技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及GPC3-HBsAg重组蛋白及其编码核苷酸和应用。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的 新家族。迄今已报告有五种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，磷脂酰肌醇蛋白 聚糖2，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖4，和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)是磷脂 酰肌醇蛋白聚糖家族的成员。该家族的成员有大小均一(约60kDa)的核心蛋白，共有特异、 高度保守的半胱氨酸序列，并通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结合到细胞膜上。
Motomura等人发现GPC3在小鼠体内可诱导出GPC3特异性的抗肿瘤免疫，但GPC3 不会在小鼠体内导致自身免疫疾病的发生。同时发现，具有GPC3特异性的杀伤性T细胞 (CTL)可以向表达GPC3的肿瘤组织发生定向迁移，而不引起自身免疫性的破坏。因此， GPC3诱导的特异性CTL定向移动发挥抗肿瘤免疫作用可以作为治疗HCC及黑色瘤的一种 可能手段。并通过实验证实CTL表位可在小鼠体内被CTL所识别并诱导特异性的细胞免疫， 该发现对以GPC3为靶点的肿瘤免疫治疗有重要的意义。
HBsAg疫苗与传统的疫苗相比具有如下优点：1.无需免疫佐剂，即能诱导出高效而特 异的细胞免疫和体液免疫；2.HBsAg本身不能复制，也无感染性；3.HBsAg在体外能被大 量扩增，并易于浓缩和纯化。上述特点表明，HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性，但无 其缺点。以特异性的外源抗原(基因)插入HBsAg或以外源CTL表位替代HBsAg上特异性 的内源CTL表位能否在体内诱导出高效而特异的细胞免疫，越来越成为疫苗研究的热点。现 已证明，在保留其有效的包装蛋白表位基础上，在HBsAg基因开放性阅读框架(openreading frame，ORF)上定位突变掉内源性CTL表位并建立核酸内切酶酶切位点，构建好的重组质 粒允许插入一个或多个外源表位，在保留HBsAg部分生物学和免疫学特性的基础上，还能 保证外源性表位具有免疫活性。
非专利文献王文敬等，GPC-3CTL表位表达载体构建，南方医科大学学报，2009，29 (8)，1548-1550；公开了一种构建编码GPC3-HBsAg重组蛋白表达载体，其采用GPC3的 CTL表位分别替换HBsAg中的FLG、LLD和SIL表位而获得表达载体，并具有一定免疫原 性。但是，本领域中HBsAg存在多个CTL表位，替换的表位不同，免疫原性相差较大，因 此选择合适的HBsAg的CTL表位用于替换，对获得的重组蛋白的免疫原性具有决定性的影 响。
发明内容
本发明的第一方面是提供一种GPC3-HBsAg重组蛋白，其以重组的乙肝表面抗原(HBsAg) 为分子骨架，利用外源CTL表位替换HBsAg内源性CTL表位；所述其他外源CTL表位为 GPC3的CTL表位。
在本发明的一个优选实施方案中，在所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)中，一个、二 个、三个或更多个HBsAg内源性CTL表位被一个、二个、三个或更多个GPC3的CTL表位 所替换。
在本发明的另一个实施方案中，所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；在所述SEQIDNO：1序列中，HBsAg内源性CTL表位相应地被GPC3CTL 表位所替换。
在本发明的另一个实施方案中，所述编码HBsAg内源性CTL表位选自下表中的一个、 二个、三个或更多个表位，具体如表1所示：
表1HBsAg蛋白中内源性CTL表位
在本发明的一个优选的实施方案中，所述HBsAg内源性CTL表位选自包含VLQ表位 的一个或更多个表位，进一步地所述HBsAg内源性CTL表位选自VLQ以及FLL、LLC、LLD、 LLV、SIL和/或LLP表位中的一个、二个、三个或更多个表位。
所述GPC3CTL表位选自下表中一个、二个、三个或更多个表位，具体如表2所示：
表2GPC3CTL表位
表位氨基酸序列 位置 SFFQRLQPGL 40-49 FFQRLQPGL 41-49 RLQPGLKWV 44-52 FLIIQNAAV 102-110 MFKNNYPSL 129-137 FVGEFFTDV 144-152 FTDVSLYIL 148-157 YILGSDINV 155-163 ELFDSLFPV 169-177 KFSKDCGRML 247-256 RMLTRMWYC 254-262 WYCSYCQGL 260-268 VMQGCMAGV 281-289 KYWREYILSL 294-303 EYILSLEEL 298-306 IYDMENVLL 313-321 TIHDSIQYV 326-334 AYYPEDLFI 360-368 FYSALPGYI 401-409 RFLAELAYDL 521-530 FLAELAYDL 522-530
