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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810692495.7 (22)申请日 2018.06.29 (71)申请人 山东阳成生物科技有限公司 地址 274600 山东省菏泽市鄄城县东环路 1666号 (72)发明人 王东阳刘新宇冯志彬 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 刘艳青 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12P 13/00(2006.01) (54)发明名称 一种固定化谷氨酸脱羧酶及其生产-氨基 丁酸的方法 (57)摘要 本发明公开。
2、了一种固定化谷氨酸脱羧酶及 其生产-氨基丁酸的方法。 本发明以固定化谷 氨酸脱羧酶为酶源， 以谷氨酸为底物， 经酶法转 化反应产生-氨基丁酸， 过滤除去固定化酶后 进一步分离获得-氨基丁酸。 固定化方法简便 快捷， 可重复催化次数多， 成本低， 酶促反应效率 高， 酶和产物分离效率高。 利用本发明， 谷氨酸的 转化率为78%， -氨基丁酸的收率可达90%， 纯度 高达99.9%。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 108642039 A 2018.10.12 CN 108642039 A 1.一种固定化谷氨酸脱羧酶， 其特征在于， 该固定化谷氨酸脱羧酶是以改性二氧化硅 纳米粒为载体，。
3、 共价固定化谷氨酸脱羧酶。 2.如权利要求1所述的固定化谷氨酸脱羧酶， 其特征在于， 所述改性纳米二氧化硅载体 的制备方法包括以下骤： （a） 首先称取二氧化硅纳米粒， 取适量硅烷APTES分散于甲苯中， 再加三乙胺作促进剂， 使悬浮液充分反应， 反应结束冷却至室温， 离心除去甲苯， 并用丙酮多次冲洗， 离心， 最后冷 冻干燥， 得到表面经硅烷APTES改性的二氧化硅纳米粒载体； （b） 首先在乙醇溶液中加入 （a） 所制备的改性二氧化硅纳米粒载体， 然后放入到超声波 仪器中超声， 使纳米粒悬浮在乙醇溶液中， 加入戊二酸酐， 反应完毕去除未反应的戊二酸 酐， 冲洗， 离心冷冻干燥， 即得到改性。
4、纳米二氧化硅载体。 3.权利要求1所述的一种固定化谷氨酸脱羧酶生产-氨基丁酸的方法， 其特征在于， 加入固定化谷氨酸脱羧酶、 谷氨酸和辅酶磷酸吡哆醛， 在酶促过程中流加谷氨酸， 转化反 应， 催化生成-氨基丁酸， 催化反应液经过滤除去固定化酶， 上清液脱色、 经超滤膜过滤后 减压浓缩， 降温、 析出白色晶体， 减压抽滤， 洗涤， 最后干燥获得-氨基丁酸。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述固定化谷氨酸脱羧酶质量分数为2%， 谷 氨酸初始量为质量分数2% ， 辅酶磷酸吡哆醛为0.1mM/L。 5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述酶促反应过程温度设为37， 酶促过程 中流。
5、加谷氨酸稳定pH值为4.8， 转化反应1-4h。 6.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述上清液加入活性炭进行脱色。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108642039 A 2 一种固定化谷氨酸脱羧酶及其生产-氨基丁酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及氨基酸生产技术领域， 具体涉及通过固定化酶法生产-氨基丁酸的 方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 伽马氨基丁酸 （GABA） 是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质， 它是一种天然 存在的非蛋白组成氨基酸， 具有极其重要的生理功能。 GABA能促进脑的活化性， 具有健脑益 智、 抗癫痫、 促进睡眠、 延缓脑衰老等功效， 。
