一种包含基孔肯雅病毒全基因组cDNA的DNA分子及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410471749.4 (22)申请日 2014.09.16 C12N 15/34(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院微 生物流行病研究所 地址 100071 北京市丰台区东大街 20 号 (72)发明人 李晓峰 秦成峰 邓永强 姜涛 (74)专利代理机构 北京润平知识产权代理。

2、有限 公司 11283 代理人 李婉婉 金迪 (54) 发明名称 一种包含基孔肯雅病毒全基因组 cDNA 的 DNA 分子及其用途 (57) 摘要 本发明公开了一种核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1所示的DNA分子及其用途， 包括标记基孔肯雅病 毒DRDE-06株的方法、 含有该DNA分子的重组质粒 及其构建方法、 基因组 RNA 对应的 cDNA 的核苷酸 序列如 SEQ ID NO ： 1 所示的基孔肯雅病毒的感染 性克隆及其构建方法。本发明的 DNA 分子或重组 质粒能够用于构建性能与野生型病毒相近的基孔 肯雅病毒的感染性克隆。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识。

3、产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表11页 附图2页 CN 105483139 A 2016.04.13 CN 105483139 A 1/1 页 2 1.一种包含基孔肯雅病毒全基因组 cDNA 的 DNA 分子， 其特征在于， 该 DNA 分子的核苷 酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 2.一种重组质粒， 其特征在于， 该重组质粒含有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列。 3.根据权利要求2所述的重组质粒， 其中， 所述重组质粒为在质粒pUC18的Sbf I酶切 位点和 Sap I 酶切位点之间依次连接有启动子序列、 SEQ ID NO ： 1。

4、 所示的核苷酸序列、 多聚 腺苷酸序列以及选择性含有的用于 PCR 鉴定的特异序列的重组质粒。 4.根据权利要求 3 所述的重组质粒， 其中， 所述启动子为 Sp6 启动子。 5.根据权利要求3或4所述的重组质粒， 其中， 用于PCR鉴定的特异序列如SEQ ID NO ： 3 所示。 6.一种构建重组质粒的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： (1) 通过化学合成法获得 DNA 片段 F1 和 DNA 片段 F2， 其中， DNA 片段 F1 的序列由启动 子序列和 SEQ ID NO ： 1 第 1-7733 位核苷酸所示的序列组成， DNA 片段 F2 的序列由 SEQ ID NO。

5、 ： 1 第 7310-11774 位核苷酸所示的序列、 多聚腺苷酸序列和选择性含有的用于 PCR 鉴定 的特异序列组成 ； (2) 使用 Sbf I 和 Sap I 对 DNA 片段 F1 进行酶切， 从而将酶切后的 DNA 片段 F1 插入 质粒 pUC18 的 Sbf I 酶切位点和 Sap I 酶切位点之间， 得到 pUC18-5， 使用 Sbf I 和 Sap I 对 DNA 片段 F2 进行酶切， 从而将酶切后的 DNA 片段 F2 插入质粒 pUC18 的 Sbf I 酶切位点 和 Sap I 酶切位点之间， 得到 pUC18-3 ； (3)使用BssH II和Sap I对pUC。

6、18-5和pUC18-3进行酶切， 进一步连接酶切所得的大 片段， 得到重组质粒 pCHIKV-FL。 7.一种基孔肯雅病毒的感染性克隆， 其特征在于， 该感染性克隆的基因组 RNA 对应的 cDNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 8.一种构建基孔肯雅病毒的感染性克隆的方法， 其特征在于， 该方法包括将权利要求 2-5 中任意一项所述的重组质粒进行体外转录， 将得到的转录体 RNA 转染敏感细胞。 9.根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 所述敏感细胞为 BHK-21 细胞。 10.一种标记基孔肯雅病毒 DRDE-06 株的方法， 其特征在于， 该方法包括将基孔肯雅病 。

