一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒及检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810600147.2 (22)申请日 2018.06.12 (71)申请人 宁波大学 地址 315000 浙江省宁波市江北区风华路 818号 (72)发明人 王钦文陈韦华季慧慧常岚 段世伟 (74)专利代理机构 宁波鄞州全方专利商标事务 所(普通合伙) 33242 代理人 陈园园马树鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂 盒及检测方法 (57)摘。

2、要 一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂 盒， 包括一对DISC1基因启动子区甲基化特异性 扩增引物和一个甲基化特异性测序引物， 所述一 对DISC1基因启动子区甲基化特异性扩增引物包 含甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游 引物。 本发明通过检测与阿尔茨海默病相关的精 神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基化程度辅 助诊断阿尔茨海默病， 简单、 方便， 检测效率高， 针对性强， 具有准确可靠、 灵活快速和经济节约 的优点， 有利于阿尔茨海默病的早起发现和及时 治疗。 权利要求书2页 说明书9页 序列表1页 附图1页 CN 108715894 A 2018.10.30 CN 108715894 。

3、A 1.一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒， 其特征在于： 包括一对DISC1基因启动 子区甲基化特异性扩增引物和一个甲基化特异性测序引物， 所述一对DISC1基因启动子区 甲基化特异性扩增引物包含甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。 2.如权利要求1所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒， 其特征在于： 所述 甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列为： 5 -GGGGTTAATGTTGGAAAGGAAA-3 ； 所述甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列为： 5 -Biotin-CCTAAACTACCTCCTACTCCT-3 。 3.如权利要求1所述的一种包含精神分裂症断裂。

4、基因的检测试剂盒， 其特征在于： 所述 甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列为： 5 -GTTAATGTTGGAAAGGAAAT-3 。 4.如权利要求1所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒的检测方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 步骤一： 提取样本的全血基因组DNA， 并检测所得DNA的浓度； 步骤二： 采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 步骤三： 取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶， 并加入一对精 神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基化特异性扩增引物， 进行PCR扩增； 步骤四： 焦磷酸测序的前期准备： 在PSQ96板中。

5、预先加入45 l含有0.3 M甲基化特异性 测序引物的退火缓冲液， 将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中， 在琼脂 糖珠中加入结合缓冲液混匀； 将以上结合缓冲液加入PCR扩增产物中， 将PCR产物在常温下 混匀10分钟， 使得磁珠与生物素结合； 在真空预备工作站中， 四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、 70乙醇、 洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液； 打开真空预备工作站的泵， 将真空 准备工具在高纯水中清洗30秒； 然后将真空准备工具移到PCR板中， 抓取琼脂糖珠； 拿起PCR 板， 检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上； 将真空准备工具放入70乙醇中5 。

6、秒； 然后移到变性缓冲液中5秒； 再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒； 关掉泵； 将真空准备工 具放入含有甲基化特异性测序引物的板中， 摇动， 释放琼脂糖珠； 使用高纯水清洗真空准备 工具； 将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到802分钟， 再冷却到室温； 步骤五： 焦磷酸测序： 在焦磷酸测序仪上， 采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤四中 的PSQ96板中的样本进行测序， 然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。 5.如权利要求4所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒的检测方法， 其特 征在于： 所述的步骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取。

7、仪提取全血基因组DNA， 再通过 NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。 6.如权利要求4所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒的检测方法， 其特 征在于： 所述的步骤二中采用EZ DNA甲基化试剂盒。 7.如权利要求4所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒的检测方法， 其特 征在于： 步骤三中的PCR扩增的条件为： 首先在温度95下进行10分钟的变性； 接着在温度 95下进行30秒， Tm 40秒， 温度72下进行50秒， 共45个循环的退火反应； 然后延伸反应在 温度72下进行7分钟。 8.如权利要求4所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒的检测方法，。

8、 其特 权利要求书 1/2 页 2 CN 108715894 A 2 征在于： 所述的步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMark Q24焦磷酸测序。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108715894 A 3 一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及阿尔茨海默病的辅助诊断技术领域， 特别涉及一种包含精神分裂症断 裂基因的检测试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种系统性神经退行性疾病， 其临床表 现为高级认知功能低下， 主要特征包括脑细胞内神经纤维缠结及细胞外老年斑。 目前随着 生活节奏的加快。