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述GPC3CTL表位选自FVGEFFTDV、 YILGSDINV、FLAELAYDL和/或RMLTRMWYC中一个或多个表位。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDNO：2所示，其为 采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位VLQ、LLD和SIL得到的 重组蛋白。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDNO：3所示，其为 采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位VLQ和LLD得到的重组蛋 白。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDNO：4所示，其为 采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位VLQ和SIL得到的重组蛋 白。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述重组蛋白序列如SEQIDNO：5所示，其为 采用GPC3CTL表位FVGEFFTDV替换HBsAg内源性CLT表位VLQ得到的重组蛋白。
本发明的第二方面是提供编码上述重组蛋白的核苷酸序列。在本领域中，根据上述重组 蛋白的氨基酸序列而获得编码核苷酸序列是本领域技术人员已知的，例如，根据密码子规则 获得编码上述重组蛋白的RNA或DNA序列，例如，编码SEQIDNO：1氨基酸序列的核苷 酸序列如SEQIDNO：6所示。
本发明的第三方面是所述重组蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。
本发明的第四方面是所述重组蛋白在制备治疗/预防肿瘤药物中的应用。
本发明中所述肿瘤的种类没有特别限定，优选为表达GPC3的肿瘤，具体选自，包括但 不限于食道癌、乳癌、甲状腺癌、直肠癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤(黑素瘤)、恶性淋巴瘤、 骨肉瘤、成嗜铬细胞瘤、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、脑瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性 白血病、肾癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌或肉瘤 等。
具体实施方式
下面将举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案 的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的 内容为准。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南 (SambrookJ，etal.2008.MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rdEd.)中所述的条件，或 按照制造厂商所建议的条件来进行。
实施例1重组HBsAg载体质粒的构建
根据基因工程技术，采用PCR定位突变技术对HBsAg基因进行改造，从而获得一段改 良的HBsAg基因片段，其序列如SEQIDNO：6所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO： 1所示。然后，将上述HBsAg基因片段插入pcDNA3.1+质粒中，从而获得重组HBsAg载体 质粒。
上述HBsAg基因片段也可以通过合成获得，并通过PCR技术进行大量扩增。
实施例2编码重组蛋白的DNA分子及表达载体的构建
(1)SOEingPCR扩增
按照非专利文献王文敬等，GPC-3CTL表位表达载体构建，南方医科大学学报，2009， 29(8)，1548-1550公开的方法；以构建好的重组HBsAg质粒为模板，进行SOEingPCR扩 增。
PCR反应体系：ddH2O21μl，5×PCRBuffer8μl，dNTPs(10mmol/L)1μl，模板DNA 1μl(100ng)，引物组(每个引物对的浓度为10μmol/L)4μl，Elongase1μl。反应条件：94℃ 5s预变性，94℃10s，55℃20s循环扩增25次，72℃30s延长。
从而获得表位替换的重组DNA分子。
(2)将重组GPC3/HBsAg的DNA分子克隆至pBSSK+载体
将重组DNA分子用酚/氯仿法抽提1次，用乙醇/醋酸钠沉淀。纯化的DNA用T4连接 酶，按常规方法连至pBSSK+载体。具体操作参照pBSSK+Vector说明书。转化DH5α感受 态细胞，蓝白斑筛选，挑取单克隆培养，抽提质粒，进行PCR鉴定，EcoRI、BamHI双 酶切鉴定。鉴定正确的克隆pBSSK/GPC3用Plasmidmidi法抽提质粒后，送测序。测序结果 显示HBsAg基因中内源性表位序列位置已被GPC3CTL表位序列替换，且原序列中无错配碱 基。
本实施例中，编码HBsAg内源性表位和GPC3CTL表位的核苷酸序列如下：
表3HBsAg蛋白中内源性CTL表位及编码表位的DNA序列
表4GPC3CTL表位及编码表位的DNA序列
表位氨基酸序列 编码表位的DNA序列 SFFQRLQPGL TCCTTCTTCCAGAGACTGCAGCCCGGACTC FFQRLQPGL TTCTTCCAGAGACTGCAGCCCGGACTC RLQPGLKWV AGACTGCAGCCCGGACTCAAGTGGGTG FLIIQNAAV TTCTTAATTATTCAGAATGCTGCGGTT MFKNNYPSL ATGTTCAAGAACAACTACCCAAGCCTG FVGEFFTDV TTTGTGGGTGAATTTTTCACAGATGTG FTDVSLYIL TTTTTCACAGATGTGTCTCTCTACATCTTG YILGSDINV TACATCTTGGGTTCTGACATCAATGTA ELFDSLFPV GAATTGTTTGACAGCCTGTTTCCAGTC KFSKDCGRML AAGTTCAGTAAGGACTGTGGCCGAATGCTC RMLTRMWYC CGAATGCTCACCAGAATGTGGTACTGC WYCSYCQGL TGGTACTGCTCTTACTGCCAGGGACTG VMQGCMAGV GTCATGCAAGGCTGTATGGCAGGTGTG KYWREYILSL AAGTACTGGAGAGAATACATTCTGTCCCTT EYILSLEEL GAGTACATCCTGAGCCTGGAGGAGCTG IYDMENVLL ATCTATGACATGGAGAACGTACTGCTT TIHDSIQYV ACAATCCATGATTCTATCCAGTATGTC