7、毒 DRDE-06 株基因组 RNA 对应的 cDNA 的第 7522-7523 位核苷酸由 TT 突变为 GG。 权 利 要 求 书 CN 105483139 A 2 1/6 页 3 一种包含基孔肯雅病毒全基因组cDNA的DNA分子及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种 DNA 分子及其用途， 具体地， 涉及一种包含基孔肯雅病毒全基因 组 cDNA 的 DNA 分子、 标记基孔肯雅病毒 DRDE-06 株的方法、 含有该 DNA 分子的重组质粒及 其构建方法、 基孔肯雅病毒的感染性克隆及其构建方法。 背景技术 0002 基孔肯雅病毒(Chikungunya virus， CHIKV)属。

8、于披膜病毒科(Togaviridae)甲病 毒属 (Alphavirus)， 该属的成员还包括罗斯河病毒 (Ross River viruses)， 塞姆利基森林 病毒(Semliki forest virus)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus)等。 CHIKV的主要传播媒 介是埃及伊蚊 (Aedes aegypti) 和白纹伊蚊 (Ae.albopictus)， 可导致基孔肯雅热， 其发病 特征表现为发热， 肌肉痛和关节痛。尽管基孔肯雅热的死亡率较低， 但是近 50 年来其传播 范围迅速扩大， 已经由起初流行的东非地区迅速传播至欧洲、 亚洲和大洋洲地区。 特别是东 南亚地区的印度，。

9、 印度尼西亚， 泰国和越南等国家， 近 10 年来屡有基孔肯雅热的爆发流行。 我国在2006-2008年间仅有散发的输入性病例的报道， 但是2010年广东东莞地区爆发了一 次小规模的基孔肯雅热疫情。因此， 基孔肯雅热已成为一种严重威胁人类健康的再发传染 病， 但是目前仍然无有效的治疗药物和预防用疫苗。 0003 CHIKV 是一种包膜病毒， 基因组是长度约为 12 kb 的单股正链 RNA， 含有两个读码 框， 分别编码 3 个结构蛋白 ( 衣壳蛋白 C、 包膜蛋白 E1 和 E2) 和 4 个非结构蛋白 (nsP1-4)。 RNA 病毒的全长感染性 cDNA 克隆经体外转录后可获得具有感染性。

10、的病毒 RNA， 再转染细胞 后获得拯救病毒。这极大方便了我们对病毒基因组序列进行定向改造， 从而获得具有新性 状的突变病毒。通过比较野生病毒与突变病毒生物学性质的变化， 可以确定病毒关键的毒 力位点， 筛选出病毒关键的抗原表位， 为疫苗设计提供靶点。因此， 病毒的感染性全长 cDNA 克隆是深入研究病毒复制及致病机制的基础。 0004 合成生物学的基本原理是通过基因组数据库获得拟合成的目的基因信息， 再采用 体外化学合成的方法获得相应的基因序列， 进而将其导入特定细胞或组织中， 最终拯救获 得具有生物学活性的生命体。合成生物学为病毒的感染性克隆的构建方法开辟了新的方 向， 如通过全基因合成的。

11、方法获得了造成 1918 年大流感病毒株的基因组序列， 并成功拯救 出具有生物学活性的流感病毒， 有力地推动了流感病毒的生物学性质的研究。 0005 通过化学合成方法获得一个生命体的基因序列已成为目前生命科学领域的研究 热点， 极大地方便研究生命本质的同时， 也带来了许多问题。 人工合成一个自然界并不存在 的全新序列， 其生物学性质不得而知， 生物安全性评价亟待解决。一旦发生生物泄漏事故， 如何区分人工合成序列与自然进化的序列就显得尤为重要， 因此获取有效的区分方法意义 重大。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种突变的基孔肯雅病毒基因组 cDNA， 从而获得能够与野生 说 明 书 CN。

12、 105483139 A 3 2/6 页 4 的基孔肯雅病毒相区分的感染性克隆。 0007 为了区分人工合成和自然进化的生物基因序列， 本发明的发明人进行了大量实 验， 结果发现， 在特定位点引入了两个核苷酸突变(第7522-7523位突变为TT)， 不会影响病 毒的感染性等特征。 进一步通过序列比对发现， 上述突变在自然进化的序列中均未出现， 因 此是区分人工合成和自然进化的标签， 便于对该序列生物安全性的评价。 0008 因此， 为了实现上述目的， 第一方面， 本发明提供了一种包含基孔肯雅病毒全基因 组 cDNA 的 DNA 分子， 该 DNA 分子的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 。

