技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及针对细胞骨架蛋白β-actin纳米抗体的氨基酸序列、编码纳米抗体的核苷酸序列、能够表达所述纳米抗体的表达载体及宿主细胞。
背景技术
Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。β-actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。在生物医学研究领域，β-actin的表达量常作为蛋白免疫印迹的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。β-actin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于蛋白免疫印迹时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。
纳米抗体(variable domain ofthe heavy chain of HCAbs,VHH)是一种由天然缺失轻链的重链抗体可变区构成的小分子抗体(晶体结构直径2.5纳米，长度4纳米)，其最初是由比利时科学家在骆驼科动物体内发现。纳米抗体因其分子量小，具有亲和力高、稳定性强、组织相容性好及易筛选、易制备等特点，近年来在治疗型药物抗体、临床检测型抗体、科研运用型抗体等方面得到了广泛的研究与发展。纳米抗体的结构主要分为骨架区和互补决定区，前者在同源纳米抗体氨基酸序列中高度保守；主要负责纳米抗体基本结构的完整，后者主要针对不同的抗原出现复杂多样，其是抗原-抗体结合的决定区域。所以成功筛选的纳米抗体在于获得可以介导与抗原特异性结合的互补决定区。纳米抗体中的互补决定区(CDR)根据其在整个抗体中的位置不同，分为三个独立区域，即互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体，也可描述为针对细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体。
本发明的第二个目的是提供一种针对β-actin的纳米抗体的互补决定区的编码序列。
本发明的第三个目的是提供一种含有β-actin的纳米抗体的互补决定区的编码序列的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种含有β-actin的纳米抗体的互补决定区的编码序列的表达载体的宿主细胞。
为实现本发明的目的，提供了如下的技术方案：
本发明的一种细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体的互补决定区1、互补决定区2和互补决定区2分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明的一种细胞骨架蛋白的β-actin的纳米抗体的互补决定区1-3的编码序列：其互补决定区1-3的核苷酸序列，分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的序列。
本发明的一种含有细胞骨架蛋白的β-actin的纳米抗体的互补决定区1-3的编码序列(DNA序列)的表达载体，所述编码序列：其互补决定区1-3的核苷酸序列，分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的序列。
本发明的一种含有细胞骨架蛋白的β-actin的纳米抗体的互补决定区1-3的编码序列(DNA序列)的表达载体的宿主细胞，所述编码序列：其互补决定区1-3的核苷酸序列，分别含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的序列，所述的宿主细胞为大肠杆菌。
在具体实施方案中，本发明的一种针对细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体，所述抗体在其互补决定区1、互补决定区2及互补决定区3分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本发明的一种能够编码所述针对细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体CDR1-3区域的核苷酸序列，所述CDR1-3的核苷酸序列是为含有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的序列。
在具体实施方案中，本发明的一种表达载体，它所含细胞骨架蛋白β-actin纳米抗体CDR1-3区域的编码序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
本发明的一种大肠杆菌宿主细胞，它含有上述本发明的表达载体。
本发明的针对细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体互补决定区能够致使所构成的纳米抗体与β-actin发生良好的特异性结合。
附图说明：
图1表达载体pET28a-β-actin-FLAG构建流程图。
图2含有空载体pET28a或重组质粒pET28a-β-actin-FLAG的表达菌株诱导表达蛋白后，先用结合FLAG标签蛋白磁珠纯化，再经FLAG多肽洗脱，最后用SDS-PAGE蛋白电泳分析。
图3为纳米抗体表达载体pET28a-NB001-His和pET28a-NB control-His构建流程图。
图4为含有空载体pET28a及构建的pET28a-NB001-His和pET28a-NB control-His重组质粒的表达菌株表达蛋白后，经His标签蛋白纯化磁珠纯化，SDS-PAGE蛋白电泳分析后的结果。
图5为免疫共沉淀法分析纳米抗体NB001-His、NB control-His与β-actin结合能力的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。所举实例只用于解释和理解本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
羧基端带有FLAG标签的β-actin重组蛋白的制备过程：
(1)根据β-actin在NCBI中的编码基因序列(NCBI ReferenceSequence：NM_001101.4)，及FLAG标签序列(美国Sigma公司)，人工合成5’端和3’端分别带有Nco1和HindⅢ酶切位点的表达β-actin-FLAG重组蛋白的基因(苏州金唯智生物科技有限公司)，DNA序列如SEQ ID NO:9所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
