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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201710101892.8 (22)申请日 2017.02.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106754650 A (43)申请公布日 2017.05.31 (73)专利权人 哈尔滨中科赛恩斯生物技术有限 公司 地址 150028 黑龙江省哈尔滨市科技一街 99号18栋E503室 (72)发明人 石佳宁陈思胡啸竹万娜 肖阳 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 杨佳龙 (51)Int.Cl. C12N 5/071。
2、(2010.01) 审查员 王思佳 (54)发明名称 一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种骨髓来源的内皮祖细胞 培养方法， 属于细胞培养技术领域。 该方法是将 已提取的骨髓用红细胞裂解液进行处理后分离 获得骨髓单个核细胞， 清洗后将所得单个核细胞 接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完 全培养基进行培养， 培养一段时间后， 利用胰蛋 白酶消化细胞后， 接种到培养瓶中进行差速贴壁 培养和差速消化培养。 所用的完全培养基， 是在 无血清培养基EGM2中添加胎牛血清、 血管内皮生 长因子、 糖皮质激素、 维生素C、 上表皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子、 集落刺激因。
3、子和血小 板源性生长因子制成。 该方法操作步骤较简单、 花费时间短， 一次分离数量多， 获得细胞传代代 次多等特点。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 106754650 B 2018.10.02 CN 106754650 B 1.一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 将已提取的骨髓用红细胞裂解 液进行处理后分离获得骨髓单个核细胞， 清洗后将所得的骨髓单个核细胞接种到预包被纤 维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行培养， 培养一段时间后， 利用胰蛋白酶消化细 胞后， 接种到培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养； 所述完全培养基， 是在无血清培养基EGM2中添加10(V/。
4、V)胎牛血清FBS， 812ng/mL 血管内皮生长因子VEGF， 0.4(V/V)糖皮质激素， 1(V/V)维生素C， 1(V/V)上表皮生长 因子EGF， 5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF， 2ng/mL集落刺激因子CSF， 1(V/V)血小板 源性生长因子PDGF。 2.根据权利要求1所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 步骤如 下： 1)在无菌条件下提取小鼠股骨后， 利用缓冲溶液将骨髓冲洗下来， 获得骨髓原液； 2)按照体积比为骨髓原液： 红细胞裂解液1:5的比例向步骤1)所得的骨髓原液中加 入红细胞裂解液进行处理， 处理后获得骨髓单个核细胞溶液； 3)利用。
5、缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后， 再将所得骨髓单个核细 胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行37恒温培养； 4)待细胞增长至约1106/孔时， 用胰蛋白酶消化细胞， 重新接种至25cm的培养瓶中继 续培养； 5)将步骤3)所得的细胞进行差速贴壁培养和差速消化培养。 3.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 步骤3)骨 髓单个核细胞接种的密度是5105/孔； 所述培养皿的直径为60mm。 4.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 步骤3)所 述完全培养基是在无血清培养基中添加10(V/V)胎牛血清。