6、还能补充人体抑制性神经递质， 改善肾机能， 降 血压、 抑制脂肪肝及肥胖症， 并活化肝功能。 研究证明， 每日补充微量的GABA有利于心脑血 压的缓解， 促进人体内氨基酸代谢的平衡， 增强免疫功能。 0003 GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。 化学合成法多见于专利文 献的报道， 成本较高， 得率较低， 并且在生产工艺中使用危险溶剂， 甚至是有毒溶剂。 因此， 化学合成法制备的GABA并不是一种天然食品添加剂， 不能用于食品加工生产。 生物合成法 相比较来说是一种既安全、 又低成本的方法。 在早期的研究中， 发酵法生产GABA以大肠杆菌 为生产菌， 培养基为麸皮水解液、 玉米。
7、浆、 蛋白胨、 矿物质等。 在发酵过程中， 利用大肠杆菌 脱羧酶的作用， 将L-谷氨酸转化为GABA， 再分离纯化得到GABA制品。 但是， 若要应用于食品 研发， 使用大肠杆菌无疑存在安全性的问题。 根据最新的研究报道和专利文献， 乳酸菌、 酵 母菌、 曲霉菌等一些安全性较高的微生物也能够用于制备GABA， 这就使得生物合成的GABA 制品能用于食品开发。 0004 固定化酶与游离酶相比有以下优点： 固定化酶可重复使用， 使酶的使用效率提 高、 使用成本降低。 固定化酶极易与反应体系分离， 简化了提纯工艺， 而且产品收率高、 质 量好。 在多数情况下， 酶经固定化后稳定性得到提高。 固定化酶。
8、的催化反应过程更易控 制。 固定化酶具有一定的机械强度， 可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液， 便于酶催 化反应的连续化和自动化操作。 固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用， 不仅可 利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速率大大提高， 而且还可以控制反应按一定顺序 进行。 0005 纳米级别的二氧化硅作为载体来源广且价格低廉， 是理想的固定化载体之一。 对 二氧化硅纳米粒表面进行烷基化改性从而引入其他活性官能团是一种常见的改性方法。 0006 现有技术中， 关于固定化酶的研究较多， 但固定化的谷氨酸脱羧酶在热稳定、 重复 使用次数、 成本高低等方面仍有待提高， 例如： 公布专利号CN10。
9、5907742A黄俊等一种羧基磁珠固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法和 应用重复催化10次， 仅保持90.42%的活性。 0007 公布专利号CN102719500A高智慧等一种固定酶法连续转化生产-氨基丁酸的方 法重复催化10次， 底物仍有7%的残留。 0008 另外， 文献-固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究， 得到的固定化酶连续催 化7次， 剩余活力为87%。 说明书 1/4 页 3 CN 108642039 A 3 发明内容 0009 本发明的目的之一是提供一种新的固定化酶， 目的之二是提供连续转化生产- 氨基丁酸的合成方法， 以弥补现有技术的不足。 0010 为达到上述目的， 本发明。
