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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510270597.6 (22)申请日 2015.05.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104830739 A (43)申请公布日 2015.08.12 (83)生物保藏信息 CGMCCNO.10676 2015.03.31 (73)专利权人 山东大学 （威海） 地址 264200 山东省威海市文化西路180号 (72)发明人 杜宗军巩键苏传东穆大帅 陈冠军 (74)专利代理机构 威海科星专利事务所 37202 代理人 初姣姣 (51)Int.Cl. 。
2、C12N 1/20(2006.01) C12P 19/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 李东奇.海洋琼胶降解细菌的筛选、 鉴定及 其琼胶酶研究. 中国优秀硕士学位论文全文数 据库 基础科学辑 .2016,第2016年卷(第02期), A006-422. CICC.CICC10859菌种说明. www.china- cicc.org .2014,1. Li DQ等.Gammaproteobacteria bacterium Z1 16S ribosomal RNA gene,partial sequence. GenBank:KJ659911.1 .。
3、2014,1. Ling-Yun Guo.Marinagarivorans algicola gen.nov.,sp.nov.,isolated from marine algae. IJSEM .2016,第66卷1593- 1599. 尹群健等.产琼胶酶菌株Agarivorans sp. FG15的筛选鉴定与酶学性质. 中国酿造 .2014, 第33卷(第2期),17-22. 审查员 周茂新 (54)发明名称 一种海洋嗜琼胶菌及其制法和应用 (57)摘要 本发明涉及微生物技术领域， 具体地说是一 种海洋嗜琼胶菌及其制法和应用， 一种海洋嗜琼 胶 菌 ， 保 藏 名 称 为 荣 成 海 洋 。
4、嗜 琼 胶 菌 Marinoagarivoransrongchengensis， 于2015年 03月31日由中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心 （CGMCC） 保藏， 保藏编号为CMCC No.10676， 所述海洋嗜琼胶菌为革兰氏阴性菌， 氧化酶反应呈阳性， 过氧化氢酶反应呈阴性， 呼 吸醌类型主要为泛醌Q8， 细胞壁极性脂成分主要 为磷脂酰乙醇胺 （PE） ， 磷脂酰甘油 （PG） 和胺脂质 （AL） ， 能够降解琼脂， 产生琼胶酶， 还具有淀粉 酶、 脂酶和纤维素酶活性， 本发明菌株应用于工 业生产时， 相对于现有技术具有以下优势： 本菌 株琼胶降解效率高， 生长迅速、 且生。
5、长温度范围 较宽， 具有较高的工业应用潜力。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 104830739 B 2018.10.19 CN 104830739 B 1.一种海洋嗜琼胶菌， 保藏名称为荣成海洋嗜琼胶菌 Marinoagarivorans rongchengensis， 于2015年03月31日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） 保藏， 保藏编号为CGMCC No.10676。 2.根据权利要求1所述的一种海洋嗜琼胶菌， 其特征在于所述海洋嗜琼胶菌为革兰氏 阴性菌， 氧化酶反应呈阳性， 过氧化氢酶反应呈阴性， 呼吸醌类型主要为泛醌Q8， 细胞。
6、壁极 性脂成分主要为磷脂酰乙醇胺 （PE） ， 磷脂酰甘油 （PG） 和胺脂质 （AL） 。 3.一 种如权利要求1或2所述海洋嗜琼胶菌用于海藻降解的方法， 其特征在于包括以 下步骤： 步骤1： 种子液制备， 挑取海洋嗜琼胶菌单菌落至含有0.2%琼脂的2216E培养基中， 28 ， 150 rpm培养12小时； 步骤2： 海藻培养基制备， 将石花菜洗净， 剪碎， 按照重量体积比10%比例添加至2216E液 体培养基中， 灭菌处理； 步骤3： 将海洋嗜琼胶菌按照1-2%比例接种至海藻培养基中， 28， 150 rpm培养72小 时， 完全液化石花菜， 达到该类海藻的降解。 权利要求书 1/1 页。
7、 2 CN 104830739 B 2 一种海洋嗜琼胶菌及其制法和应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域， 具体地说是一种海洋嗜琼胶菌及其制法和应用。 背景技术 0002 海洋藻类有巨大的生物量， 据统计， 2012年全球水生藻类养殖量为2378万吨。 尽管 海藻储量及产量巨大， 但是人们对其利用的方式和开发程度有限， 目前海藻的应用还多停 留于初级产品的制备， 对其高值化和规模化的应用亟待探索， 主要研发方向为海藻寡糖的 制备和生物质能源转化。 在海藻的利用过程中， 微生物降解的优势日益凸显， 目前的海藻降 解微生物资源已难以满足海藻高值化和规模化开发的需求， 具有优良特性的微生。