AYYPEDLFI GCTTATTATCCTGAAGATCTCTTTATT FYSALPGYI TTCTATAGTGCTTTGCCTGGCTACATC RFLAELAYDL CGCTTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTG FLAELAYDL TTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTG
获得的重组DNA分子以及其编码的氨基酸序列如下表所示：
实施例3重组DNA分子的蛋白表达
(1)将实施例2制备的重组DNA分子克隆入分泌型表达载体pPICZαA，构建 GPC3-HBsAg表达质粒pPICZαA-GPC3-HBsAg。
(2)表达质粒pPICZαA-GPC3-HBsAg传入毕赤酵母GS115中，用不同浓度G418筛选 出不同拷贝重组质粒的毕赤酵母GS115，筛选出表达量最高的一株
(3)含高效分泌表达质粒pPICZαA-GPC3-HBsAg的毕赤酵母GS115高密度发酵，上罐 发酵表达达到200mg/L。
(4)GPC3-HBsAg重组蛋白分离及纯化。浓缩，硫酸铵分级沉淀，phenyl疏水层析和Q离 子交换，得到高纯度的GPC3-HBsAg重组蛋白。SDS-PAGE检测纯度大于95％。氨基酸测序 表明GPC3-HBsAg重组蛋白序列如SEQIDNO：2-5和16-20所示。
实施例4重组蛋白的体外免疫活性试验
取HLA-A2.1/Kb转基因小鼠，随机分组，分别免疫实施例5制备的重组蛋白，免疫方法 如下：第一次用重组蛋白(20mg/只)；腹腔注射小鼠；1周后(第8天)用重组蛋白(20mg/只)腹 部皮下多点注射小鼠，2周后(第15天)用重组蛋白(20mg/只)皮下多点注射免疫；3周后(第 22天)用重组蛋白(10mg/只)尾静脉注射加强免疫一次；对照组给予生理盐水，免疫方法同上。 具体如下：
最后一次免疫后第7天，以淋巴细胞分离液分离脾细胞，以免疫后小鼠的脾细胞为杀伤 细胞，表达GPC3的肿瘤细胞为靶细胞，进行细胞毒试验，大致方法如下：将靶细胞置96孔 板，加入[3H]-TdR(37kBq/孔)于37℃、5％CO2培养24h；加入杀伤细胞，使杀伤细胞和靶细 胞比例为50∶1，于37℃、5％CO2培养24h；分别收集每孔细胞，以液闪计数仪(1205Betaplate TMliquidscintillationcounter)检测每分钟计数(CPM)。
效应细胞对靶细胞的杀伤率表达为：杀伤率＝(细胞毒实验前靶细胞cpm-细胞毒实验后 活靶细胞cpm)/细胞毒实验前靶细胞cpm×100％
结果如下：
附注：Huh7、HepG2及WM35肿瘤细胞均表达GPC3，LOVO及HOS8603细胞均不表达GPC3。
另外，处死小鼠前，分别测定小鼠体重、肝脏及肾脏重量，计算小鼠肝脏指数和肾脏指 数，结果表明，本发明的重组蛋白与对照组小鼠相比，小鼠肝脏指数和肾脏指数无明显变化。
实施例5重组蛋白的体内抗肿瘤试验
收集对数生长期的HepG2细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×107/ml，经检疫 观察1周的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠于右侧背部碘伏消毒，在每只皮下接种1×107细胞悬液， 以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准。皮下接种1周后均成瘤，成瘤率100％。然后尾静脉 注射重组蛋白的生理盐水(5mg/kg)溶液，5天后以相同剂量在注射一次重组蛋白，模型组 给予等量的生理盐水，末次给药14天后，处死小鼠，测定裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量，具体结 果如下：
分组 肿瘤体积(cm3) 肿瘤重量(g) 模型组 1.37±0.16 1.23±0.13 SEQ ID NO：2 0.44±0.07 0.39±0.09 SEQ ID NO：3 0.58±0.11 0.56±0.07 SEQ ID NO：4 0.55±0.14 0.51±0.11 SEQ ID NO：5 0.61±0.13 0.59±0.08 SEQ ID NO：16 0.62±0.11 0.57±0.09 SEQ ID NO：17 0.81±0.12 0.77±0.12 SEQ ID NO：18 0.98±0.15 0.94±0.09 SEQ ID NO：19 1.13±0.16 1.02±0.12 SEQ ID NO：20 0.92±0.12 0.87±0.11
另外，经BALB/c小鼠的毒理学实验显示，本发明制备的GPC3-HBsAg重组蛋白对其生长、 发育、生殖及重要器官的结构和功能均无不良影响。
此外，本发明采用实施例2-5类似的方法，对重组蛋白进行了研究，区别仅在于采用的 GPC3CTL表位不同；具体为采用YILGSDINV、FLAELAYDL或RMLTRMWYC等GPC3CTL 表位来替换HBsAg内源性表位，获得的重组蛋白活性与实施例4和5的结果类似，替换VLQ 表位的重组蛋白的活性明显优于其他表位替换的重组蛋白，结果存在统计学差异。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案 中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方 案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体 记载一样。