9、和环境污染的加重， 阿尔茨海默病的患病率不断增加， 给社会和家庭都带 来极大的经济负担， 因此， 寻找阿尔茨海默病相关基因进而阐明痴呆症发病的遗传机制已 经成为目前研究的热点。 虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展阿尔茨海默病的病因 研究， 且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与阿尔茨海默病的关联性上， 但其 发病机理仍未被完全阐释清楚， 这无疑妨碍了阿尔茨海默病预防及治疗水平的提高。 0003 其中， 精神分裂症断裂基因1(disrupted-in-schizophrenia-1， DISC1)被认为是 精神分裂症的主要易感因素之一， 同时也被认为是淀粉样前体蛋白的加工以及A 的产生。

10、过 程的重要参与成分之一， 其是由位于1号染色体的精神分裂症断裂基因1基因(chr1： 231762434.231762589)编码而成的。 现在， 国内外已有大量研究报道了DISC1基因单核苷 酸多态性与阿尔茨海默病发病的关系， 且研究多集中于rs821597和rs821616多态位点， 但 是， 关于用于检测与阿尔茨海默病相关的精神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基化程度 的检测试剂盒并未有任何相关研究。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测准确率高， 针对性强、 检测方便的一 种辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法。 0005 本发明解决上述技术问题所采用的技。

11、术方案为： 0006 一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒， 包括一对DISC1基因启动子区甲基 化特异性扩增引物和一个甲基化特异性测序引物， 所述一对DISC1基因启动子区甲基化特 异性扩增引物包含甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物。 0007 优选地， 所述甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列为： 0008 5 -GGGGTTAATGTTGGAAAGGAAA-3 ； 0009 所述甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列为： 0010 5 -Biotin-CCTAAACTACCTCCTACTCCT-3 。 0011 3、 如权利要求1所述的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒，。

12、 其特征在于： 所述甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列为： 0012 5 -GTTAATGTTGGAAAGGAAAT-3 。 0013 一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒的检测方法， 包括以下步骤： 步骤一： 提取样本的全血基因组DNA， 并检测所得DNA的浓度； 说明书 1/9 页 4 CN 108715894 A 4 0014 步骤二： 采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 0015 步骤三： 取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶， 并加入一 对精神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基化特异性扩增引物， 进行PCR扩增； 0016 。

13、步骤四： 焦磷酸测序的前期准备： 在PSQ96板中预先加入45 l含有0.3 M甲基化特 异性测序引物的退火缓冲液， 将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中， 在 琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀； 将以上混合液加入PCR扩增产物中， 将PCR产物在常温下 混匀10分钟， 使得磁珠与生物素结合； 在真空预备工作站中， 四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、 70乙醇、 洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液； 打开真空预备工作站的泵， 将真空 准备工具在高纯水中清洗30秒； 然后将真空准备工具移到PCR板中， 抓取琼脂糖珠； 拿起PCR 板， 检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空。

14、准备工具上； 将真空准备工具放入70乙醇中5 秒； 然后移到变性缓冲液中5秒； 再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒； 关掉泵； 将真空准备工 具放入含有甲基化特异性测序引物的板中， 摇动， 释放琼脂糖珠； 使用高纯水清洗真空准备 工具； 将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到802分钟， 再冷却到室温； 0017 步骤五： 焦磷酸测序： 在焦磷酸测序仪上， 采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤 四中的PSQ96板中的样本进行测序， 然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。 0018 优选地， 所述的步骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因。

15、组 DNA， 再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。 0019 优选地， 所述的步骤二中采用EZ DNA甲基化试剂盒。 0020 优选地， 步骤三中的PCR扩增的条件为： 首先在温度95下进行10分钟的变性； 接 着在温度95下进行30秒， Tm 40秒， 温度72下进行50秒， 共45个循环的退火反应； 然后延 伸反应在温度72下进行7分钟。 0021 优选地， 所述的步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMark Q24焦磷酸测序。 0022 与现有技术相比， 本发明的优点在于通过检测与阿尔茨海默病相关的精神分裂症 断裂基因1基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，。

16、 简单、 方便， 检测效率高， 针对 性强， 具有准确可靠、 灵活快速和经济节约的优点， 有利于阿尔茨海默病的早起发现和及时 治疗。 附图说明 0023 图1为被检测序列所在区域以及2个CpG位点的相关性示意图。 0024 图2为DNA甲基化水平检测结果示意图。 0025 F： 正向引物(Forwardprimer)； S： 测序引物(Sequencing primer)； R： 反向引物 (Reverse primer)。 具体实施方式 0026 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 0027 如图1-2所示， 本发明的一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒， 包含一对 DISC1基。