(2)利用Nco1和HindⅢ双酶(购买于英国New England Biolabs)切获得酶切后的β-actin-FLAG DNA片段和pET28a DNA片段，将β-actin-FLAG DNA片段用T4连接酶(购买于英国New England Biolabs)连接至pET28a表达载体，经过基因序列测定，最终获得正确的pET28a-β-actin-FLAG表达载体。(见图1)
(3)将表达载体pET28a-β-actin-FLAG和对照表达载体pET28a分别转入基因工程菌BL21(中国天根公司)，获得表达β-actin-FLAG重组蛋白的工程菌和对照菌，并分别接种至100ml LB培养基中，37℃，250转/分钟摇晃培养至培养液OD600值为0.6，加入IPTG(工作浓度为1mM)，然后在18℃，200转/分钟摇晃培养12h。培养结束后，收集细菌，按照FLAG标签蛋白纯化磁珠(美国Sigma公司)使用说明书，裂解细菌并纯化β-actin-FLAG。
(4)将结合β-actin-FLAG磁珠至于含有FALG多肽(100ug/ml)的PBS溶液中，室温静置10min，进行β-actin-FLAG洗脱。然后收集洗脱液，用10kDa蛋白质超滤管过滤，去除FALG多肽。最后将β-actin-FLAG蛋白溶于PBS溶液。取5μlβ-actin-FLAG蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳分析。(见图2)
实施例2
针对β-actin的纳米抗体筛选过程：
(1)包被抗原：按照PureCube NHS Activated MagBeads(德国cube bioteach公司)说明书，分别制备β-actin-FLAG蛋白和FALG多肽包被的磁珠。
(2)纳米抗体库的预处理：取500μl含有2％(g/ml)脱脂奶粉PBS缓冲溶液(pH 7.4)，加入非免疫美国骆驼(llama)纳米抗体噬菌体展示基因库(纳米抗体噬菌体展示基因库构建参照文献：
Goldman E R,Anderson G P,Liu J L,et al.Facile generation of heat-stable antiviral and antitoxin single domain antibodies from a semisynthetic llama library.[J].Analytical Chemistry,2006,78(24):8245-55.)，使溶液中纳米抗体量达到1x 1011pfu，并加入Tween-20(终体积比为0.1％)。混匀后加入20μl经FLAG多肽包被的磁珠，然后室温旋转孵育30min；
(3)含有纳米抗体的噬菌体与β-actin的结合：将上述预处理后的纳米抗体噬菌体溶液转移至新的离心管中，加入20μl包被有β-actin-FLAG的磁珠(β-actin-FALG蛋白量约2μg左右)，然后室温旋转孵育90min；
(4)洗涤：弃去上述纳米抗体噬菌体溶液，用含有0.1％Tween-20PBS溶液洗涤磁珠20次；
(5)洗脱：向含有洗涤后磁珠的离心管中加入100μl 0.1M三乙胺溶液，常温温和振荡5min，然后加入100μl 1M Tris-HCl(pH8.0)，振荡混匀，室温静置5min；
(6)侵染:将洗脱液加入1ml大肠杆菌SS320(美国Lucigen公司)培养液(OD值为OD600)，37℃孵育45min；
(7)加入辅助噬菌体M13K07(购买于英国New England Biolabs)，侵染SS320(美国Lucigen公司)，37℃孵育45min,产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。
(8)将经(7)收集的噬菌体纳米抗体文库按照实施例2的步骤再进行2轮的筛选。
实施例3
纳米抗体的制备
实施例2中，完成第三轮筛选噬菌体侵染后，将大肠杆菌SS320(美国Lucigen公司)涂平板，挑取100个含噬菌体质粒的单克隆进行测序。根据测序结果，选取重复率最高的单克隆(标记为NB001)，所示序列如SEQ ID NO:8，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。通过PCR法和T4连接酶连接法将所选编码纳米抗体的核苷酸序列连接至表达载体pET28a中，具体过程如下：
(1)依据上述测序结果设计用于编码纳米抗体的核苷酸序列的PCR引物：
上游引物GATCCCATGGGC CAA GGT GTC CAG GCT GAG GTG CAG CTC(SEQ ID NO:11)
下游引物GATC CTCGAGGTC TTC GCT GTG GTG CGC TGA GGA G(SEQ ID NO:12)
(2)在上述引物下划线部分引入Nco1和Xho1的限制性酶切位点，以实施列3(1)中所选噬菌体质粒为模板，PCR扩增纳米抗体的DNA片段，然后通过Nco1和Xho1限制性内切酶(购买于英国New England Biolabs)酶切，用T4连接酶(购买于英国New England Biolabs)连接至表达载体pET28a中，经过基因序列测定，获得正确的含有编码纳米抗体核苷酸序列的重组质粒pET28a-NB001-His。(见图3)
(3)随机挑取一个未经过任何筛选的纳米抗体噬菌体基因库侵染大肠杆菌SS320后的单克隆菌株，将其所表达的纳米抗体作为对照抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示并依据实施例3(1)和实施例3(2)构建对照纳米抗体表达载体pET28a-NB control-His。(见图3)
(4)将重组质粒pET28a-NB001-His和pET28a-NB control-His分别转化至基因工程菌BL21(中国天根公司)，获得表达融合His标签的纳米抗体的工程菌，并分别接种至100ml LB培养基中，37℃，250转/分钟摇晃培养至培养液OD600值为0.6，加入IPTG(工作浓度为1mM)，然后在18℃，200转/分钟摇晃培养12h。培养结束后，收集细菌，按照His标签蛋白纯化磁珠(购买于中国苏州海狸生物医学工程有限公司)使用说明书，裂解细菌并纯化融合蛋白NB001-His和NB001-control-His。取2μl结合后磁珠进行SDS-PAGE电泳，检测纳米抗体纯化结合效率。(见图2)
实施例4
β-actin细胞裂解液的制备
(1)HEK293T细胞经胰酶消化、计数，收集300万细胞，并用PBS缓冲液洗涤3次；
(2)PBS第三次洗涤后，500g离心5min，弃去PBS溶液，将细胞重悬于500μl 1％NP-40裂解液中(50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1％NP-40,1mMEDTA，蛋白酶抑制剂cocktail)，冰浴裂解30min；
(3)将细胞裂解混合物14000g，4℃离心15min；
(4)收集离心后上清溶液，作为β-actin细胞裂解液。