6、FBS， 10ng/mL血管内皮生长因 子VEGF， 0.4(V/V)糖皮质激素， 1(V/V)维生素C， 1(V/V)上表皮生长因子EGF， 5ng/mL 碱性成纤维细胞成长因子bFGF， 2ng/mL集落刺激因子CSF， 1(V/V)血小板源性生长因子 PDGF。 5.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 接种在培 养皿后的骨髓单个核细胞在37的恒温培养箱中进行恒温培养， 培养至细胞密度为1 106/孔后， 用胰蛋白酶消化细胞， 重新接种至25cm的培养瓶中继续培养。 6.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 所述胰蛋 白酶的。
7、浓度为0.25， 消化时间为3min。 7.根据权利要求2所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 其特征在于， 具体步骤 如下： 1)将小鼠麻醉后， 在无菌条件下取小鼠股骨， 利用磷酸盐缓冲溶液将骨髓冲洗下来， 获 得骨髓原液； 2)按照体积比为骨髓原液： 红细胞裂解液1:5的比例加入红细胞裂解液， 室温静置 5min后， 在1000rpm下离心5min后弃掉上清液获得骨髓单个核细胞； 3)利用磷酸盐缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后， 再将所得骨髓单 个核细胞按照5105/孔的接种密度接种到预包被纤维连接蛋白的完全培养皿中在37下 进行恒温培养， 培养至细胞单个核细胞密度为1。
8、106/孔后， 在每个孔中加入1ml的0.25 权利要求书 1/2 页 2 CN 106754650 B 2 胰酶消化处理3min， 获得胰酶消化细胞； 4)将步骤3)所得的胰酶消化后的细胞转移至培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化 培养。 8.权利要求1-7所述任一方法在制备治疗心脑血管疾病、 外周血管疾病、 肿瘤等疾病和 创伤愈合药物中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106754650 B 3 一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 属于细胞培养技术领域。 背景技术 0002 内皮祖细胞(endothelial prog。
9、enitor cell， EPC)是成熟血管内皮细胞的前体细 胞， 是Asahara等在1997年首次证明造血系统中存在的具有新生血管潜能的细胞。 由于在前 期的大量研究中， 内皮祖细胞在在心脑血管疾病、 外周血管疾病、 肿瘤血管形成及创伤愈合 等方面均发挥重要作用， 可以有效促进缺血心肌内血管形成， 改善肢体缺血， 对损伤后血管 内皮进行修复， 因此有关EPC的分离、 纯化、 扩增及其功能和应用的研究越来越受到关注。 然 而体内存在的内皮祖细胞数量极少， 在骨髓中仅为0.1， 目前获得和扩增EPC的方法操作 过程复杂， 细胞得率低， 价格较为昂贵， 极大地限制了其在研究和临床应用方面的发展，。
10、 因 此， 本领域急需一种高效的内皮祖细胞培养方法， 以获得骨髓中稳定来源的内皮祖细胞来 满足进一步实验研究和临床应用的需求。 0003 在内皮祖细胞分离提取的过程中， 目前的技术手段主要是骨髓经过密度梯度分 离， 接种于纤维粘连蛋白(fibronectin)铺层的培养皿， 或者利用磁珠分选或流式细胞仪分 选的方式， 利用一些细胞表面粘附分子如CD34、 KDR、 CD133等进行分选后， 获得细胞再利用 上述培养液进行培养扩增。 然而由于血小板表面表达的粘附分子能够被单核细胞吞噬假表 达于某些不能向内皮细胞分化的单核细胞上， 从而使利用这些粘附分子进行分选的细胞不 能向内皮细胞分化， 而通过。
11、淋巴细胞密度梯度分离的方法也过于复杂， 成本相对较高。 0004 在内皮祖细胞培养过程中， 培养基的选择十分重要， 目前的培养基有以下几种： 0005 M199+10FBS+VEGF+bFGF+CSF； 0006 DMEM+20FBS+bFGF； 0007 DMEM-HG+10FBS+VEGF+bFGF； 0008 DMEM+CSF+FGF+10FBS； 0009 1640培养基+bFGF+VEGF+10FBS； 0010 EGM2+5FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+IGF+FGF； 0011 但是这几种培养基分别有各自的缺陷， 例如基础培养。