17、因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物， 其中一对DISC1 基因启动子区甲基化特异性扩增引物包含甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引 物， 具体为： 说明书 2/9 页 5 CN 108715894 A 5 0028 1)、 甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列： 0029 5 -GGGGTTAATGTTGGAAAGGAAA-3 ； 0030 2)、 甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列： 0031 5 -biotin-CCTAAACTACCTCCTACTCCT-3 ； 0032 3)、 甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列： 0033 5 -GTTAATGTTG。

18、GAAAGGAAAT-3 。 0034 对比实验： 证明DISC1基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率的相关 性 0035 1、 研究对象的收集 0036 从宁波市某三甲医院收集阿尔茨海默病患者， 痴呆诊断标准依据世界卫生组织的 国际疾病分类第10版(ICD-10)， 阿尔茨海默病(AD)诊断标准采用NINCDS-ADRDA标准。 排除 血管性痴呆， 路易体痴呆等疾病后， 最后确定阿尔茨海默病人51例作为病例组(80.94 8.88岁)， 同时收集年龄匹配且无痴呆家族史的63名正常者作为对照组(79.787.87岁)。 对所有研究对象在知情同意的前提下， 抽血检测载脂蛋白、 同型半胱氨。

19、酸等一般生化指标， 同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中， -80低温储存， 以备用于标本统一提取基因组DNA。 0037 2、 基因组DNA的提取 0038 应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门， 致善生物科技)提取上述步骤得 到的样本的全血基因组DNA， 再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国， Thermo Fisher Scientific)检测所得DNA的浓度， 以供DISC1基因启动子区DNA甲基化水平的检测。 0039 3、 DNA甲基化水平测定 0040 本实验采用焦磷酸测序技术对DISC1基因启动子区的5个CpG位点(如图2所示)进 行了DNA。

20、甲基化水平分析。 此技术的基本原理： 用重亚硫酸盐处理DNA样品后， 再应用聚合酶 链反应(PCR)扩增， 可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变， 而使未发生甲基化的C转变 成了尿嘧啶(U)， 然后通过测序引物进行PCR测序， 从而得到哪个位点发生了甲基化。 本次研 究采用PyroMarkAssay Design软件进行引物设计， 用于实验的PCR扩增引物和测序引物如 下： 0041 1)、 甲基化特异性上游引物(Forwardprimer) 0042 5 -GGGGTTAATGTTGGAAAGGAAA-3 ， 0043 2)、 甲基化特异性下游引物(Reverse primer) 004。

21、4 5 -Biotin-CCTAAACTACCTCCTACTCCT-3 ， 0045 3)、 甲基化特异性测序引物(Sequencing primer) 0046 5 -GTTAATGTTGGAAAGGAAAT-3 。 0047 DNA甲基化水平测定的具体步骤： 0048 第一步： 采用EZDNA甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit； ZYMO RESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。 0049 第二步： 取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶(Zymo TaqTM PreMix,ZYMO RESE。

22、ARCH)， 并加入上述一对精神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基 化特异性扩增引物， 进行PCR扩增， 扩增条件为： 首先在95下进行时长10min的变性反应； 接着在95下反应30s， Tm反应40s， 72下反应50s， 的退火反应， 并重复上述退火反应45 说明书 3/9 页 6 CN 108715894 A 6 个； 最后在72下延伸反应7min。 (注： Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定) 0050 第三步： 焦磷酸测序的前期准备： 在PSQ96板中预先加入45 l含有0.3 M上述甲基 化特异性测序引物的退火缓冲液(PyroMarkAnnealing Buffer； Qiage。

23、n)； 将需要使用的混 匀的琼脂糖珠总量(每样本3 l)转移到一个Eppendorf管中； 在琼脂糖珠中加入结合缓冲液 (PyroMarkBinding Buffer； Qiagen)， 使得平均每个样品约有50 l的体积， 将混合物混匀； 将以上混合物加入PCR产物(50 l反应体积)中， 每样本50 l； 将PCR产物在常温下混匀10分 钟， 使得磁珠与生物素结合； 在真空预备工作站中， 四个样品板中分别加入180ml的高纯水、 70乙醇、 洗涤缓冲液(PyroMarkWash Buffer； Qiagen)和120ml的变性缓冲液 (PyroMarkDenaturation Soluti。

24、on； Qiagen)； 打开真空预备工作站的泵， 将真空准备工具 在高纯水中清洗30秒； 然后将真空准备工具(PyroMarkVacuum Prep Filter Probes； Qiagen)移到PCR板中， 抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作)； 拿起 PCR板， 检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上； 将真空准备工具放入70乙醇 中5秒； 然后移到变性缓冲液中5秒； 再移到洗涤缓冲液中清洗510秒； 关掉泵； 将真空准备 工具放入含有测序引物的板中， 摇动， 释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入)； 使用高纯水 清洗真空准备工具； 将放有样品的PSQ96板放。

