技术领域：
本发明涉及与猪产仔数性状相关的分子标记，具体涉及猪6号染色体上一个 与产仔数相关的分子标记及其引物，属生物技术领域。
背景技术：
猪的产仔数性状是猪繁殖性状的主要组成部分，提高猪产仔数对提高养猪业 的总体经济效益意义重大。但产仔数属于遗传力很低的数量性状，难以用常规育 种技术进行遗传改良。我国的太湖猪以高产而闻名，窝产仔数比大多数其它中国 地方猪种以及国外猪种的窝产仔数多4-5头（《中国猪品种志》张仲葛主编，上 海科技出版社，1986）。二花脸猪是太湖猪的一种，是世界上繁殖力最高的猪种。 太湖猪中与高产仔数相关的多态位点，能够作为遗传标记用于提高母猪的产仔 数。
国内外研究人员采用全基因组扫描和候选基因的方法对产仔数性状进行 QTL定位及候选基因的研究。Li等人(Li,K.,J.Ren,etal.AnimGenet.2009.40(6): 963-966)利用覆盖了猪19条染色体的183个微卫星标记对与猪产仔数相关的总 产仔数，产活仔数，产死仔数进行QTL（QuantitativeTraitLocus,数量性状基因 座）定位。他们研究了299个杜洛克猪与中国二花脸猪杂交的F2代，在6，7，8 和15号染色体上定位了与总产仔数，产活仔数和产死仔数相关的QTL。
Rothschild等(Rothischild,M.,Jacobson,D.etal.ProcNatlAcadSciUS A.1996.93(1):201-205)通过候选基因法，利用包括中国梅山系太湖猪在内的两个 极端品种杂交，发现1号染色体上雌激素受体座位的一个基因(ESR)与高产仔数 主效基因连锁。通过雌激素受体基因座位的RFLPs分析，认为具有3.7kb条带的 纯合型母猪(BB型)比具有4.3kb条带的纯合型母猪(AA型)初产时要多2.3头 (P<0.01)，每胎平均多产1.5头(P<0.01)。目前已报道与产仔数相关的基因还 有OPN(US6410227B1)，PRLR(Tomas,A.,J.Casellas,etal.JAnimSci.2006.84(8): 1991-1998)，FSHβ(Zhao,Y.LiN,etal.SciChinaCLifeSci.1998.41(6):664-668) 和RBP4(Spotter,A.,S.Muller,etal.ReprodDomestAnim.2009.44(1):100-105) 等。
应用QTL定位方法能够定位与性状紧密连锁的区域，但是需要研究几代家 系的很多个体，周期长，费时费力，在一般的实验室无法完成，而且有些QTL 定位很宽泛。利用候选基因法对性状进行研究，相对来说简单直接，但是利用候 选基因法主要研究的是外显子区域的突变，而很多发挥重要功能的突变很可能在 内含子或者其它功能区域；有些复杂性状是受到多基因调控的；不能检出所有的 QTL，而且有些用候选基因法研究的基因并没有找到QTL的定位。
随着技术的发展和成熟，基因组及基因注释越来越完善。由于测序技术的快 速发展，测序成本的降低，能够利用全基因组测序或者转录组测序对性状相关基 因或突变位点进行批量筛选。本发明选择二花脸猪（太湖猪的一种），藏猪，巴 马香猪，莱芜猪，滇南小耳猪等5个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测 序。希望从中筛选出与高产仔数相关的SNPs（singlenucleotidepolymorphisms,单 核苷酸多态性）位点作为遗传标记用于猪的遗传育种，以提高母猪的产仔数。
发明内容：
本发明的目的是提供猪6号染色体上一个与产仔数相关的分子标记及其引 物。
本发明选择了二花脸猪（太湖猪的一种），藏猪，巴马香猪，莱芜猪，及滇 南小耳猪5个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。6个猪种的重测序 个体数分别为11个，11个，9个，10个，10个和10个。重测序数据跟参考基 因组（NCBIBuildSscrofa10.2）进行比对，利用SAMTools软件进行SNPs位点 的提取。发明人比较了二花脸猪与其它5个猪种，在6号染色体上发现一个SNP 位点（基因组版本NCBIBuildSscrofa10.2的Chr6:69081465）可能与猪的产仔 数相关。该位点的等位基因为T和C，有C/C、T/C和T/T三种基因型。该位点 及其侧翼序列（SEQIDNO:1）为：
caggtttgatccctggcctcactcagtgggttaaggatccagcattgctgtggctatggt60
tcaggcctacagctgcagctccagtttgacctccagccccaggaacttccatatgccaca120
ggtgcaaccataaaaataaaaaaaacatttataaaaattttttttaaaacaaggacacgt180
