技术领域
本发明涉及一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用，属于基因工 程技术领域。
背景技术
谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)是生物合成γ- 氨基丁酸(GABA)的限速酶，催化谷氨酸脱羧形成CO2和GABA。谷氨酸脱羧 酶广泛存在于微生物，动物，人体，以及植物中。异源表达谷氨酸脱羧酶突出的 问题是，蛋白表达量低、谷氨酸脱羧酶活力低。因此，定点突变改造谷氨酸脱羧 酶，提高胞外酶活，对于提高谷氨酸脱羧酶工业化应用前景具有重要意义。
发明内容
本发明首先提供了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列是 SEQIDNO.1所示的序列。
编码所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。
本发明还提供了表达所述谷氨酸脱羧酶突变体的大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌 基因工程菌。
所述大肠杆菌基因工程菌的制备方法，是以SEQIDNO.2所示核苷酸序列 为模板，Flprimer(序列如SEQIDNO.3所示)，Rlprimer(序列如SEQIDNO.4所 示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.2所示的重组基因，将重组基因连接到 表达载体pET-28a得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到大肠 杆菌基因工程菌。
所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的制备方法，是以SEQIDNO.2所示核苷酸 序列为模板，Flprimer(序列如SEQIDNO.3所示)，Rlprimer(序列如SEQIDNO.4 所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.2所示的重组基因，将重组基因连接 到表达载体pXMJ9得到重组质粒，重组质粒转化到谷氨酸棒杆菌宿主菌中即得 到谷氨酸棒杆菌基因工程菌。
本发明在天然谷氨酸脱羧酶的基础上，通过定点突变生物技术改造谷氨酸脱 羧酶分子结构，突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高81％。突变体酶Y172C 的底物亲和力Km较突变前降低53％，在35℃下酶的半衰期由16h延长至24h。 本发明表明172位氨基酸残基对酶的催化作用和热稳定性有较大影响，对该酶的 催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得 可用于生物合成γ-氨基丁酸。
具体实施方式
实施例1含谷氨酸脱羧酶突变体的重组载体的构建
(1)Y172C突变体的获得：以SEQIDNO.2所示核苷酸序列为模板， Fprimer(序列如SEQIDNO.3所示)、Rprimer(序列如SEQIDNO.4所示)为引物， 进行PCR即得到SEQIDNO.2所示的重组基因。
(2)将重组基因与pET-28a分别用BamHI、EcoRI双酶切，纯化后用T4DNA 连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含 卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为 pET-28a-Y172C。测序工作由上海生工完成。
(3)将重组基因与pXMJ19分别用BamHI、EcoRI双酶切，纯化后用T4DNA 连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含 卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为 pXMJ19-Y172C。测序工作由上海生工完成。
实施例2产谷氨酸脱羧酶大肠杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pET-28a-Y172C化学法转化入E.coliBL21感受 态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需培养基如下(g/L)：
LB培养基：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。
(2)转化方法：
将10μL重组质粒pET-28a-Y172C加入到120μl感受态E.coilBL21中，于冰 上放置45min，42℃热击90s，放置冰上2min，加入800μlLB液体培养基，37℃ 摇床培养1h，离心，倒掉大部分上清液，留150μL与沉淀混匀，涂布到卡那霉 素平板(Km+LB)上，于37℃培养箱培养9h左右，挑去平板上的阳性菌落到 10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养。提取质粒，经酶切验证连接成功后， 将重组菌pET-28a-Y172C/E.coliBL21加入终浓度17％(w/v)的甘油，-20℃冰 箱保藏。
实施例3产谷氨酸脱羧酶谷氨酸棒杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pXMJ19-Y172C点击法转化入C. glutamicum13032感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需培养基如下(g/L)：
LBG培养基：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10，葡萄糖5。
(2)转化方法：
将10μL重组质粒pXMJ19-Y172C加入到120μl感受态C.glutamicum13032 中，于冰上放置5min，1800V电击5ms，放置冰上2min，加入800μlLBG液体 培养基，37℃摇床培养2h，离心，倒掉大部分上清液，留150μL与沉淀混匀， 涂布到卡那霉素平板(Km+LBG)上，于37℃培养箱培养20h左右，挑去平板 上的阳性菌落到10ml液体LBG培养基中，37℃摇床过夜培养。提取质粒，经酶 切验证连接成功后，将重组菌pXMJ19-Y172C/C.glutamicum13032加入终浓度 17％(w/v)的甘油，-20℃冰箱保藏。
实施例4重组菌pET-28a-Y172C/E.coliBL21谷氨酸脱羧酶高效表达及酶活测定。