13、1 所示。本发明提供的 DNA 分 子可用作基孔肯雅病毒的基因组感染性全长 cDNA 克隆， 且能够获得感染性与野生病毒相 当的基孔肯雅病毒。 0009 第二方面， 本发明提供了一种重组质粒， 该重组质粒含有SEQ ID NO ： 1所示的核苷 酸序列。 0010 所述重组质粒可以包括启动子等元件， 根据本发明优选的实施方式， 所述重组质 粒为在质粒 pUC18 的 Sbf I 酶切位点和 Sap I 酶切位点之间依次连接有启动子序列、 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列、 多聚腺苷酸序列以及选择性含有的用于 PCR 鉴定的特异序列 的重组质粒。 0011 更优选地， 所述启动子为 。

14、Sp6 启动子 ( 序列为 5 -GATTCCAATCTCGAGATTTAGGTGACA CTATAG-3 ， SEQ ID NO ： 2)。 0012 用 于 PCR 鉴 定 的 特 异 序 列 是 方 便 PCR 检 测 的 一 段 序 列， 属 于 重 组 质 粒 中 选 择 性 含 有 的 序 列， 进 一 步 优 选 地， 用 于 PCR 鉴 定 的 特 异 序 列 如 SEQ ID NO ： 3(5 -CCTCGACTGTGCCTTCTAAAT-3 ) 所示。 0013 所述多聚腺苷酸序列可以为常规的多聚腺苷酸序列， 如SEQ ID NO ： 4(5 -AAAAAAA AAAAAA。

15、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAT-3 ) 所示的序列。 0014 第三方面， 本发明提供了一种构建重组质粒的方法， 如图 1 所示， 该方法包括以下 步骤 ： 0015 (1) 通过化学合成法获得 DNA 片段 F1 和 DNA 片段 F2， 其中， DNA 片段 F1 的序列由 启动子序列和 SEQ ID NO ： 1 第 1-7733 位核苷酸所示的序列组成， DNA 片段 F2 的序列由 SEQ ID NO ： 1 第 7310-11774 位核苷酸所示的序列、 多聚腺苷酸序列和选择性含有的用于 PCR 鉴 定的特异序列组成 ； 0016 (2) 使用 Sbf I。

16、 和 Sap I 对 DNA 片段 F1 进行酶切， 从而将酶切后的 DNA 片段 F1 插 入质粒 pUC18 的 Sbf I 酶切位点和 Sap I 酶切位点之间， 得到 pUC18-5， 使用 Sbf I 和 Sap I 对 DNA 片段 F2 进行酶切， 从而将酶切后的 DNA 片段 F2 插入质粒 pUC18 的 Sbf I 酶切位点 和 Sap I 酶切位点之间， 得到 pUC18-3 ； 0017 (3) 使用 BssH II 和 Sap I 对 pUC18-5 和 pUC18-3 进行酶切， 进一步连接酶切所 得的大片段， 得到重组质粒 pCHIKV-FL。本发明的重组质粒 p。

17、CHIKV-FL 中， 在质粒 pUC18 的 Sbf I酶切位点和Sap I酶切位点之间依次连接有启动子序列、 SEQ ID NO ： 1所示的核苷酸 序列、 多聚腺苷酸序列以及选择性含有的用于 PCR 鉴定的特异序列。 0018 其中， 启动子序列、 多聚腺苷酸序列以及用于 PCR 鉴定的特异序列的具体选择如 前所述。化学合成 DNA 片段的方法包括液相合成法和固相合成法， 通常可委托专门的公司 (如上海英骏生物技术有限公司)进行合成， 在此不再赘述。 通过酶切法在质粒的特定酶切 说 明 书 CN 105483139 A 4 3/6 页 5 位点之间插入目的片段的具体操作步骤为本领域技术人。