8、物菌株及 海藻降解酶成为产业发展的关键要素。 红藻是主要的海水养殖藻类， 其细胞壁中分别含有 大量的琼胶， 具有巨大的开发潜力。 0003 海藻是海洋植物的主体， 是人类社会的一大自然财富。 海洋中的海藻类植物约一 万多种， 有绿藻门、 褐藻门、 蓝藻门、 红藻门等11个门， 目前有100多种多细胞藻可用作食品， 如褐藻中的海带、 裙带菜、 巨藻; 绿藻中的苔条、 石莼; 红藻中的紫菜、 石花菜等。 琼胶主要 存在于海洋红藻的细胞壁中， 从石花菜、 江蓠、 紫菜中提取的琼胶， 广泛用于食品生产， 并在 实验室中作为培养基的凝固剂。 0004 琼胶酶的应用领域之一是用于红藻和褐藻原生质体的制备，。
9、 作为高效、 可靠的海 藻解壁酶。 另外， 低聚糖由于具有抗炎、 抗病毒、 调节免疫等多种功能而备受关注， 因此研究 者们也开展了琼胶降解制备低聚糖的研究。 其中酶法降解具备作用条件温和， 环保等优势， 是人们的研究热点。 0005 由于目前琼胶降解酶活性、 表达量和稳定性等未达到工业化的要求， 造成生产成 本过高， 到目前为止， 这些琼胶降解酶并未广泛应用于工业化生产当中。 因此， 筛选新的琼 胶降解菌， 可以为以上问题的解决提供丰富的菌种资源和酶资源。 发明内容 0006 本发明针对现有技术的缺点和不足， 提出了一种海洋嗜琼胶菌及其制法和应用。 0007 一种海洋嗜琼胶菌， 保藏名称为荣成。
10、海洋嗜琼胶菌 Marinoagarivorans rongchengensis， 于2015年03月31日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） 保藏， 保藏编号为CMCC No.10676。 保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 0008 本发明所述海洋嗜琼胶菌为革兰氏阴性菌， 氧化酶反应呈阳性， 过氧化氢酶反应 呈阴性， 呼吸醌类型主要为泛醌Q8， 细胞壁极性脂成分主要为磷脂酰乙醇胺 （PE） ， 磷脂酰甘 油 （PG） 和胺脂质 （AL） 。 能够降解琼脂， 产生琼胶酶， 还具有淀粉酶、 脂酶和纤维素酶活性。 0009 本发明还提出上述海洋嗜琼胶菌的制备方法。
11、， 其特征在于包括以下步骤： 0010 步骤1： 海洋藻类样品采集于山东省威海市荣成市沿海海岸， 新鲜的藻类样品被放 置于无菌空离心管 （80 mL） 中密封保存， 放置于带冰袋的泡沫保温箱中以保持藻类表面微 生物的多样性； 说明书 1/4 页 3 CN 104830739 B 3 0011 步骤2： 从离心管中取出红藻石花菜， 称取10g藻类样品， 用灭菌过的无菌海水冲洗 藻类样品表面3次， 然后将冲洗过后的藻类放置于250 mL锥形瓶中 （含100 mL无菌海水） ， 剧 烈震荡； 0012 步骤3： 另取冲洗过后的藻类样品， 对样品充分研磨， 称取研磨后的红藻石花菜 10g， 同样置于2。
12、50 mL锥形瓶中 （含100 mL无菌海水） ， 剧烈震荡； 0013 步骤4： 分别取锥形瓶中的上清液1 mL， 加入含9 mL无菌海水的试管中， 做梯度稀 释， 稀释梯度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5； 0014 步骤5： 取原液及各稀释梯度稀释液100 L涂布于海洋琼脂培养基2216E平板上， 培养基由陈海水配制， 蛋白胨5g/L， 酵母粉1g/L， 琼脂18-20g/L， pH 7.0-7.6， 每组做六个平 行； 0015 步骤6： 将其中每组的三个平行放置于28恒温培养箱中培养， 每组的另外三个平 行放置于37恒温培养箱中培养， 培养时间为72h； 0016 。
13、步骤7： 对培养后的平板做目测观察， 目标菌落是能够降解琼脂形成平板凹陷的菌 群， 辅助检测为滴加卢氏碘液观察菌落周围是否有透明圈存在 （琼胶降解菌能降解菌落周 围的琼胶， 使卢氏碘液无法着色， 从而形成透明圈） ； 0017 步骤8： 将筛选到的目标菌落转接纯化三次， 获得目标菌株。 0018 本发明还提出了如上所述海洋嗜琼胶菌用于海藻降解的方法， 其特征在于包括以 下步骤： 0019 步骤1： 种子液制备， 挑取海洋嗜琼胶菌单菌落至于含有0.2%琼脂的2216E培养基 中， 28， 150 rpm培养12小时； 0020 步骤2： 海藻培养基制备， 将石花菜等海藻洗净， 剪碎， 按照重量体。
14、积比10%比例添 加至2216E液体培养基中， 灭菌处理； 0021 步骤3： 将海洋嗜琼胶菌Z1按照1-2%比例接种至海藻培养基中， 28， 150 rpm培养 72小时， 可以完全液化石花菜， 达到该类海藻的降解。 0022 本发明进一步提出了如上所述海洋嗜琼胶菌用于海藻寡糖制备的方法， 其特征在 于包括以下步骤： 0023 步骤1： 种子液制备， 挑取海洋嗜琼胶菌单菌落至于含有0.2%琼脂的2216E培养基 中， 28， 150 rpm培养12小时； 0024 步骤2： 扩大培养， 将种子液按照1%-2%接种量接种至新的0.2%琼脂的2216E培养基 中， 28， 150 rpm培养72。