12、基选择的不合理、 血清比例 不合适、 刺激因子的选择及加入比例的不恰当， 这些缺陷导致内皮祖细胞培养时状态差， 获 得细胞量少， 传代次数低， 复苏后细胞活率低等特点。 因此， 在科学研究及临床应用中， 急需 一种高效稳定的培养基提高内皮祖细胞的培养效率。 发明内容 0012 为解决内皮祖细胞培养过程中传代代次偏低、 培养成本偏高、 培养效率低的技术 问题， 本发明提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞的培养方法， 所采取的技术方案如下： 0013 一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 该方法是将已提取的骨髓用红细胞裂解液 进行处理后分离获得骨髓单个核细胞， 清洗后将所得的骨髓单个核细胞接种到预包被纤维。
13、 说明书 1/5 页 4 CN 106754650 B 4 连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行培养， 培养一段时间后， 利用胰蛋白酶消化细胞 后， 接种到培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养； 0014 所述完全培养基， 是在无血清培养基EGM2中添加胎牛血清、 血管内皮生长因子、 糖 皮质激素、 维生素C、 上表皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子， 集落刺激因子和血小板源 性生长因子后制成。 0015 优选地， 所述完全培养基是在无血清培养基中添加10(V/V)胎牛血清FBS， 8 12ng/mL血管内皮生长因子VEGF， 0.4(V/V)糖皮质激素， 1(V/V)维生素C， 1(V/。
14、V)上表 皮生长因子EGF， 5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF， 2ng/mL集落刺激因子CSF， 1(V/V) 血小板源性生长因子PDGF。 0016 所述内皮祖细胞培养方法的步骤如下： 0017 1)在无菌条件下提取小鼠股骨后， 利用缓冲溶液将骨髓冲洗下来， 获得骨髓原液； 0018 2)按照体积比为骨髓原液： 红细胞裂解液1:5的比例向步骤1)所得的骨髓原液 中加入红细胞裂解液进行处理， 处理后获得骨髓单个核细胞溶液； 0019 3)利用缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后， 再将所得骨髓单个 核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行37恒温培养；。
15、 0020 4)待细胞增长至1106/孔时， 用胰蛋白酶消化细胞， 重新接种至25cm的培养瓶中 继续培养； 0021 5)将步骤3)所得的细胞进行差速贴壁培养和差速消化培养。 0022 优选地， 步骤3)骨髓单个核细胞接种的密度是5105/孔； 所述培养皿的直径为 60mm。 0023 优选地， 步骤3)所述完全培养基是在无血清培养基中添加10(V/V)胎牛血清 FBS， 10ng/mL血管内皮生长因子VEGF， 0.4(V/V)糖皮质激素， 1(V/V)维生素C， 1(V/V) 上表皮生长因子EGF， 5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF， 2ng/mL集落刺激因子CSF， 1 (V。
16、/V)血小板源性生长因子PDGF。 0024 优选地， 接种在培养皿后的骨髓单个核细胞在37的恒温培养箱中进行恒温培 养， 培养至细胞密度为1106/孔后， 用胰蛋白酶消化细胞， 重新接种至25cm的培养瓶中继 续培养。 0025 更优选地， 所述胰蛋白酶的浓度为0.25， 消化时间为3min。 0026 所述方法的具体步骤如下： 0027 1)将小鼠麻醉后， 在无菌条件下取小鼠股骨， 利用磷酸盐缓冲溶液将骨髓冲洗下 来， 获得骨髓原液； 0028 2)按照体积比为骨髓原液： 红细胞裂解液1:5的比例加入红细胞裂解液， 室温静 置5min后， 在1000rpm下离心5min后弃掉上清液获得骨髓。