18、员所熟知， 在此也不再赘述。 0019 第四方面， 本发明提供了一种基孔肯雅病毒的感染性克隆， 该感染性克隆的基因 组 RNA 对应的 cDNA 的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 0020 第五方面， 本发明提供了一种构建基孔肯雅病毒的感染性克隆的方法， 该方法包 括将第二方面所述的重组质粒进行体外转录， 将得到的转录体 RNA 转染敏感细胞。优选地， 所述敏感细胞为 BHK-21 细胞。 0021 第六方面， 本发明提供了一种标记基孔肯雅病毒 DRDE-06 株的方法， 该方法包 括将基孔肯雅病毒 DRDE-06 株基因组 RNA 对应的 cDNA 的第 7522-7523。

19、 位核苷酸由 TT 突变为 GG。基孔肯雅病毒 DRDE-06 株已在 “Santhosh,S.R.et al,Comparative full genome analysis revealed E1:A226V shift in 2007 Indian Chikungunya virus isolates,Virus Res.135(1) ： 36-41(2008)” 中公开。 0022 本发明具有如下优势 ： 0023 (1) 本发明基于化学合成技术构建了基孔肯雅病毒全长感染性 cDNA 克隆， 并成 功拯救出具有感染性的基孔肯雅病毒。本发明描述的方法具有构建流程短， 忠实病毒基因 组原序。

20、列等特点， 可作为构建单股正链 RNA 病毒感染性克隆的通用手段， 为病毒复制机理 和致病机制的研究提供有力的工具。本发明从 GenBank 数据库中选取一株基孔肯雅病毒 的全基因序列， 通过体外化学合成法获得了相应的 DNA 片段， 并将其连入常用的克隆质粒 pUC18， 最终获得了含有基孔肯雅病毒基因组全长 cDNA 的克隆。与传统构建 cDNA 克隆的方 法相比， 本发明采用的全基因合成技术完全基于基因数据库中的病毒序列， 无需以病毒基 因组模板进行 PCR 或 RT-PCR 扩增， 避免了该过程可能引入的突变， 因此能够获得完全忠实 于原序的病毒基因片段。同时， 本发明可以一次性合成长。

21、度约为 7000nt 的长 DNA 片段， 避 免了常规感染性克隆构建过程中将短片段连接为中长片段的繁琐流程， 显著提高了构建全 长 cDNA 克隆的效率。 0024 (2) 本发明以体外合成的基孔肯雅病毒基因组全长 cDNA 序列， 获得了具有感染性 的基孔肯雅病毒。该恢复病毒含有基孔肯雅病毒特异 RNA 序列， 能够使敏感细胞产生于野 生型病毒相似的病变， 同时还能形成与野生型病毒类似的空斑。 这表明， 本发明所用的全基 因合成手段获得的全长 cDNA 克隆能够成功拯救出病毒， 预示着该方法在基孔肯雅病毒感 染性克隆构建方面是可行和高效的， 为其他基孔肯雅病毒株的感染性克隆的构建开辟了新 。

22、的方向。 0025 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 附图说明 0026 附图是用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明， 但并不构成对本发明的限制。在附图中 ： 0027 图 1 为基孔肯雅病毒全长感染性 cDNA 克隆 ( 重组质粒 ) 构建示意图 ； 0028 图 2 为基孔肯雅恢复病毒 ( 基孔肯雅病毒的感染性克隆 ) 基因组的 RT-PCR 检测 结果图， 其中， 泳道 1 ： 以恢复病毒 cDNA 为模板扩增所得 DNA 片段， 大小约为 1200bp ； 泳道 2 ： 不加 cDNA 模板的空。