实施例5
免疫共沉淀法检测纳米抗体与β-actin结合能力
(1)依据实施例3获得成功结合了NB001-His和NB control-His的磁珠，各取5μl磁珠，分别置于A管和B管；
(2)向A、B管中分别加入500μl实施例4中所得β-actin细胞裂解液，4℃旋转结合2h；
(3)弃去Β-ACTIN细胞裂解液，1％NP-40裂解液洗涤磁珠3次；
(4)弃去洗涤溶液，每管加入20μl SDS上样缓冲液，振荡混匀，沸煮5min；
(5)用蛋白免疫印迹检测免疫共沉淀后样品中β-actin和纳米抗体蛋白量。(见图5)
序列表
<110> 成都百奥克林生物科技有限公司
<120> 一种针对细胞骨架蛋白β-actin的纳米抗体及其编码序列
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Val Val Ser Leu Phe Arg Lys
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Phe Gly Asn Val Leu Val Ser
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Gln Arg Val Thr Ala Ile Pro Phe Leu Thr Arg Gly Tyr Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtgttgtgt ctttgtttcg gaag 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agctttggga atgtgcttgt gagt 24
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcagcgtg ttacggctat tccttttctt actaggggtt atacttac 48
<210> 7
<211> 136
<212> PRT
<213> 美洲驼(Lama glama)
<400> 7
Met Gly Gln Gly Val Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gln Ala Ser
20 25 30
Gly Val Val Ser Leu Phe Arg Lys Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
35 40 45
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile Ser Phe Gly Asn Val Leu
50 55 60
Val Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Ser Asp
65 70 75 80
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Pro Gln Met Asn Arg Met Arg Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Arg Val Thr Ala Ile Pro Phe
100 105 110
Leu Thr Arg Gly Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp
130 135
<210> 8
<211> 408
<212> DNA
<213> 美洲驼(Lama glama)
<400> 8
atgggccaag gtgtccaggc tgaggtgcag ctcgtggagt ctgggggagg cttggtgcag 60
gctggggggt ctctgagact ctcctgtcaa gcctctggtg ttgtgtcttt gtttcggaag 120
ataggctggt tccgccaggc cccagggaag gagcgtgagg gggtcgcgac tattagcttt 180
gggaatgtgc ttgtgagtta tgcagactcc gtgaaggggc gattcaccgt ctccagtgac 240
aacgccaaga acacggtgta tccgcaaatg aacagaatga gacctgagga cacggccgtt 300
tattactgtg cgcagcgtgt tacggctatt ccttttctta ctaggggtta tacttactgg 360
ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca gcgcaccaca gcgaagac 408
<210> 9
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgggcatgg atgatgatat cgccgcgctc gtcgtcgaca acggctccgg catgtgcaag 60
gccggcttcg cgggcgacga tgccccccgg gccgtcttcc cctccatcgt ggggcgcccc 120
aggcaccagg gcgtgatggt gggcatgggt cagaaggatt cctatgtggg cgacgaggcc 180
cagagcaaga gaggcatcct caccctgaag taccccatcg agcacggcat cgtcaccaac 240
tgggacgaca tggagaaaat ctggcaccac accttctaca atgagctgcg tgtggctccc 300
gaggagcacc ccgtgctgct gaccgaggcc cccctgaacc ccaaggccaa ccgcgagaag 360
atgacccaga tcatgtttga gaccttcaac accccagcca tgtacgttgc tatccaggct 420
gtgctatccc tgtacgcctc tggccgtacc actggcatcg tgatggactc cggtgacggg 480
gtcacccaca ctgtgcccat ctacgagggg tatgccctcc cccatgccat cctgcgtctg 540
gacctggctg gccgggacct gactgactac ctcatgaaga tcctcaccga gcgcggctac 600
agcttcacca ccacggccga gcgggaaatc gtgcgtgaca ttaaggagaa gctgtgctac 660
gtcgccctgg acttcgagca agagatggcc acggctgctt ccagctcctc cctggagaag 720