25、在加热板上加热到802分钟， 再冷却到室温， 即可进行焦磷酸测序反应。 0051 第四步： 焦磷酸测序： 在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上， 采用Pyromark Gold Q24 试剂盒(Pyromark Gold Q24Reagents； Qiagen)对第三步中的PSQ96板中的样本进行测序， 然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析， 具体结果如表1-3所示， 甲基化水平检 测结果如图2所示。 0052 表1病例组与对照组间的比较(n114) 说明书 4/9 页 7 CN 108715894 A 7 0053 0054 0055 表2分层后病例组与对照组间的比较。

26、(n114) 说明书 5/9 页 8 CN 108715894 A 8 0056 0057 表3分层后男性和女性间的比较 0058 0059 注： n表示样本个数， p值小于0.05， 具有统计学意义； 加#表示多重检测后p值依旧 具有统计学意义； 加a表示进行过对数转换； 加b表示运用非参数秩和检验。 0060 4、 数据分析 0061 本次实验采用SPSS 16.0对数据进行整理分析(p0.671， p0.001， 有 统计学意义)， 所以我们把CpG1和CpG2求平均值后参与到后续的分析中。 如表1所示， 发现病 例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异(p0.001)， 进一步分。

27、性别比较病例组 和对照组之间阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平的差异， 结果如表2所示， CpG1和CpG2 在男性中与阿尔茨海默病存在关联(p0.008； p0.001)， 而CpG2在女性中与阿尔茨海默 病相关(p0.007)。 0064 4.2、 如图2中所示， CpG1和CpG2的甲基化程度分别为5和7， 其中百分数为对应 说明书 6/9 页 9 CN 108715894 A 9 CpG位点的甲基化程度(后三个位点的数值， 测序系统认为是可疑的， 故未展示)。 0065 综上所述， 精神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患 病率呈正相关， 精神分裂症断裂基因1基因启。

28、动子区域的高甲基化水平会导致阿尔茨海默 病基因的低表达， 从而影响阿尔茨海默病的发生和发展。 因此， 以检测阿尔茨海默病基因启 动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对阿尔茨海默 病的检测， 检测效率高， 针对性强。 0066 该辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法包括以下步骤： 0067 步骤一： 采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA， 再通过 NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。 0068 步骤二： 采用EZDNA甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。 0069 步骤三： 取步骤二中转化过的DNA样本20。

29、ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶， 并加入一 对精神分裂症断裂基因1基因启动子区甲基化特异性扩增引物， 进行PCR扩增。 其中PCR扩增 条件为： 首先9510min的变性； 接着9530s， Tm 40s， 7250s， 共45个循环的退火反应； 然 后延伸反应727min。 0070 步骤四： 焦磷酸测序的前期准备： 在PSQ96板中预先加入45 l含有0.3 M甲基化特 异性测序引物的退火缓冲液， 将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个Eppendorf管中， 在 琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀； 将以上混合液加入PCR扩增产物中， 将PCR产物在常温下 混匀10分钟， 使得磁。

30、珠与生物素结合； 在真空预备工作站中， 四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、 70乙醇、 洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液； 打开真空预备工作站的泵， 将真空 准备工具在高纯水中清洗30秒； 然后将真空准备工具移到PCR板中， 抓取琼脂糖珠； 拿起PCR 板， 检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上； 将真空准备工具放入70乙醇中5 秒； 然后移到变性缓冲液中5秒； 再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒； 关掉泵； 将真空准备工 具放入含有甲基化特异性测序引物的板中， 摇动， 释放琼脂糖珠； 使用高纯水清洗真空准备 工具； 将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到802分钟， 再冷。

31、却到室温； 0071 步骤五： 焦磷酸测序： 在焦磷酸测序仪上， 采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤 四中的PSQ96板中的样本进行测序， 然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。 0072 以上仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 7/9 页 10 CN 108715894 A 10 0073 说明书 8/9 页 11 CN 108715894 A 11 0074 说明书 9/9 页 12 CN 10871。

32、5894 A 12 序列表 宁波大学 一种包含精神分裂症断裂基因的检测试剂盒及检测方法 CN-CN-2018-0225-1 3 SIPOSequenceListing 1.0 1 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 ggggttaatg ttggaaagga aa 22 2 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 cctaaactac ctcctactcc t 21 3 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 gttaatgttg gaaaggaaat 20 序列表 1/1 页 13 CN 108715894 A 13 图1 图2 说明书附图 1/1 页 14 CN 108715894 A 14 。