大孔树脂层析过程中采用 D101 大孔树脂层析柱进行层析 ； 所述乙醇和水形成的所述洗脱剂中乙醇的体积浓度分别为 20、 50、 70和 95； 优选得到的所述洗脱物为乙醇体积浓度分别为 20、 50和 70 的洗脱物。 7.一种黄酮组合物， 其特征在于， 所述黄酮组合物包括黄酮类结构的化合物、 二 氢黄酮类结构的化合物、 黄酮醇类结构的化合物以及异黄酮类结构。

11、的化合物 ； 其中， 所 述黄酮类结构的化合物至少包括以下任意一种 ： 洋芹素 -7-O- 芸香糖苷、 木犀草苷、 木 犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸正丁醇酯苷、 木犀草 素 -7-O- 芸香糖苷、 木犀草素 -7-O- 新橙皮糖苷、 金合欢素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷和金合 欢素 -7-O-D- 芸香糖苷， 所述黄酮组合物是从风轮菜中分离得到， 且所述黄酮类结构的 化合物通过权利要求 1 至 6 中任一项所述的分离方法分离得到。 8.根据权利要求 7 所述的黄酮组合物， 其特征在于， 所述黄酮组合物中的所述二氢 黄酮类结构的化合物至少包括以下任意一。

12、种 ： 柚皮素 -7-O- 新橙皮糖苷、 高圣草素、 橙皮 素 -7-O- 葡萄糖苷、 圣草次苷、 新北美圣草苷和 5， 7， 3， 5 - 四羟基二氢黄酮 -7-O- 新橙 皮糖苷 ； 所述二氢黄酮类结构的化合物通过权利要求 1 至 6 中任一项所述的分离方法分离 得到。 9.根据权利要求 8 所述的黄酮组合物， 其特征在于， 所述黄酮组合物中的所述黄酮醇 类结构的化合物至少包括以下任意一种 ： 山奈酚 -3-O- 鼠李糖苷和山奈酚 3-O- 吡喃鼠李 糖 -7-O- 葡萄糖苷 ； 所述黄酮醇类结构的化合物通过权利要求 1 至 6 中任一项所述的分离 方法分离得到。 10.根据权利要求 7-。

13、9 中任一项所述的黄酮组合物， 其特征在于， 所述黄酮组合物 包括以下 35 种化合物 ： 洋芹素、 洋芹素 -7-O- 葡萄糖苷、 洋芹素 -7-O- 葡糖醛酸苷、 洋 芹素 -7-O- 葡糖醛酸甲酯苷、 羊红膻酯、 洋芹素 -7-O- 芸香糖苷、 木犀草素、 木犀草苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸正丁醇酯苷、 木犀草 素 -7-O- 芸香糖苷、 木犀草素 -7-O- 新橙皮糖苷、 金合欢素、 金合欢素 -7-O-D- 葡糖 醛酸苷、 金合欢素 -7-O-D- 芸香糖苷、 日本椴苷、 蒙花苷、 柚皮素、 异樱花素、 江户樱花 苷、 柚皮素 -7。

14、-O- 芸香糖苷、 柚皮素 -7-O- 新橙皮糖苷、 香蜂草苷、 枳属苷、 高圣草素、 橙 皮素 -7-O- 葡萄糖苷、 橙皮苷、 圣草次苷、 新北美圣草苷、 5， 7， 3， 5 - 四羟基二氢黄 酮 -7-O- 新橙皮糖苷、 槲皮素、 山奈酚 -3-O- 鼠李糖苷、 山奈酚 3-O- 吡喃鼠李糖 -7-O- 葡萄 糖苷、 芦丁和染料木苷 ； 所述 35 种化合物通过权利要求 1 至 6 中任一项所述的分离方法分 离得到。 权 利 要 求 书 CN 106279318 A 3 1/7 页 4 风轮菜中黄酮类化合物的分离方法及黄酮组合物 技术领域 0001 本发明涉及中药组合物领域， 具体而言。