agctacgagc tgcctgacgg ccaggtcatc accattggca atgagcggtt ccgctgccct 780
gaggcactct tccagccttc cttcctgggc atggagtcct gtggcatcca cgaaactacc 840
ttcaactcca tcatgaagtg tgacgtggac atccgcaaag acctgtacgc caacacagtg 900
ctgtctggcg gcaccaccat gtaccctggc attgccgaca ggatgcagaa ggagatcact 960
gccctggcac ccagcacaat gaagatcaag atcattgctc ctcctgagcg caagtactcc 1020
gtgtggatcg gcggctccat cctggcctcg ctgtccacct tccagcagat gtggatcagc 1080
aagcaggagt atgacgagtc cggcccctcc atcgtccacc gcaaatgctt cgggtccgat 1140
tataaagatg acgacgataa ataa 1164
<210> 10
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met
1 5 10 15
Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro
20 25 30
Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly
35 40 45
Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile
50 55 60
Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp
65 70 75 80
Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val
85 90 95
Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro
100 105 110
Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn
115 120 125
Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala
130 135 140
Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr
145 150 155 160
His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu
165 170 175
Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile
180 185 190
Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile
195 200 205
Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu
210 215 220
Gln Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr
225 230 235 240
Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg
245 250 255
Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys
260 265 270
Gly Ile His Glu Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp
275 280 285
Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr
290 295 300
Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu
305 310 315 320
Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys
325 330 335
Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe
340 345 350
Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser
355 360 365
Ile Val His Arg Lys Cys Phe Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
370 375 380
Lys
385
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatcccatgg gccaaggtgt ccaggctgag gtgcagctc 39
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gatcctcgag gtcttcgctg tggtgcgctg aggag 35
<210> 13
<211> 426
<212> DNA
<213> 美洲驼(Lama glama)
<400> 13
atgggccaag gtgtccaggc tgaggtgcag ctcgtggagt ctgggggagg cttggtgcag 60
gctggggggt ctctgagact ctcctgtcaa gcctctggat tcactttcga cgatcctgcc 120
ataggctggt tccgccaggc cccagggaag gagcgtgagg gggtcgcgac tattagtatg 180
agtgatggta gcacattgta tgcagactcc gtgaaggggc gattcaccgt ctccagtgac 240
aacgccaaga acacggtgta tccgcaaatg aacagaatga gacctgagga cacggccgtt 300
tattactgtg cagcatctac tatagcgccc actctattgc gcggggccta tatcttccgc 360
ggggcctata tcttctgggg ccaggggacc caggtcaccg tctcctcagc gcaccacagc 420
gaagac 426