gacatttcagcagaagtgagaagtgagagatgtatcttatgcttattgacatacaagcac240
agccactggttcatttaccagaaaacacccaggcaaaaagtatttcagtggcagcgagag300
ccagggaagggtcaaatggtcactagctgtgtgatacacttggcgaagattagaagggat360
gatgaaaagagatgtgaaaatgcctatactggagttcacgtcgtggctcagtggttaatg420
aatctgactaggaaccatgaggttgcgggttcaatccctggcctcactcagtgggttaag480
gatctggcgttgctgtgagctgtggtgtgggtcacagatgaagcttcaatctggcattgc540
tgtggctctggcgtaggccagcggctacagctctgattagacccctagcctgggaatctc600
c601
筛选到该位点后，发明人以猪的DNA为模板扩增包含该位点在内的核苷酸 序列片段并进行测序，对该位点进行验证和相关性分析。其中发明人选择的个体 是白色杜洛克×二花脸猪（太湖猪的一种）的F2后代。结果发现该位点与猪产仔 数有显著相关性。
本发明的有益效果在于：运用全基因组重测序方法，能够快速、批量地筛选 与性状相关的分子标记或候选基因，基因组版本NCBIBuildSscrofa10.2的Chr6: 69081465这个位点能够作为遗传标记用于猪的遗传育种提高母猪的产仔数。
附图说明：
图1：白色杜洛克×二花脸F2代母猪资源群中Chr6:69081465位点3种基因 型的产仔数比较（*表示两种基因型产仔数比较时，0.01≤P≤0.05；**表 示P＜0.01）。
具体实施方案：
（1）SNP位点的群体分布特征
本发明选择了二花脸猪（太湖猪的一种），藏猪，巴马香猪，莱芜猪，及滇 南小耳猪5个中国地方猪种以及野猪进行了全基因组重测序。6个猪种的重测序 个体数分别为11个，11个，9个，10个，10个和10个。重测序数据跟参考基 因组（NCBIBuildSscrofa10.2）进行比对，利用SAMTools软件进行SNPs位点 的提取。发明人比较了二花脸猪与其它5个猪种，在6号染色体上发现一个SNP 位点（基因组版本NCBIBuildSscrofa10.2的Chr6:69081465）可能与猪的产仔 数相关。从重测序的分析结果来看，其它4个中国地方猪种和野猪中该位点等位 基因C的频率平均为90%以上，而在二花脸猪中等位基因T的频率为60%以上。
（2）SNP位点的鉴定
在引物设计网站设计SNAPSHOT引物，包括一对PCR扩增引物（Chr6-PCRU： 5’-ATTTACCAGAAAACACCCAGG-3’；Chr6-PCRL：5’-TTTTCATCATCC CTTCTAATCTTC-3’）和延伸引物（Chr6-SNPU：5’-ACTGACTGACTGACT AAAAGTATTTCAGTGGCAGCGAGAG-3’）。该位点与其它11个位点共24 条（12对）引物各取1μl混合为新的多重PCR引物池。首先进行12重PCR反应， 反应体系所用试剂为：多重PCR引物池(6.25μMeach)8μl、dNTP(10mMeach) 8μl、10×PCRBufferII116μl、MgCl2(25mMStock)234μl、FastStartTaq(5U/μl) 24μl和ddH2O460μl，将以上试剂混合液8.5μl和1.5μlDNA(50ng/μl)混合成10μl 体系进行12重PCR扩增反应。扩增反应条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s， 72℃1min，共40个循环。下一步进行PCR反应纯化，所需试剂为：ExoI(10U/μl) 60μl、SAP(1U/μl)130μl、10×SAPBuffer35μl和ddH2O125μl，在每个样品的PCR 产物中加入3.5μl上述纯化混合液离心后按以下程序进行反应：37℃40min，96℃ 10min。然后进行单碱基延伸反应，所需试剂为：SNAPSHOTMultiplexready reactionMix100μl、延伸引物池(6.25μMeach，12条延伸引物各取1μl混合)8μl、 5×SequencingBuffer200μl和ddH2O300μl，将以上试剂混合液6μl和4μl的纯化 产物混合成10μl体系进行延伸反应。延伸反应条件为：96℃10s，50℃5s，60℃ 30s，共25个循环。接着进行延伸反应产物的纯化，所需试剂为：SAP(1U/μl)120μl、 10×SAPBuffer70μl和ddH2O140μl，在每个样品的延伸反应产物中加入上述 3.3μl纯化混合液离心后按以下程序进行反应：37℃40min，75℃20min，4℃保 存备用。每个样品取5-4μl上述纯化后的SNAPSHOT反应产物和5-6μl的高纯甲酰 胺(Hi-DiFormamide)混合成10μl体系离心后上样于ABI3730XL测序仪进行基因 分型，使用GeneMarker软件分析分型结果。