15、， 涉及一种风轮菜中黄酮类化合物的分离 方法及黄酮组合物。 背景技术 0002 风轮菜 (Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze) 为唇形科风轮菜属植物。在 我国主要分布于山东、 浙江、 江苏、 安徽、 福建、 台湾、 湖南、 湖北、 广东、 广西及云南东北部等 地。风轮菜性凉， 味苦辛， 有疏风清热， 解毒消肿之功。用于治疗感冒、 中暑、 过敏性皮炎、 肠 炎、 痢疾、 血尿等症。首载于 救荒本草 (1406) 草部， 在我国有悠久的民间药用历史。现已 被 中华人民共和国药典 收载为断血流药用， 主要用于治疗各种出血症。 0003 目前有研究表明， 风轮菜总。

16、黄酮具有显著的活血化瘀活性， 而风轮菜中的皂苷类 成分又具有止血的功效， 因此， 风轮菜具有止血加活血的双向作用， 即在止血的同时又可以 祛除已瘀之血， 达到止血而不留淤的效果。所以风轮菜总黄酮在活血化瘀， 治疗和 / 或预防 心血管疾病方面具有独特的优势， 有着良好的研究开发前景。 0004 然而， 中医所记载的总黄酮并没有明确的化合物， 且现有技术在对风轮菜中的总 黄酮类物质进行提取分离时， 不同研究者分离得到的黄酮类物质的种类都不尽相同。 因而， 到目前为止， 研究人员仍然不清楚风轮菜中具有医药活性的总黄酮类物质具体有哪些。 0005 因此， 仍需要对现有技术进行改进， 以提供一种成分相。

17、对齐全的黄酮组合物， 为从 风轮菜的天然产物中寻找具有良好疗效的治疗和 / 或预防心血管疾病的药物提供物质基 础和理论依据。 发明内容 0006 本发明的主要目的在于提供一种风轮菜中黄酮类化合物的分离方法及黄酮组合 物， 为从风轮菜的天然产物中寻找具有良好疗效的治疗和 / 或预防心血管疾病的药物提供 物质基础和理论依据。 0007 为了实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种风轮菜中黄酮类化合物 的分离方法， 该分离方法包括以下步骤 ： 从风轮菜的干燥地上部分提取总黄酮类物质 ； 对 总黄酮类物质采用硅胶柱色谱进行分离， 在分离过程中， 以体积比为 100 ： 5 100 ： 25 。

18、的氯 仿和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱， 依次得到第 1 流分至第 320 流分 ； 对第 1 流分至第 320 流 分中的第 133-176 流分进行硅胶柱色谱分离， 以体积比依次为 9:1、 4:1、 2:1、 1:1 和 1:2 的 氯仿和丙酮为洗脱剂进行洗脱， 并经薄层检测合并相同组分， 得到 A1 至 A13 共 13 个流分 ； 然后以体积比为 60:40 的甲醇和水作为洗脱剂， 依次对 13 个流分进行 C18 反相高效液相 色谱分离， 分别得到化合物 2、 3、 4、 5、 8、 9、 10、 14、 16、 20、 26、 32 和 35 ； 对第 1 流分至第 320 流分中的。

19、第 231-260 流分进行 MCI 柱色谱分离， 以体积比为 60:40 的甲醇和水为洗脱剂进 行洗脱， 并经薄层检测合并相同组分， 得到 B1 至 B7 共 7 个流分 ； 然后依次对 7 个流分进行 C18 反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂进行洗脱， 分别得到化合物 6、 21、 22、 说 明 书 CN 106279318 A 4 2/7 页 5 28、 29、 30 和 33 ； 对第 1 流分至第 320 流分中的第 295-310 进行 MCI 柱色谱分离， 以体积比 为 60:40 的甲醇 - 水为洗脱剂进行洗脱， 并经薄层检测合并相同组分， 得到 C1 至 C8 。