15、小时； 0025 步骤3： 粗酶液的获取， 将扩大培养的菌液离心 （4、 1000 rpm、 离心10min） 收集发 酵上清液， 并用0.2微米滤膜过滤除菌， 冷冻真空干燥， 备用； 0026 步骤4： 琼脂糖底物的制备， 将琼脂糖3g添加至1L去离子水中， 加热至100， 期间 不断搅拌混匀， 冷却至30-40备用； 0027 步骤5： 琼胶粗寡糖的制备， 将发酵上清液按照10%比例添加冻干的粗酶液， 并置于 37温浴72h-96h， 并用磁力搅拌器搅拌， 获得粗寡糖。 0028 本发明菌株应用于工业生产时， 相对于现有技术具有以下优势： 本菌株琼胶降解 效率高， 生长迅速、 且生长温度范。
16、围较宽， 具有较高的工业应用潜力。 0029 附图说明： 说明书 2/4 页 4 CN 104830739 B 4 0030 附图1是本发明中菌株Z1的16S rDNA序列及完整的16S rDNA序列Neighbour- joining （NJ） 发育树。 0031 附图2是本发明中海洋嗜琼胶菌琼胶降解范例图。 0032 具体实施方式： 0033 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 0034 如附图1所示， 本发明提出了一种海洋嗜琼胶菌， 保藏名称为荣成海洋嗜琼胶菌 Marinoagarivorans rongchengensis， 于2015年03月31日由中国微生物菌种保藏管理委员 会。
17、普通微生物中心 （CGMCC） 保藏， 保藏编号为CMCC No.10676。 0035 本发明所述海洋嗜琼胶菌为革兰氏阴性菌， 氧化酶反应呈阳性， 过氧化氢酶反应 呈阴性， 呼吸醌类型主要为泛醌Q8， 细胞壁极性脂成分主要为磷脂酰乙醇胺 （PE） ， 磷脂酰甘 油 （PG） 和胺脂质 （AL） 。 能够降解琼脂， 产生琼胶酶， 还具有淀粉酶、 脂酶和纤维素酶活性。 0036 本发明所述海洋嗜琼胶菌的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： 0037 步骤1： 海洋藻类样品采集于山东省威海市荣成市沿海海岸， 新鲜的藻类样品被放 置于无菌空离心管 （80 mL） 中密封保存， 放置于带冰袋的泡沫保温。
18、箱中以保持藻类表面微 生物的多样性； 0038 步骤2： 从离心管中取出红藻石花菜， 称取10g藻类样品， 用灭菌过的无菌海水冲洗 藻类样品表面3次， 然后将冲洗过后的藻类放置于250 mL锥形瓶中 （含100 mL无菌海水） ， 剧 烈震荡； 0039 步骤3： 另取冲洗过后的藻类样品， 对样品充分研磨， 称取研磨后的红藻石花菜 10g， 同样置于250 mL锥形瓶中 （含100 mL无菌海水） ， 剧烈震荡； 0040 步骤4： 分别取锥形瓶中的上清液1 mL， 加入含9 mL无菌海水的试管中， 做梯度稀 释， 稀释梯度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5； 0041 步骤5。
19、： 取原液及各稀释梯度稀释液100 L涂布于海洋琼脂培养基2216E平板上， 培养基由陈海水配制， 蛋白胨5g/L， 酵母粉1g/L， 琼脂18-20g/L， pH 7.0-7.6， 每组做六个平 行； 0042 步骤6： 将其中每组的三个平行放置于28恒温培养箱中培养， 每组的另外三个平 行放置于37恒温培养箱中培养， 培养时间为72h； 0043 步骤7： 对培养后的平板做目测观察， 目标菌落是能够降解琼脂形成平板凹陷的菌 群， 辅助检测为滴加卢氏碘液观察菌落周围是否有透明圈存在 （琼胶降解菌能降解菌落周 围的琼胶， 使卢氏碘液无法着色， 从而形成透明圈） ； 0044 步骤8： 将筛选到。
20、的目标菌落转接纯化三次， 获得目标菌株。 0045 本发明还提出一种海洋嗜琼胶菌用于海藻降解的方法， 其特征在于包括以下步 骤： 0046 步骤1： 种子液制备， 挑取海洋嗜琼胶菌单菌落至于含有0.2%琼脂的2216E培养基 中， 28， 150 rpm培养12小时； 0047 步骤2： 海藻培养基制备， 将石花菜等海藻洗净， 剪碎， 按照重量体积比10%比例添 加至2216E液体培养基中， 灭菌处理； 0048 步骤3： 将海洋嗜琼胶菌Z1按照1-2%比例接种至海藻培养基中， 28， 150 rpm培养 72小时， 可以完全液化石花菜， 达到该类海藻的降解。 说明书 3/4 页 5 CN 1。