23、白对照 ； 泳道 3 ： 以野生型病毒 cDNA 为模板扩增所得 DNA 片段， 大小 约为 1200bp ； 泳道 4 ： 以全长感染性 cDNA 克隆 ( 重组质粒 ) 为模板扩增所得的 DNA 片段 ； 说 明 书 CN 105483139 A 5 4/6 页 6 泳道 M ： DNA Marker DL 2000 ； 0029 图 3 为基孔肯雅恢复病毒的致细胞病变效应结果图 ； 0030 图 4 为基孔肯雅恢复病毒的空斑形态图。 具体实施方式 0031 以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是， 此处所 描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本。

24、发明。 0032 以下实施例中， 基孔肯雅野生型病毒 GD05/2010 株已在 “Li,X.F.et al,Complete genome sequence of a chikungunya virus isolated in guangdong,China. J.Virol.86(16):8904-8905(2012)” 中公开 ； Sp6 启动子序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 用于 PCR 鉴定的特异序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 多聚腺苷酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 使用的 限制性内切酶均购自 NEB 公司 ； 感受态大肠杆菌 DH5 购自。

25、天根生化科技 ( 北京 ) 有限公 司， 产品目录号为 CB101-01 ； BHK-21 细胞购自 ATCC， 产品目录号为 CCL-10 ； 使用的培养液 (OPTI-MEM 和 DMEM) 均购自 Life Technologies ； 化学合成 DNA 片段和 DNA 测序委托上海英 骏生物技术有限公司完成。 0033 实施例 1 0034 本实施例用来说明本发明构建基孔肯雅病毒基因组全长 cDNA 克隆的方法。 0035 (1) 通过化学合成法获得 DNA 片段 F1 和 DNA 片段 F2， 其中， DNA 片段 F1 的序列由 启动子序列和 SEQ ID NO ： 1 第 1-7。

26、733 位核苷酸所示的序列组成， DNA 片段 F2 的序列由 SEQ ID NO ： 1 第 7310-11774 位核苷酸所示的序列、 多聚腺苷酸序列和用于 PCR 鉴定的特异序列 组成 ； 0036 (2) 使用 Sbf I 和 Sap I 对 DNA 片段 F1 进行酶切， 从而将酶切后的 DNA 片段 F1 插 入质粒pUC18的Sbf I酶切位点和Sap I酶切位点之间， 得到pUC18-5， 使用Sbf I和Sap I 对DNA片段F2进行酶切， 从而将酶切后的DNA片段F2插入质粒pUC18的Sbf I酶切位点和 Sap I 酶切位点之间， 得到 pUC18-3， 将 pUC1。

27、8-5 和 pUC18-3 转化至感受态大肠杆菌 DH5， 质粒经 DNA 测序鉴定为正确序列 ； 0037 (3)使用BssH II和Sap I对pUC18-5和pUC18-3进行酶切， 进一步连接酶切所得 的大片段， 得到重组质粒 pCHIKV-FL。得到的重组质粒 pCHIKV-FL 中， 在质粒 pUC18 的 Sbf I 酶切位点和 Sap I 酶切位点之间依次连接有启动子序列、 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序 列、 多聚腺苷酸序列以及用于 PCR 鉴定的特异序列。将重组质粒 pCHIKV-FL 转化至感受态 大肠杆菌 DH5， 经 DNA 测序鉴定为含有序列如 SEQ 。

28、ID NO ： 1 所示的序列 ( 突变的基孔肯 雅病毒基因组全长 cDNA) 的重组质粒。 0038 实施例 2 0039 本实施例用来说明利用全长 cDNA 克隆拯救基孔肯雅恢复病毒的方法。 0040 (1) 基孔肯雅病毒基因组全长 cDNA 克隆的体外转录 0041 用质粒中提试剂盒 (Qiagen 公司产品 ) 抽提质粒 pCHIKV-FL， 经 Sac I 酶切后再 用酚氯仿抽提， 将线性化质粒定量并分装后 -20冻存待用。以线性化后的全长 cDNA 克隆 质粒为模板， 用 SP6 RiboMAX Express Large ScaleRNA Production Systems(P。