10、采取的具体技术方案为： 一种固定化谷氨酸脱羧酶， 是以改性二氧化硅纳米粒为载体， 共价固定化谷氨酸脱羧 酶。 0011 进一步的， 所述改性纳米二氧化硅载体的制备方法包括以下骤： （a） 首先称取二氧化硅纳米粒， 取适量硅烷APTES分散于甲苯中， 再加三乙胺作促进剂， 使悬浮液充分反应， 反应结束冷却至室温， 离心除去甲苯， 并用丙酮多次冲洗， 离心， 最后冷 冻干燥， 得到表面经硅烷APTES改性的二氧化硅纳米粒载体； （b） 首先在乙醇溶液中加入 （a） 所制备的改性二氧化硅纳米粒载体， 然后放入到超声波 仪器中超声， 使纳米粒悬浮在乙醇溶液中， 加入戊二酸酐， 反应完毕去除未反应的戊二。
11、酸 酐， 冲洗， 离心冷冻干燥， 即得到改性纳米二氧化硅载体。 0012 一种固定化谷氨酸脱羧酶生产-氨基丁酸的方法： 加入固定化谷氨酸脱羧酶、 谷 氨酸和辅酶磷酸吡哆醛， 在酶促过程中流加谷氨酸， 转化反应， 催化生成-氨基丁酸， 催化 反应液经过滤除去固定化酶， 上清液脱色、 经超滤膜过滤后减压浓缩， 降温、 析出白色晶体， 减压抽滤， 洗涤， 最后干燥获得-氨基丁酸。 0013 进一步的， 上述方法中， 所述固定化谷氨酸脱羧酶质量分数为2%， 谷氨酸初始量为 质量分数2%， 辅酶磷酸吡哆醛为0.1mM/L。 0014 进一步的， 上述方法中， 酶促反应过程温度设为37， 酶促过程中流加谷。
12、氨酸稳定 pH值为4.8， 转化反应1至4h。 0015 进一步的， 上述方法中， 所述上清液加入活性炭进行脱色。 0016 本发明的优点和有益效果： 本发明以固定化谷氨酸脱羧酶为酶源， 以谷氨酸为底物， 经酶法转化反应产生-氨基 丁酸， 过滤除去固定化酶后进一步分离获得-氨基丁酸。 固定化方法简便快捷， 可重复催 化次数多， 成本低， 酶促反应效率高， 酶和产物分离效率高。 利用本发明， 谷氨酸的转化率为 78%， -氨基丁酸的收率可达90%， 纯度高达99.9%。 0017 本发明是一种新的固定化酶法连续转化生产-氨基丁酸的绿色合成方法， 为- 氨基丁酸的工业化生产奠定了良好的产业化基础。。
13、 附图说明 0018 图1是实施例中-氨基丁酸的柱前衍生化HPLC检测图。 0019 图2是实施例中催化反应中pH的优化结果图。 0020 图3是实施例中磷酸吡哆醛浓度的优化结果图。 0021 图4是实施例中固定化酶浓度的优化结果图。 0022 图5是实施例中反应时间与转化率的关系图。 具体实施方式 说明书 2/4 页 4 CN 108642039 A 4 0023 以下通过实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。 0024 实施例1： 改性纳米二氧化硅载体固定化谷氨酸脱羧酶的制备 首先精确称取二氧化硅纳米粒5g， 用量筒量取适量硅烷APTES分散于除水的甲苯中， 再加几滴三乙胺作促进剂； 。
14、然后在110油浴加磁力搅拌的条件下使悬浮液充分反应5h； 反 应结束冷却至室温， 离心除去溶剂甲苯， 并用丙酮多次冲洗， 离心， 最后冷冻干燥， 得到表面 经硅烷APTES改性的二氧化硅纳米粒载体； 在乙醇溶液中加入所制备的改性二氧化硅纳米粒载体3g， 然后放入到超声波仪器 中超声10min左右， 使纳米粒悬浮在乙醇溶液中， 不断加入戊二酸酐， 37恒温磁力搅拌， 反 应时间3h， 反应完毕去除未反应的戊二酸酐， 并用0.1MNaCl溶液多次冲洗除去物理吸附的 戊二酸酐， 离心冷冻干燥， 即得到改性纳米二氧化硅载体。 0025 实施例2： -氨基丁酸的高效液相色谱法检测 以实施例1制得的固定化。
15、酶为酶源， 其中固定化酶质量分数2%， 谷氨酸初始量质量分数 为2%， 磷酸吡哆醛0.1mM/L， 在37下， 过程中流加谷氨酸稳定pH值为4.8， 转化反应1至4h， 催化生成-氨基丁酸。 0026 催化后的反应液过滤除去固定化酶获得清液， 以高效液相色谱法测定生成的- 氨基丁酸浓度， 并与-氨基丁酸标准曲线比对， 计算底物溶液中-氨基丁酸的摩尔转化 率。 0027 采用柱前衍生化HPLC法测定-氨基丁酸含量， 衍生化试剂2,4二硝基氟苯 (DNFB)乙腈溶液。 流动相A乙腈-水(1:1)， 相同体积的乙腈与水混合， 超声脱气10-15min； 流 动相B称取醋酸钠8.2g加水约1800mL。