21、04830739 B 5 0049 本发明进一步还提出了一种海洋嗜琼胶菌用于海藻寡糖制备的方法， 其特征在于 包括以下步骤： 0050 步骤1： 种子液制备， 挑取海洋嗜琼胶菌单菌落至于含有0.2%琼脂的2216E培养基 中， 28， 150 rpm培养12小时； 0051 步骤2： 扩大培养， 将种子液按照1%-2%接种量接种至新的0.2%琼脂的2216E培养基 中， 28， 150 rpm培养72小时； 0052 步骤3： 粗酶液的获取， 将扩大培养的菌液离心 （4、 1000 rpm、 离心10min） 收集发 酵上清液， 并用0.2微米滤膜过滤除菌， 冷冻真空干燥， 备用； 0053 。
22、步骤4： 琼脂糖底物的制备， 将琼脂糖3g添加至1L去离子水中， 加热至100， 期间 不断搅拌混匀， 冷却至30-40备用； 0054 步骤5： 琼胶粗寡糖的制备， 将发酵上清液按照10%比例添加冻干的粗酶液， 并置于 37温浴72h-96h， 并用磁力搅拌器搅拌， 获得粗寡糖。 0055 本发明菌株应用于工业生产时， 相对于现有技术具有以下优势： 本菌株琼胶降解 效率高， 生长迅速、 且生长温度范围较宽， 具有较高的工业应用潜力。 说明书 4/4 页 6 CN 104830739 B 6 0001 ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGAAC。
23、GGTCTTCGGACTTATTAGAGCGG CGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATCTACCTAGTAGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAC GCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATCTTCGGACCTCTCGCTATTAGATGAGCCCAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTAAG GTAATGGCTTACCAAGGCGACGACCCGTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG。
24、CGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAG AAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCACTTTAAGCAGTGAGGAAGGCTATATGCTTAATACGCATGTAGATTGACGTTAACT GCAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG GCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTATCAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGGAACT GGTGAGCTAGAGTACAGCAGAGGAGTGTGG。
25、AATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAACATCA GTGGCGAAGGCGACACTCTGGGCTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGTTGTTGGGACCCTTGAGGTTTTAGTGACGCAGCTAACGCATTAAGT AGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGAAGCAAC。
26、GCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCTGATAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCT TCGGGAAATCAGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAG CGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG TGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAAAGGGCCGC TAAGCCGCGAGGCCATGCTAATCCCATAAAACTGTTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTC GGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCA TGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGAGGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTCTCCACGGTGTGATTCATGACTGGGGT G 序列表 1/1 页 7 CN 104830739 B 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 104830739 B 8 。