(注：以上4个步骤的反应试剂混合液用量均为100个样品所需试剂量，从单碱 基延伸反应开始，需要避光进行。)
（3）白色杜洛克×二花脸繁殖性能杂交资源群构建
后续的验证实验所用资源群个体样品及其性状数据由江西农业大学动物生 物技术国家重点实验室培育基地提供。
1998年12月，在江西农业大学科研猪场将从江苏省3个二花脸猪保种场购 买的二花脸母猪进行场间血缘的交叉配种。2001年1月根据亲本产仔性能，从3 头公猪和11头母猪的纯繁后代中选择了17头二花脸母猪作为资源群体的祖代母 本。把SygenPIC公司惠赠的2头优质白色杜洛克公猪作为资源家系的祖代父本。 将这2头白色杜洛克和17头二花脸猪杂交产生的F1代个体进行配种，避免全同 胞交配，且每头公猪通常与同一头母猪配种，以获得大样本的F2半同胞家系。2003 年1月、3月和6月，项目组分别将第1批和第2批F2母猪送往江西省宜春市畜 牧良种场（59头）、江西省国营红星种猪场（52头）和江西上犹县四元杂交猪场 （118头）用于母猪繁殖性状的测定。
（4）SNP位点在杂交资源群F2代母猪群体的基因分型
按照上述步骤(2)所述的方法，以192个白色杜洛克×二花脸猪杂交资源群F2代母猪个体DNA为模板检测该SNP位点的基因型。F2代资源群个体中182个个体 成功分型，3种基因型C/C，T/C和T/T的个体数分别是53，89和40。
（5）SNP位点对产仔数性状的调控效应
在F2代资源群个体中，带有C/C基因型个体的平均产仔数为10.1829，标准差 为0.9547；带有T/C基因型个体的平均产仔数为10.8667，标准差为0.9333；带有 T/T基因型个体的平均产仔数为11.408，标准差为0.982。
本发明采用一般线性模型（GLM）分析了SNP位点对猪总产仔数、产活仔 数的影响。全部统计分析采用SAS软件进行。模型如下：
Yijklm=u+Ai+Gj+Bk+Pl+eijklm
其中Yijklm为猪总产仔数或产活仔数，u为群体均值，Ai为第i个个体的加性效 应，Gj为第j个SNP位点基因型的固定效应，Bk为批次效应（k=1,2,3,4），Pl为随 机效应（l=1,2,3）。
分析结果发现Chr6:69081465这个SNP位点跟产仔数有显著相关性（如图1 所示）。带有T/T基因型的F2代母猪的产仔数比带有C/C基因型的母猪平均多1.22 （P=0.0365）；虽然带有C/C基因型的F2代母猪的产仔数与带有T/C基因型的母 猪没有显著性差异，但是带有T/C基因型的F2代母猪的产仔数比带有C/C基因型 的母猪平均多0.6839。从图1看出，带有C/C基因型的母猪产仔数最低。T为提 高猪产仔数的有益等位基因。
从SNP位点与产仔数相关性分析看出，Chr6:69081465这个SNP位点能够 作为分子标记应用于分子标记辅助选择（MAS）来提高母猪的产仔数。
SEQUENCELISTING
<110>中国科学院昆明动物研究所
江西农业大学
<120>猪6号染色体上一个与产仔数相关的分子标记及其引物
<130>7
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>601
<212>DNA
<213>Susscrofa
<400>1
caggtttgatccctggcctcactcagtgggttaaggatccagcattgctgtggctatggt60
tcaggcctacagctgcagctccagtttgacctccagccccaggaacttccatatgccaca120
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gatctggcgttgctgtgagctgtggtgtgggtcacagatgaagcttcaatctggcattgc540
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c601
SEQUENCELISTING
<110>中国科学院昆明动物研究所
江西农业大学
<120>猪6号染色体上一个与产仔数相关的分子标记及其引物
<130>7
<160>3
<170>PatentInversion3.5
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