技术领域
本发明涉及光动力学疗法天然光敏剂技术领域，尤其涉及一 种第二代光敏剂叶绿三酸Chlorine6的高效高纯度制备方法。
背景技术
叶绿三酸Chlorine6及其衍生物属于光动力学疗法的第二代 光敏剂。Chlorine6是源自叶绿素的天然分子，具有光激发三线态寿 命长，在可见光的红区具有较高的摩尔吸光系数，与其他卟啉类光敏 剂相比价格低廉，其研究应用处于临床试验阶段。
Chlorine6一般通过叶绿素a碱性水解转化获得，商品化的 Chlorine6的制备方法中涉及叶绿素的柱层析法分离提纯，叶绿素a 的得率较低，获得的Chlorine6纯度一般93％～98％。
本发明不需要采用柱层析法分离提纯叶绿素或叶绿三酸，无 柱层析损失，叶绿素a利用效率高，最终获得的叶绿三酸Chlorine6 产率高。
钝顶螺旋藻是蓝藻的一种，本发明以钝顶螺旋藻为原料，制 备的Chlorine6不含叶绿素a以外的其它叶绿素转化的叶绿酸，HPLC 纯度大于99.5％。
发明内容
本发明针对商品化叶绿三酸Chlorine6产率和纯度较低的问 题，提出了一种高效高纯度Chlorine6的制备方法。
本发明采取的技术方案是：
本发明高纯度叶绿三酸Chlorine6制备方法的具体步骤如 下：
⑴以培养至对数生长期末期的钝顶螺旋藻为原料，离心收集 藻体。
⑵藻体用乙醇萃取数次，萃取液合并。
⑶萃取液中加入适量石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入 萃取液1/5～1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取数次， 含色素的石油醚相用水－乙醇溶液(体积比1:1)洗涤数次。
⑷石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液，搅 拌反应0.5～6h。
⑸往上述混合液中加入去离子水，旋荡后静置分离，上层石 油醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油 醚洗涤数次，至洗涤液无色。
⑹滴加5mol/L盐酸中和，离心分离沉淀，沉淀用去离子水 洗涤数次。
⑺沉淀用少量去离子水分散悬浮，-80℃速冻后冷冻干燥， 获得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。
⑻在上述步骤⑹中，5mol/L盐酸中和后，加入二氯甲烷溶剂 萃取，萃取液用去离子水洗涤数次。
⑼采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸 Chlorine6固体。
本发明制备的Chlorine6不含叶绿素a以外的其它叶绿素转 化的叶绿酸，HPLC纯度大于99.5％。
附图说明
图1为实施例4所得叶绿三酸Chlorine6的结构图。
图2为实施例4碱催化反应后石油醚相类胡萝卜素溶液的吸 收光谱。
图3为实施例4碱催化反应后水-乙醇相含镁叶绿三酸钠盐的 吸收光谱。
图4为实施例4所得产品叶绿三酸钠盐乙醇溶液的吸收光 谱。
图5为实施例4所得产品叶绿三酸乙醇溶液的吸收光谱图。
图6为实施例4所得产品的基质辅助激光解吸电离飞行时间 (MALDI-TOF)质谱图。基质中的三氟乙酸使得叶绿三酸带正电， 分子离子峰([M+H]+)的质荷比m/z为597.541，与叶氯三酸的理论 分子量596.67一致。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步描述。
实施例1
本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤 如下：
取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离 藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用50mL乙醇萃 取三次，萃取液合并。
萃取液中加入20mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入 萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含 色素的石油醚相用20mL水－乙醇溶液(体积比1:1)洗涤两次。
石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL， 搅拌反应0.5h。
往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油 醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚 洗涤两次。
滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，离心分离沉淀，沉淀用 去离子水洗涤两次。
沉淀用少量去离子水分散悬浮，-80℃速冻后冷冻干燥，获 得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。
实施例2
本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤 如下：
取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离 藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用40mL乙醇萃 取三次，萃取液合并。
萃取液中加入15mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入 萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含 色素的石油醚相用0.5mol/LNaOH的水－乙醇溶液(体积比1:1)15 mL快速洗涤两次。
石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL， 搅拌反应2h。
往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油 醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚 洗涤两次。
滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，离心分离沉淀，沉淀用 去离子水洗涤两次。
沉淀用少量去离子水分散悬浮，-80℃速冻后冷冻干燥，获 得叶绿三酸Chlorine6固体粉末。
实施例3
本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤 如下：
取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离 藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用50mL乙醇萃 取三次，萃取液合并。
萃取液中加入20mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入 萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含 色素的石油醚相用20mL水－乙醇溶液(体积比1:1)洗涤两次。
石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL， 搅拌反应3h。
往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油 醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚 洗涤两次。
滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，加入二氯甲烷溶剂萃取， 萃取液用去离子水洗涤数次。
采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸 Chlorine6固体。
实施例4
本发明的高纯度叶绿三酸Chlorine6的制备方法的具体步骤 如下：
取生长至对数生长期后期的钝顶螺旋藻藻液1L，离心分离 藻体，弃去上清液，沉淀富集在1个离心管中，然后用40mL乙醇萃 取三次，萃取液合并。
萃取液中加入15mL石油醚(沸程60～90℃)混匀，再加入 萃取液1/3体积的水，旋荡后进行反萃取，石油醚重复萃取两次，含 色素的石油醚相用0.5mol/LNaOH的水－乙醇溶液(体积比1:1)15 mL快速洗涤两次。
石油醚萃取液中加入1mol/LNaOH的95％乙醇溶液10mL， 搅拌反应6h。
往上述混合液中加入10mL水，旋荡后静置分离，上层石油 醚相含有类胡萝卜素呈橙黄色，下层蓝绿色的水－乙醇溶液用石油醚 洗涤两次。
滴加5mol/L盐酸中和至pH约为5，加入二氯甲烷溶剂萃取， 萃取液用去离子水洗涤数次。
采用旋转蒸发的方法回收二氯甲烷，得到密实的叶绿三酸 Chlorine6固体。
尽管已经示出了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人 员而言，可以根据上述说明对这些实施例进行改进或变换，而这些改 进或变换都应属于本发明所述权利要求的保护范围。