20、共 8 个 流分 ； 依次对 8 个流分进行 C18 反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂进行洗脱， 分别得到化合物11、 12、 15、 17、 23、 24、 27和34 ； 对第1流分至第320流分中的第12-48流分 进行Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 并以体积比为4 ： 6氯仿和甲醇为洗脱剂进 行洗脱， 然后经薄层追踪检测合并相同组分， 得到 D1、 D2 和 D3 共 3 个流分 ； 对 D2 流分进行 C18 反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作为洗脱剂进行洗脱， 得到化合物 13 和 19 ； 对 D3 流分进行反相高效液相色谱分离， 以甲醇和水作。

21、为洗脱剂进行洗脱， 得到化合物 25 ； 对第 1 流分至第 320 流分中的第 49-55 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 以体 积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后以甲醇和水作为洗脱剂进行 C18 反相高效 液相色谱分离， 得到化合物 1 和 18。 0008 进一步地， 对总黄酮类物质采用硅胶柱色谱进行分离的过程中， 利用体积比分别 为100 ： 5、 100 ： 10、 100 ： 15、 100 ： 20和100 ： 25的氯仿和甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱， 依次 得到第 1 流分至第 320 流分。 0009 进一步地， 分离法方。

22、法还包括 ： 对第 1 流分至第 320 流分中的第 49-55 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 以体积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗 脱， 然后以甲醇和水作为洗脱剂进行 C18 反相高效液相色谱分离， 得到化合物 1 和 18。 0010 进一步地， 分离法方法进一步包括 ： 对第1流分至第320流分中的第79-86流分进 行Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 以体积比为4 ： 6氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗 脱， 然后以甲醇和水作为洗脱剂进行 C18 反相高效液相色谱分离， 得到化合物 7 和 31。 0011 进一步地， 从风轮。

23、菜的干燥地上部分提取总黄酮类物质的步骤包括 ： 取风轮菜的 干燥地上部分， 用水提取得到水提液 ； 将水提液进行压缩、 干燥， 得到水提物 ； 将水提物进 行大孔树脂层析， 以乙醇和水为洗脱剂进行梯度洗脱， 得到洗脱物 ； 以及将洗脱物进行碱提 酸沉法富集， 然后精制得到总黄酮类物质。 0012 进一步地， 大孔树脂层析过程中采用 D101 大孔树脂层析柱进行层析 ； 乙醇和水形 成的洗脱剂中乙醇的体积浓度分别为20、 50、 70和95； 优选得到的洗脱物为乙醇体 积浓度分别为 20、 50和 70的洗脱物。 0013 为了实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种黄酮组合物， 该黄。

24、酮组合 物包括黄酮类结构的化合物、 二氢黄酮类结构的化合物、 黄酮醇类结构的化合物以及异黄 酮类结构的化合物 ； 其中， 黄酮类结构的化合物至少包括以下任意一种 ： 洋芹素 -7-O- 芸香 糖苷、 木犀草苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸正丁醇 酯苷、 木犀草素 -7-O- 芸香糖苷、 木犀草素 -7-O- 新橙皮糖苷、 金合欢素 -7-O-D- 葡糖醛 酸苷和金合欢素 -7-O-D- 芸香糖苷， 黄酮组合物是从风轮菜中分离得到， 且黄酮类结构 的化合物通过上述任一种分离方法分离得到。 0014 进一步地， 黄酮组合物中的二氢黄酮类结构的化合物至。

25、少包括以下任意一种 ： 柚 皮素-7-O-新橙皮糖苷、 高圣草素、 橙皮素-7-O-葡萄糖苷、 圣草次苷、 新北美圣草苷和5， 7， 3， 5-四羟基二氢黄酮-7-O-新橙皮糖苷 ； 二氢黄酮类结构的化合物通过上述任一种分 离方法分离得到。 0015 进一步地， 黄酮组合物中的黄酮醇类结构的化合物至少包括以下任意一种 ： 山奈 说 明 书 CN 106279318 A 5 3/7 页 6 酚-3-O-鼠李糖苷和山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷 ； 黄酮醇类结构的化合物通过 上述任一种分离方法分离得到。 0016 进一步地， 黄酮组合物包括以下 35 种化合物 ： 洋芹素、 洋芹素 -。