29、romega 公 司产品 ) 按照试剂盒说明书进行体外转录。进一步依照 RNeasy Mini Kit(Qiagen 公司产 说 明 书 CN 105483139 A 6 5/6 页 7 品 ) 操作说明纯化体外转录体 RNA 后并定量， 分装置 -80冻存待用。 0042 (2) 基孔肯雅恢复病毒的拯救 0043 用脂质体 Lipofectamin 2000( 购自 Invitrogen 公司 ) 将步骤 (1) 获得的转录体 RNA 转染单层 BHK-21 细胞 ( 汇合度为 80 )， 方法如下 ： 首先将 50l 的 OPTI-MEM 与 4l 脂质体混匀， 于室温放置 5min 后再。

30、与 10l 的 RNA(5g) 和 50l 的 OPTI-MEM 混合， 室温 放置 20min。将上述混合液加入到 6 孔板中的 1 孔， 同时补加 450l 的 OPTI-MEM。37、 5 CO2孵育 6h。移去上清， 补加含有 2 体积的 FBS 的 DMEM 培养基， 置 37、 5 CO2孵箱 中。转染后第 4 天， 细胞出现病变， 离心收集培养液上清。将上清重新接种于 BHK-21 细胞， 接种后第 3 天细胞出现病变， 离心收集上清。冻存于 -80， 作为恢复病毒种子液， 命名为 R-CHIKV。 0044 测试例 1 0045 本测试例用来检测基孔肯雅恢复病毒的基因组序列。 。

31、0046 (1) 基孔肯雅恢复病毒 RNA 的提取 0047 按照 RNeasy 试剂盒 (Qiagen 公司产品 ) 说明提取恢复病毒种子液 R-CHIKV 基因 组 RNA。提取步骤如下 ： 将 210l 病毒悬液与 700l 的 RLT(RNeasy Lysis Buffer) 和 7l 的 - 巯基乙醇 (-mercaptoethanol) 的混合液震荡混匀， 加 490l 无水乙醇后剧 烈混匀， 得到裂解液， 将裂解液加入吸附柱， 12000rpm离心15s ； 700l的RW1(RNeasy Wash Buffer) 洗柱一次， 12000rpm 离心 15s ； 500l RPE。

32、(RPE 是 RNeasy 试剂盒中的洗涤液 ) 洗 柱 2 次， 10000rpm 离心 30s ； 空柱 10000rpm 离心 1min。加 50l 无 RNase 的水， 静置 2min， 12000rpm 离心 1min。加 2l 的 RNase 抑制剂。混匀后置 -80待用。 0048 (2) 基孔肯雅恢复病毒 RNA 的 RT-PCR 扩增和序列测定 0049 以反转录引物 R-11777( 序列为 5 -TTTGTGTGGTTTCGAAATCGT-3 ， SEQ ID NO ： 5) 制备基孔肯雅恢复病毒 R-CHIKV 基因组的 cDNA。反转录反应的组分如下 ： R-CHI。

33、KV 基因组 RNA 15l ； R-11777(10M)1.25l ； dNTP(2.5mM each)10l ； 水 ( 不含 RNase)6.25l。 将上述反应组分混合均匀， 置 65下 5min， 冰浴 2min。补加如下组分 ： 5first-strand buffer 10l ； DDT(0.1mM)2.5l ； RNase抑制剂2.5l ； Super Script III 2.5l。 55 下 60min ； 70下 15min。加 1l(2U)RNase H， 37下 20min。-20保存待用。 0050 用获得的 cDNA 作为模板， 用 LA Taq DNA 聚合酶 。

34、(TaKaRa 公司产品 ) 进行 PCR 扩 增。所用上下游引物分别为 CHIKV-F6(5 -GACAATGGCAGAAGGAATTTC-3 ， SEQ ID NO ： 6) 和 CHIKV-R6(5 -TGTGTGTCGCCCCGTCGTCTA-3 ， SEQ ID NO ： 7)。上述引物扩增基孔肯雅病毒的 非结构蛋白编码区。 PCR反应体系组成如下 ： 10LA Buffer 5l ； 上游引物(10M)2l ； 下游引物(10M)2l ； dNTP(2.5mM each)8l ； cDNA 3l ； LA Taq DNA聚合酶0.5l ； 水 29.5l。 反应条件如下 ： 94变。