17、单个核细胞； 0029 3)利用磷酸盐缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后， 再将所得骨 髓单个核细胞按照5105/孔的接种密度接种到预包被纤维连接蛋白的完全培养皿中在37 下进行恒温培养， 培养至细胞单个核细胞密度为1106/孔后， 在每个孔中加入1ml的 0.25胰酶消化处理3min， 获得胰酶消化细胞； 0030 4)将步骤3)所得的胰酶消化后的细胞转移至培养瓶中进行差速贴壁培养和差速 消化培养。 说明书 2/5 页 5 CN 106754650 B 5 0031 以上所述任一方法可在制备治疗心脑血管疾病、 外周血管疾病、 肿瘤等疾病和创 伤愈合药物中的应用。 0032 与现。
18、有技术相比， 本发明获得的有益效果： 0033 本发明所提供的方法可以简单快速低成本的分离出骨髓中的单个核细胞而不影 响内皮祖细胞的培养效率， 使用新型完全培养基培养后的内皮祖细胞从细胞数量、 细胞活 率、 细胞传代代次， 冻存细胞复苏后的活率上都有显著提高。 本发明降低了内皮祖细胞的培 养成本， 极大程度上提高了内皮祖细胞的培养效率， 解决了获得和扩增EPC的方法操作过程 复杂， 细胞得率低， 价格较为昂贵的问题。 0034 本发明为解决获取骨髓来源的内皮祖细胞培养效率较低、 成本较高、 内皮祖细胞 培养方法低效不稳定等技术问题， 本发明提供了一种能够高效稳定培养内皮祖细胞的完全 培养基及细。
19、胞获取方法。 本发明在从小鼠骨髓中分离单个核细胞时采取了红细胞裂解法而 非传统的淋巴细胞分离法， 该方法操作步骤较简单、 花费时间短， 一次分离较多数量的单个 核细胞。 在内皮祖细胞培养方面， 本发明提供了新的培养基配方， 使培养效率显著提高， 细 胞数量及活性增强， 传代代次提高。 0035 红细胞裂解液为一种比较温和的红细胞去除试剂， 主要是用来裂解组织或提取液 中的红细胞。 发明人在研究过程中偶然发现利用红细胞裂解液提取骨髓组织中骨髓单个核 细胞在提取效果上比并不弱于现有常用的淋巴细胞分离液， 但却可以大大减少实验成本上 以及操作时间。 采用红细胞裂解液进行提取只需一步离心即可， 不需要。
20、提取白膜层细胞， 对 细胞的损伤非常小。 0036 同时， 发明人偶然发现经将血小板源性生长因子PDGF添加培养基中能够有效提高 骨髓来源的内皮祖细胞的传代代次。 而在本申请之前， 血小板源性生长因子PDGF不是用于 培养内皮祖细胞的细胞细胞培养因子。 附图说明 0037 图1为利用本发明方法培养的内皮祖细胞P10代培养效果图。 0038 图2为P5代细胞在不同培养基培养条件下的细胞数量的对比图； 0039 (a， 为现有公认效果最好的EGM2+5FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+ VEGF+IGF+FGF培养基； b， 为本发明所用培养基)。 0040。
21、 图3为P5代细胞在不同培养基培养条件下内皮祖细胞表达CD34含量对比图； 0041 (a， 为现有公认效果最好的EGM2+5FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+ VEGF+IGF+FGF； b， 为本发明所用培养基)。 0042 图4为P5代细胞在不同培养基培养条件下内皮祖细胞表达VEGF-2含量对比图； 0043 (a， 为现有公认效果最好的EGM2+5FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+ VEGF+IGF+FGF； b， 为本发明所用培养基)。 具体实施方式 0044 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明， 但。
22、本发明不受实施例的限制。 0045 以下实施例所用材料、 试剂、 仪器和方法， 未经特殊说明， 均为本领域常规材料、 试 剂、 仪器和方法， 本领域技术人员均可通过商业渠道获得。 说明书 3/5 页 6 CN 106754650 B 6 0046 实施例1 0047 1.完全培养基的配置 0048 完全培养基是在血清培养基EGM2中加入： 10(V/V)胎牛血清(FBS)， 10ng/mL血管 内皮生长因子VEGF， 0.4(V/V)糖皮质激素， 1(V/V)维生素C， 1(V/V)上表皮生长因素 EGF， 5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子bFGF， 2ng/mL集落刺激因子(CSF)， 1。