26、7-O- 葡萄糖苷、 洋芹素 -7-O- 葡糖醛酸苷、 洋芹素 -7-O- 葡糖醛酸甲酯苷、 羊红膻酯、 洋芹素 -7-O- 芸香糖 苷、 木犀草素、 木犀草苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖醛 酸正丁醇酯苷、 木犀草素 -7-O- 芸香糖苷、 木犀草素 -7-O- 新橙皮糖苷、 金合欢素、 金合欢 素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷、 金合欢素 -7-O-D- 芸香糖苷、 日本椴苷、 蒙花苷、 柚皮素、 异 樱花素、 江户樱花苷、 柚皮素 -7-O- 芸香糖苷、 柚皮素 -7-O- 新橙皮糖苷、 香蜂草苷、 枳属 苷、 高圣草素、 橙皮素 -7-O- 葡。

27、萄糖苷、 橙皮苷、 圣草次苷、 新北美圣草苷、 5， 7， 3， 5 - 四 羟基二氢黄酮 -7-O- 新橙皮糖苷、 槲皮素、 山奈酚 -3-O- 鼠李糖苷、 山奈酚 3-O- 吡喃鼠李 糖 -7-O- 葡萄糖苷、 芦丁和染料木苷 ； 35 种化合物通过上述任一种分离方法分离得到。 0017 应用本发明的技术方案， 通过综合应用各种先进的色谱技术， 实现对风轮菜中黄 酮类化合物的有效分离。通过利用硅胶色谱载样量大的特点， 对风轮菜中的总黄酮类物质 进行初步分离 ； 利用凝胶色谱填料、 MCI 色谱填料和反相色谱填料无死吸附的特点， 对总黄 酮类物质进行进一步分离， 利用高效液相色谱高分离度的特。

28、点， 对性质相近的化合物进行 分离， 得到目前为止种类最齐全的黄酮类化合物成分。由于风轮菜中的总黄酮类物质对心 肌细胞的损伤具有保护作用， 本发明对风轮菜中黄酮组合物的成分进行了更全面的分离， 得到了新的黄酮类成分， 为黄酮组合物在治疗心血管疾病的药物中的应用奠定了物质基 础， 也为风轮菜黄酮组合物在制药中各有效活性成分含量标准的制定提供了理论依据。 附图说明 0018 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解， 本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明， 并不构成对本发明的不当限定。在附图中 ： 0019 图1示出了根据本发明一种优选的实施例中黄酮组合物中35种化合物的。

29、结构 ； 以 及 0020 图 2 示出了本发明的黄酮组合物对缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤保护作用的检 测结果图。 具体实施方式 0021 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 0022 在本发明中， 黄酮类化合物是指具有黄酮类结构、 二氢黄酮类结构、 黄酮醇类结构 或者异黄酮类结构的化合物。 0023 如背景技术部分所提到的， 现有技术中并不清楚风轮菜中所含的黄酮类物质的具 体成分， 也不清楚其中真正起到活血化瘀作用的有效成分 ； 因而在开发治疗和 / 或预防心 血管疾病方面的药物时也无法确定各有效成分。

30、的含量。 0024 针对上述问题， 本发明在对现代分离技术和结构测定手段进行改进的基础上， 对 唇形科风轮菜属植物风轮菜活血化瘀活性部位风轮菜总黄酮进行了化学成分的分离 和研究， 并从中分离得到 35 种黄酮类成分， 如图 1 所示， 这 35 种黄酮类成分分别为 ： 洋芹 说 明 书 CN 106279318 A 6 4/7 页 7 素 1， 洋芹素 -7-O- 葡萄糖苷 2， 洋芹素 -7-O- 葡糖醛酸苷 3， 洋芹素 -7-O- 葡糖醛酸甲酯苷 4， 羊红膻酯 5， 洋芹素 -7-O- 芸香糖苷 6， 木犀草素 7， 木犀草苷 8， 木犀草素 -7-O-D- 葡 糖醛酸苷 9， 木犀草。