35、性4min， 9430s、 60退火30s、 72延伸3min 50s， 30个 循环， 再置于 72下 10min。1琼脂糖凝胶检测 PCR 产物长度， 用 PCR 纯化试剂盒回收所 得的 PCR 片段并测序。琼脂糖凝胶的检测结果显示， 以恢复病毒 cDNA， 野生型病毒 cDNA 以 及全长感染性克隆质粒为模板， 均可以扩增获得大小约为 1200bp 的特异的 DNA 片段， 与预 期一致(如图2所示)。 测序的结果也显示， 上述片段为基孔肯雅病毒的非结构蛋白特异的 编码区。这些结果表明， 所获得的恢复病毒含有基孔肯雅病毒特异的基因序列。 0051 测试例 2 说 明 书 CN 10548。

36、3139 A 7 6/6 页 8 0052 本测试例用来说明基孔肯雅恢复病毒的致细胞病变效应。 0053 将基孔肯雅恢复病毒种子液 R-CHIKV 以及基孔肯雅野生型病毒 GD05/2010 株 (CHIKV-GD05/2010) 分别接种于铺于 6 孔板的单层 BHK-21 细胞 ( 汇合度为 90 )。吸附 1h 后， 移去病毒液， 弃去病毒液， 添加含 2 体积的 FBS 的 DMEM 培养基， 置于 37、 5 CO2 的孵箱中培养。每天观察细胞形态的变化。结果显示， BHK-21 细胞在感染恢复病毒或野生 型病毒后的第 3 天均出现细胞圆缩、 裂解和脱落 ( 如图 3 所示 )。这表。

37、明恢复病毒能够使敏 感细胞产生细胞病变， 病变进程与野生型病毒相似。 0054 测试例 3 0055 本测试例用来说明基孔肯雅恢复病毒的空斑形态。 0056 用 2的 FBS 的 DMEM 将病毒种子液以 10 倍比稀释为 10-4， 以 500l/ 孔接种于铺 于 6 孔板的单层 BHK-21 细胞 ( 汇合度为 90 )。吸附 2h 后， 弃去病毒液， 添加含有 DMEM 培 养基 ( 含 2 体积的 FBS) 的 1 (1g/100mL) 的琼脂盖， 置于 37、 5 CO2的孵箱中培养。 3 天后用 4甲醛室温固定 1h， 弃琼脂盖， 结晶紫室温染色 10min， 观察空斑形态。以相同。

38、方 法对基孔肯雅野生型病毒 GD05/2010 株的空斑进行分析。空斑试验的结果如图 4 所示， 基 孔肯雅恢复病毒和野生型病毒均能形成大小均一， 边缘清晰的空斑。 上述结果表明， 基孔肯 雅恢复病毒与野生型病毒具有相似的增殖特征。 0057 从以上测试例的结果可以看出， 本发明的 DNA 分子或重组质粒能够用于拯救获得 与野生型病毒相近的基孔肯雅病毒。 0058 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型， 这些简单变型均属于本发明的保护范围。 0059 另外需要说明的。

39、是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0060 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说 明 书 CN 105483139 A 8 1/11 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 105483139 A 9 2/11 页 10 0003 序 列 表 CN 105483139 A 10 3/11 页 11 0004 序 列 表 CN 105483139 A 11 。

40、4/11 页 12 0005 序 列 表 CN 105483139 A 12 5/11 页 13 0006 序 列 表 CN 105483139 A 13 6/11 页 14 0007 序 列 表 CN 105483139 A 14 7/11 页 15 0008 序 列 表 CN 105483139 A 15 8/11 页 16 0009 序 列 表 CN 105483139 A 16 9/11 页 17 0010 序 列 表 CN 105483139 A 17 10/11 页 18 0011 序 列 表 CN 105483139 A 18 11/11 页 19 序 列 表 CN 105483139 A 19 1/2 页 20 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105483139 A 20 2/2 页 21 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105483139 A 21 。