23、(V/V)血小板源 性生长因子PDGF。 0049 2.小鼠骨髓单个核细胞的分离与培养 0050 将实验动物用10水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉。 无菌条件下取小鼠股 骨， 使用PBS迅速将骨髓完全冲洗到离心管中， 吹打均匀后按照1 5比例缓慢加入红细胞裂 解液。 在1000rpm下离心5min后分离得到骨髓单个核细胞。 用PBS洗3次后将单个核细胞以5 105/孔的密度， 接种于预包被纤维连接蛋白的6孔培养皿中， 放入37恒温培养箱中培 养。 待细胞增长至约1106/孔时， 用胰蛋白酶消化细胞， 重新接种至25cm2培养瓶内继续培 养。 0051 3.内皮祖细胞的差速贴壁培养 。
24、0052 培养24h后， 轻轻冲洗整个培养皿， 将未贴壁细胞重新接种于另一块预包被纤维连 接蛋白的6孔板中。 3天后换液， 弃去未贴壁细胞， 以后每两天换液。 待集落广泛形成后进行 消化， 传代。 每天观察细胞的形态。 0053 4.差速消化培养 0054 准备好待消化的细胞， 弃去培养液。 用PBS洗一遍后， 加入0.25胰蛋白酶， 轻轻震 荡， 3min后终止消化， 更换新的培养液。 0055 经观察， 培养获得的细胞可传10代， 且传过10代的细胞数量较多(见图1)。 0056 实施例2 0057 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 该方法与实施例1的区别 在于： 所用培养。
25、基中的组成为： EGM2+5FBS+Hydrocortisone+Ascorbic Acid+EGF+VEGF+ IGF+FGF。 具体是在EGM2培养基中添加5(v/v)胎牛血清FBS、 10ng/mL的Hydrocortisone (即糖皮质激素)、 0.4(V/V)的Ascorbic Acid、 2的EGF、 2ng/mL的VEGF、 5ng/mL的IGF、 1(V/V)的FGF。 利用该培养方法培养， 所得内皮祖细胞共传6代， 6代后细胞状态较差， 细胞 生长十分缓慢。 0058 实施例3 0059 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 该方法与实施例1的区别 在于： 所用。
26、培养基中没有添加集落刺激因子CSF。 利用该培养方法培养， 所得内皮祖细胞共 传6代代， 6代后细胞状态较差， 传代速度缓慢， 漂浮死细胞较多。 0060 实施例4 0061 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 该方法与实施例1的区别 在于： 没有使用1(V/V)血小板源性生长因子PDGF。 利用该培养方法培养， 所得的内皮祖细 胞共传代7代。 0062 实施例5 0063 本实施例提供了一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法， 该方法与实施例1的区别 在于： 说明书 4/5 页 7 CN 106754650 B 7 0064 使用常规的淋巴细胞分离液代替红细胞裂解液进行骨髓单个核细胞。
27、的分离， 具体 操作过程是： 0065 (1)将ACD抗凝骨髓液用0.01mol/LPBS液等体积稀释、 混匀。 0066 (2)取10ml无菌的离心管， 加入比重为1.077mol/ml的淋巴细胞分离液34ml， 将 稀释后的骨髓在离液面约1cm处缓慢滴加， 使形成一明显分界面， 上下液面勿混合。 0067 (3)在水平离心机中以2000转/min的转速， 离心40分钟。 0068 (4)小心吸取中间的白膜层， 用710倍体积的0.01mol/L PBS液稀释， 1000转/ min， 离心10分钟， 洗涤23次。 0069 经统计， 用淋巴细胞分离液提取耗时2小时左右， 而使用红细胞裂解液耗时仅需 30min， 操作时间减少75以上。 同时， 在提取薄膜曾细胞及分离室对细胞的损失较大， 且淋 巴细胞分离液价格要远比红细胞裂解液昂贵， 试验成本更高。 0070 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此 技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可以做各种改动和修饰， 因此本发明的保护 范围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 5/5 页 8 CN 106754650 B 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 9 CN 106754650 B 9 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 106754650 B 10 。