31、素 -7-O-D- 葡糖醛酸正丁醇酯苷 10， 木犀草素 -7-O- 芸香糖苷 11， 木犀草素 -7-O- 新橙皮糖苷 12， 金合欢素 13， 金合欢素 -7-O-D- 葡糖醛酸苷 14， 金合 欢素 -7-O-D- 芸香糖苷 15， 日本椴苷 16， 蒙花苷 17， 柚皮素 18， 异樱花素 19， 江户樱花 苷 20， 柚皮素 -7-O- 芸香糖苷 21， 柚皮素 -7-O- 新橙皮糖苷 22， 香蜂草苷 23， 枳属苷 24， 高 圣草素 25， 橙皮素 -7-O- 葡萄糖苷 26， 橙皮苷 27， 圣草次苷 28， 新北美圣草苷 29， 5， 7， 3， 5 - 四羟基二氢黄酮 -。

32、7-O- 新橙皮糖苷 30， 槲皮素 31， 山奈酚 -3-O- 鼠李糖苷 32， 山奈酚 3-O- 吡喃鼠李糖 -7-O- 葡萄糖苷 33， 芦丁 34， 染料木苷 35。 0025 基于上述研究结果， 在本发明一种典型的实施方式中， 提供了一种从风轮菜中黄 酮类化合物的分离方法。上述分离方法包含以下步骤 ： 0026 取风轮菜的干燥地上部分， 净选、 切段， 用水进行提取。提取液经浓缩干燥后得 的提取物， 经 D101 大孔树脂层析， 以乙醇体积浓度分别为 20、 50、 70以及 95的乙 醇-水为洗脱剂， 得到乙醇体积浓度分别为20、 50和70的洗脱物， 各洗脱物经碱提酸 沉法富集，。

33、 精制后得到风轮菜总黄酮类物质 ； 0027 风轮菜总黄酮类物质利用硅胶柱色谱进行粗分离， 以体积比分别为 100 ： 5， 100 ： 10， 100 ： 15， 100 ： 20， 100 ： 25 的氯仿 - 甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱， 依次得到第 1 流分至 320 个流分共 320 个流分 ； 其中体积比为 100 ： 5 的氯仿 - 甲醇洗脱剂洗脱得到第 1-90 流 分 ； 体积比为 100 ： 10 的氯仿 - 甲醇洗脱剂洗脱得到第 91-190 流分 ； 体积比为 100 ： 15 的氯 仿-甲醇洗脱剂洗脱得到第191-260流分 ； 体积比为100 ： 20的氯仿-甲醇洗脱。

34、剂洗脱得到 第 261-310 流分 ； 体积比为 100 ： 25 的氯仿 - 甲醇洗脱剂洗脱得到第 311-320 流分 ； 0028 对第 12-48 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 以体积比为 4:6 的氯仿 - 甲醇为洗脱剂进行洗脱， 薄层检测合并相同组分， 得到 D1、 D2 和 D3 共 3 个流分。 对 D2 流分进行 C18 反相高效液相色谱分离， 以体积比为 60:40 的甲醇和水作为洗脱剂进行 洗脱， 得到化合物 13 和 19 ； 对 D3 流分进行反相高效液相色谱分离， 以体积比为 60:40 甲醇 和水作为洗脱剂进行洗脱， 得到化合。

35、物 25 ； 0029 对第 49-55 流分进行 Sephadex LH-20 羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱， 以体积比为 4 ： 6 氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后以体积比为 60:40 甲醇和水作为洗脱剂进行 C18 反相 高效液相色谱分离， 得到化合物 1 和 18 ； 0030 按照上述Sephadex LH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱和C-18反相高效液相色谱分 离的条件， 对第 79-86 流分进行分离， 得到化合物 7 和 31 ； 0031 对第133-176流分进行硅胶柱色谱分离， 以体积比分别为9:1、 4:1、 2:1、 1:1和1:2 的氯仿和丙酮为洗脱剂进行洗脱， 然。