16、， 用醋酸调pH至6.4， 加双蒸水至2000mL， 超声脱气10- 15min。 0028 衍生方法： 取经处理后的发酵液1mL， 8000r/min离心20min， 取上清液过膜。 准确量 取过膜后的发酵液适量于50mL棕色容量瓶中， 加入已经配制好的衍生缓冲溶液5.0mL， 摇匀 后再加入衍生试剂溶液5.0mL， 摇匀， 将容量瓶置于60水浴中暗处恒温加热60min后取出， 放置待溶液了冷却至室温后， 加入定容缓冲液稀释至刻度并摇匀， 放置15min后可以开始进 行色谱分离。 0029 色谱分离条件： 柱温： 33； 检测波长： 360nm； 流动相总流量： 1mL/min。 0030 。
17、结果如图1所示， 其中， 21.763min为-氨基丁酸出峰时间， 16.063min， 29.923min 和31.734min为溶剂峰。 0031 实施例3： 固定化酶的条件优化 以实施例1中固定化酶为酶源， 分别在每升反应体系中加入底物谷氨酸的量为40g/L； 转化时间为1-4h； 催化pH3.5-5.5； 固定化酶用量为8-13g/L； 辅酶磷酸吡哆醛浓度0.04- 0.16mmol/L。 考察不同转化条件对谷氨酸转化率的影响， 并采用实施例2中的检测方法检测 -氨基丁酸的含量， 计算-氨基丁酸的转化率。 结果分别如图2、 3、 4、 5所示。 0032 图2反应pH与谷氨酸转化率的关。
18、系； 底物谷氨酸用量40g/L； 固定化酶浓度10g/L； 磷酸吡哆醛浓度0.08mmol/L； 转化pH为3.5-5.5； 转化时间2h。 0033 图3反应磷酸吡哆醛的浓度与谷氨酸的关系； 底物谷氨酸用量40g/L； 固定化酶浓 度10g/L； 转化pH4.0； 磷酸吡哆醛浓度0.05-0.16mmol/L； 转化时间2h。 0034 图4反应固定化酶浓度与谷氨酸转化率的关系； 底物谷氨酸用量40g/L； 磷酸吡哆 说明书 3/4 页 5 CN 108642039 A 5 醛浓度0.08mmol/L； 转化pH4.0； 固定化酶浓度8-13g/L转化时间2h。 0035 图5反应固定化酶与。
19、反应时间的关系； 底物谷氨酸用量40g/L； 固定化酶浓度10g/ L； 磷酸吡哆醛浓度0.08mmol/L； 转化pH4.0； 固定化酶浓度10g/L； 转化时间0-4h。 0036 由上述确定的最适酶促反应条件为： 反应体系pH4.5； 反应时间4h； 固定化酶用量 10g/L。 在该最适酶促反应条件下， 谷氨酸的转化率约为78%。 0037 -氨基丁酸的制备和分离 以实施例3确定的最佳条件,以实施例1制得的固定化酶为酶源， 酶法合成-氨基丁 酸,催化反应液经过滤除去固定化酶， 上清液加入活性炭脱色,经超滤膜过滤后减压浓缩， 将浓缩物缓慢搅拌进行降温， 析出白色晶体,减压抽滤,经乙醇洗涤,干燥获得-氨基丁 酸,经计算-氨基丁酸的收率90%,纯度为99.9%。 0038 本发明以固定化谷氨酸脱羧酶为酶源， 以谷氨酸为底物， 经酶法转化反应产生- 氨基丁酸， 过滤除去固定化酶后进一步分离获得-氨基丁酸。 本研究对表达的谷氨酸脱羧 酶进行固定化研究， 并对固定化的谷氨酸脱羧酶反应条件进行了初步研究， 为微生物酶法 制取-氨基丁酸的生产工艺奠定了基础。 说明书 4/4 页 6 CN 108642039 A 6 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 7 CN 108642039 A 7 图4 图5 说明书附图 2/2 页 8 CN 108642039 A 8 。