(1)将实施例2构建的重组菌pET-28a-Y172C/E.coliBL21与表达未突变 的酶的对照菌株pET-28a-gad/E.coliBL21分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培 养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于大肠杆菌发酵培养基中， 37℃培养12h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液， 细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。
(2)大肠杆菌发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，葡萄 糖20g/L。调节pH6.8-7.0。
(3)酶活定义:酶活力单位(U)定义为在测定条件下每分钟产生1μmol GABA所需的酶量。
(4)谷氨酸脱羧酶酶活测定方法：谷氨酸脱羧酶(GAD)检测方法采用比 色法，取200μL底物溶液(0.2mol/L，pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液含L-谷氨酸钠 0.4mol/L)和100μL粗酶液37℃反应一定时间后加入200μL硼酸缓冲液(0.2 mol/L，pH9.0)终止反应，再依次加入6％苯酚1.0mL、次氯酸钠溶液400μL， 混匀后沸水浴10min，立即冰浴冷却20min至显色，测定光吸收值A630。
(4)结果表明重组菌pET-28a-Y172C/E.coliBL21表达的谷氨酸脱羧酶的 总酶活(胞内与胞外酶活的总和)为28.6U/mL，比对照菌株pET-28a-gad/E. coliBL21(15.8/mL)谷氨酸脱羧酶酶活提高81％。
(5)步骤(1)得到的胞外粗酶液经纯化后得到谷氨酸脱羧酶Y172Cgad， 分析纯化后的重组谷氨酸脱羧酶Y172Cgad酶学性质，如表1，底物亲和力Km较 突变前降低53％，同时比酶活提高83％，在35℃下酶的半衰期由16h延长至24h。
表1Y172Cgad反应动力学参数
实施例5重组菌pET-28a-Y172C/E.coliBL21和pXMJ19-Y172C/C. glutamicum13032在转化谷氨酸到GABA方面的应用。
(1)重组菌pET-28a-Y172C/E.coliBL21在转化谷氨酸到GABA方面的应 用
大肠杆菌摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5，NaCl 0.3，K2HPO40.1，MgSO47H2O0.05。在pH6.5～7.0、121℃下灭菌10min。
大肠杆菌发酵培养基(g/L)：葡萄糖5.0，蛋白胨10，玉米浆7.5，NaCl0.5， K2HPO40.1，MgSO47H2O0.05，L-谷氨酸1.0，生物素2×10-5。pH6.5～7.0、121℃ 下灭菌10min。
转化条件为：pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液、2.5mmol/LCa2+、3.5mmol/LMg2+， 转化温度37℃。
将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml)LB培养基中，于旋转式 摇床中37℃、160r/min培养12h进行活化，再以5％的接种量接入500ml摇瓶 (装液量为100ml)种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子液， 按10％的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)，先 于37℃、250r/min培养至OD600为0.6，再向其中添加乳糖至终浓度为1g/L， 30℃条件下诱导发酵14h至OD600为13.2。将培养好的菌体进行离心收集， 双蒸水洗涤三次，用乙酸-乙酸钠缓冲液悬浮菌体，在优化后的转化条件下，以 50g/L的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间 隔为每2h投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，12h后， 投料时间间隔延长到3h，在转速250r/min、通气量1vvm的条件下转化18h， 反应结束后转化液离心取上清，加入15％的三氯乙酸终止反应，取1ml进行适 当稀释后氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度为283.8g/L，转化率 达到99.8％。
(1)重组菌pXMJ19-Y172C/C.glutamicum13032在转化谷氨酸到GABA方 面的应用
谷氨酸棒杆菌摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米浆1.5， NaCl0.3，K2HPO40.1，MgSO47H2O0.05。在pH6.5～7.0、121℃下灭菌10min。
谷氨酸棒杆菌发酵培养基(g/L)：葡萄糖25，玉米浆30，KH2PO4·3H2O1.5， MgSO4·7H2O0.4，pH6.5～7.0、121℃下灭菌10min。
转化条件为：pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液、2.5mmol/LCa2+、3.5mmol/LMg2+， 转化温度37℃。
将斜面保藏的菌种接种至50ml(装液量为10ml)LBG培养基中，于旋转 式摇床中30℃、160r/min培养12h进行活化，再以5％的接种量接入500ml摇 瓶(装液量为100ml)种子培养基中培养菌体，按上述条件培养24h得到种子 液，按10％的接种量将培养好的种子液接入5L全自动发酵罐(装液量为3L)， 于30℃、250r/min培养至OD600为25.6。将培养好的菌体进行离心收集，双蒸 水洗涤三次，用乙酸-乙酸钠缓冲液悬浮菌体，在优化后的转化条件下，以25g/L 的投料量进行分批投料，前期由于酶活水平较高，反应速率较快，投料间隔为每 2h投料一次，随着反应的进行，酶活有所下降，反应速度变慢，12h后，投料 时间间隔延长到3h，在转速250r/min、通气量1vvm的条件下转化18h，反应 结束后转化液离心取上清，加入15％的三氯乙酸终止反应，取1ml进行适当稀 释后氨基酸自动分析仪测得转化液中产物GABA浓度为126.7g/L，转化率达到 99.6％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉 此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此 本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。