36、后经薄层检测合并相同组分， 得到 A1 至 A13 共 13 个流 分 ； 然后以体积比为60:40的甲醇和水作为洗脱剂， 分别对所得13个流分进行C-18反相高 效液相色谱分离， 依次得到化合物 2、 3、 4、 5、 8、 9、 10、 14、 16、 20、 26、 32 和 35 ； 0032 对第 231-260 流分进行 MCI 柱色谱分离， 以体积比为 60:40 的甲醇 - 水系统洗脱， 对洗脱产物进行薄层检测合并相同组分， 得到B1至B7共7个流分 ； 然后对所得7个流分， 按 照上述 C-18 反相高效液相色谱分离条件进行分离， 得到化合物 6、 21、 22、 28、 2。

37、9、 30 和 33 ； 0033 对第 295-310 流分进行 MCI 柱色谱分离， 以体积比为 60:40 的甲醇 - 水系统洗脱， 说 明 书 CN 106279318 A 7 5/7 页 8 并对洗脱产物进行薄层检测合并相同组分， 得到 C1 至 C8 共 8 个流分 ； 然后对所得 8 个流 分， 按照上述 C-18 反相高效液相色谱分离条件依次对上述 8 个流分进行分离， 以甲醇和水 作为洗脱剂进行洗脱， 分别得到化合物 11、 12、 15、 17、 23、 24、 27 和 34。 0034 本发明的上述分离方法， 可以对其中的一种或多种新的成分进行分离， 也可以同 时对上述。

38、 35 种化合物进行分离。因而， 无论是分离得到一种新的化合物成分， 还是同时得 到上述所有新的化合物成分， 相对现有技术， 都提供了种类更多、 成分更齐全的黄酮类化合 物， 为研究风轮菜黄酮类组合物在活性化瘀和治疗心血管疾病方面的具体有效药物成分奠 定更全面的物质基础。 0035 在本发明另一种典型的实施方式中， 提供了黄酮组合物， 该黄酮组合物为风轮菜 的提取物， 且包括黄酮类结构的化合物、 二氢黄酮类结构的化合物、 黄酮醇类结构的化合 物以及异黄酮类结构的化合物 ； 其中， 黄酮类结构的化合物至少包括以下任意一种 ： 洋芹 素 -7-O- 芸香糖苷 (6)、 木犀草素 -7-O-D- 葡。

39、糖醛酸苷 (9)、 木犀草素 -7-O-D- 葡糖 醛酸正丁醇酯苷(10)、 木犀草素-7-O-芸香糖苷(11)、 木犀草素-7-O-新橙皮糖苷(12)、 金 合欢素-7-O-D-葡糖醛酸苷(14)和金合欢素-7-O-D-芸香糖苷(15)， 上述黄酮类结 构的化合物通过上述方法分离得到。 包含了本申请的上述黄酮类结构的化合物的黄酮组合 物， 因具有相对较齐全的物质组成， 为从风轮菜的天然产物中寻找具有良好疗效的治疗和 / 或预防心血管疾病的药物提供了相对更丰富的物质基础和更可靠的理论依据。 0036 在另一种优选的实施例中， 本发明的黄酮组合物在二氢黄酮类结构的化合物方 面也有新的成分增加， 。

40、至少包括以下任意一种 ： 柚皮素 -7-O- 新橙皮糖苷 (22)、 高圣草素 (25)、 橙皮素-7-O-葡萄糖苷(26)、 圣草次苷(28)、 新北美圣草苷(29)和5， 7， 3， 5-四 羟基二氢黄酮 -7-O- 新橙皮糖苷 (30)。包含了上述二氢黄酮类结构的化合物的黄酮组合 物， 相比现有技术的黄酮组合物， 具有相对更全面的化合物组成， 有更明确的候选药物， 为 真正有效天然药物成分的选择提供了物质基础。更优选地， 本发明的黄酮组合物既包含本 发明的上述黄酮类结构的化合物， 同时还包含二氢黄酮类结构的化合物。在同时增加了上 述两类成分的基础上所得到的黄酮类组合物成分更加齐全， 更有。

41、利于后续的药物筛选和研 究。同样的， 上述二氢黄酮类结构的化合物也通过上述分离方法得到。 0037 更优选地， 本发明所提供的黄酮组合物中的黄酮醇类结构的化合物至少包括以下 任意一种 ： 山奈酚 -3-O- 鼠李糖苷 (32) 和山奈酚 3-O- 吡喃鼠李糖 -7-O- 葡萄糖苷 (33)。 上述黄酮醇类结构的化合物通过上述分离法方法得到。 因包含上述新的黄酮醇类结构的化 合物， 该黄酮组合物在黄酮醇类结构的化合物方面具有更明确的物质组成， 在此基础上， 所 得到的黄酮组合物中的化合物的种类也更多， 为从中筛选出治疗和 / 或预防心血管疾病的 有效成分提供了更多样化的选择， 为确定主要有效成分。

42、提供了更详实的物质依据。 0038 在本发明的上述任一种黄酮组合物中， 异黄酮类结构的化合物为染料木苷 (35)。 在本发明一种更优选的实施例中， 提供了一种包含了上述 35 种化合物的黄酮组合物， 且这 35 种化合物采用上述分离方法得到。该黄酮组合物是目前为止， 所分离到的黄酮类化合物 种类最多的组合物， 为从众多的黄酮类化合物中明确对治疗和 / 或预防心血管疾病的有效 药物提供了物质依据， 为进一步确定药物质量标准提供依据。 0039 下面将结合具体的实施例来详细说明本发明的有益效果。 0040 需要说明的是， 下来实施例中所用的凝胶柱层析是指用 Sephadex LH-20 羟丙基 说。

43、 明 书 CN 106279318 A 8 6/7 页 9 葡聚糖凝胶柱进行层析， 所说的反相高效液相色谱分离是指用 C-18 反相高效液相色谱柱 (Agilent phenyl9.4250mm ； 填充物粒径 ： 5m ； VMeOH:VH2O 40:60 ； 检测波长 ： 210nm ； 流 速 ： 2ml/min) 进行分离。 0041 实施例 1 ： 化合物制备。 0042 取风轮菜的干燥地上部分， 净选、 切段， 用水进行提取。提取液经浓缩干燥后得提 取物， 经大孔树脂层析， 以乙醇体积浓度分别为 20、 50、 70以及 95的乙醇 - 水为洗 脱剂， 得到乙醇体积浓度分别为 20。

44、、 50和 70的洗脱物， 再经碱提酸沉法富集， 精制后 即得到风轮菜总黄酮类物质。 0043 对总黄酮类物质采用硅胶柱色谱进行分离， 在分离过程中， 分别用体积比为 100 ： 5、 100 ： 10、 100 ： 15、 100 ： 20 和 100 ： 25 的氯仿和甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱， 依次得到第 1-90 流分、 第 91-190 流分、 第 191-260 流分、 第 261-310 流分和第 311-320 流分 ； 0044 对第 12-48 流分进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 在羟丙基葡聚糖凝胶柱层析的过 程中， 以体积比为 4 ： 6 的氯仿和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 并。

45、经薄层追踪检测合并相同组分， 分别得到 3 个流分 ； 然后以体积比为 60:40 的甲醇和水为洗脱剂， 对第 2 个流分进行 C-18 反相高效液相色谱分离， 在第 28.3min 得到化合物 13， 在第 26.9min 得到化合物 19 ； 同样， 以体积为60:40的甲醇 ： 水为洗脱剂， 对第3个流分进行C-18反相高效液相色谱分离， 在第 22.5min 得到化合物 25。 0045 对第 49-55 流分进行羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱纯化， 以体积比为 4 ： 6 的氯仿和甲 醇为洗脱剂进行洗脱， 然后用体积比为60:40的甲醇和水作为洗脱剂进行C-18反相高效液 相制备色谱分离， 。

46、在第 24.2min 得到化合物 1， 在第 26.3min 得到化合物 18。 0046 对第 79-86 流分进行羟丙基葡聚糖凝胶凝胶柱色谱纯化， 以体积比为 4 ： 6 的氯仿 和甲醇为洗脱剂进行洗脱， 然后用体积比为60:40的甲醇和水作为洗脱剂进行C-18反相高 效液相制备色谱分离， 在第 17.8min 得到化合物 7， 在第 20.3min 得到化合物 31。 0047 对第 133-176 流分进行硅胶柱色谱分离， 以体积比为 9:1， 4:1， 2:1， 1:1， 1:2 的氯 仿 - 丙酮为洗脱剂进行洗脱， 对各洗脱物经薄层检测合并相同组分， 分别得到共得 13 个流 分，。

47、 然后用体积比为 60:40 的甲醇和水作为洗脱剂， 分别对 13 个流分进行 C-18 反相高效液 相色谱分离， 依次得到化合物 2、 3、 4、 5、 8、 9、 10、 14、 16、 20、 26、 32 和 35。 0048 对第 231-260 流分经 MCI 柱色谱分离， 以体积比分别为 30:70 和 50:50 的甲醇和 水为洗脱剂进行洗脱， 得到 E1-E30 共 30 个组分， 经薄层检测合并相同组分， 共得 7 个流分 ； 然后用体积比为 60:40 的甲醇和水作为洗脱剂， 分别对 7 个流分进行 C-18 反相高效液相色 谱分离， 依次得到化合物 6、 21、 22、。

48、 28、 29、 30 和 33 ； 以及 0049 对第 295-310 经 MCI 柱色谱分离， 以体积比分别为 30:70 和 50:50 的甲醇 - 水为 洗脱剂进行洗脱， 经薄层检测合并相同组分， 共得 8 个流分， 然后用体积比为 60:40 的甲醇 和水作为洗脱剂， 分别对 8 个流分经 C-18 反相高效液相色谱分离， 依次得到化合物 11、 12、 15、 17、 23、 24、 27 和 34。 0050 实施例 2 ： 本发明的风轮菜黄酮组合物总黄酮对缺氧复氧诱导的 H9c2 心肌细胞损 伤的保护作用 0051 大鼠心肌细胞 H9C2 以 1105的密度接种于 96 孔板。

49、中培养 36h 后， 风轮菜黄 酮组合物 (1.5625、 3.125、 6.25、 12.5、 25， 50g/ml) 预处理 4h， 缺氧 6h， 复氧 24h。去上 说 明 书 CN 106279318 A 9 7/7 页 10 清， 5mg/ml MTT(0.1mg/ 每孔 ) 孵育 4h。弃上清， 每孔加 150l DMSO 溶解， 570nm 酶标仪 (Spectrafluor、 TECAN、 Sunrise、 Austria) 检测吸光度。结果如图 2 所示， 其中， 以正常细 胞为阳性对照， 以缺氧处理未加药的细胞为阴性对照， 从图 2 可以看出， 本发明所提供的风 轮菜黄酮组合物能够保护缺氧复氧诱导的心肌细胞死亡， 且呈浓度依赖性。 0052 从以上的描述中， 可以看出， 本发明上述的实施例实现了如下技术效果 ： 本发明通 过综合应用各种先进的色谱技术， 利用硅胶色谱载样量大的特点， 对风轮菜中的总黄酮类 物质进行初步分离 ； 利用凝胶色谱填料、 MCI 色谱填料和反相色谱填料无死吸附的特点， 对 总黄酮类物质进行进一步分离， 利用高效液相色谱高分离度的特点， 对性质相近的化合物 进行分离。由。