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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410108595.2 (22)申请日 2014.03.21 C12N 15/54(2006.01) C12N 9/12(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 刘子铎 易沭远 林拥军 张利莉 吴高兵 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 张红兵 CN 103194465 A,2013.07.10, US 62488。
2、76 B1,2001.06.19, WO 200601280 A2,2006.02.02, CN 102925417 A,2013.02.13, CN 101479387 A,2009.07.08, CN 101831443 A,2010.09.15, Shu-yuan Yi 等 .Characterization of a new type of glyphosate-tolerant 5-eno lpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Isoptericola variabilis.Journal of Molecular Catalysis。
3、 B: Enzymatic .2014, 第 111 卷 1-8. Lucas,S. 等 .AEG45057.1. GenBank .2011, 氨基酸序列表 . Lucas,S. 等 .AEG45057.1. GenBank .2011, 氨基酸序列表 . Gaoyi Cao 等 .A Novel 5-Enolpyruvylsh ikimate-3-Phosphate Synthase Shows High Glyphosate Tolerance in Escherichia coli and Tobacco Plants.PLoS ONE .2012, 第 7 卷 ( 第 6 期 ),e。
4、38718. (54) 发明名称 一种分离的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶 基因 (57) 摘要 本发明属于农业微生物基因工程技术领域， 具体涉及一种抗草甘膦5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷 酸合酶 （EPSPS） 基因的分离鉴定， 所述的 5- 烯醇 丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶 （EPSPS） 基因的核苷酸 序列如 SEQ ID NO ： 1 所述， 该基因编码的蛋白质 的序列如 SEQ ID NO ： 2 所述。5- 烯醇丙酮莽草 酸 -3- 磷酸合酶 （EPSPS） 基因是根据 Genbank 中 报导的放线细菌 Isoptericola Variabilis 的 aroA 基因序列合成得。
5、到， 包含该基因质粒的重组 大肠杆菌 LZD002 保藏在中国典型培养物保藏中 心， 其保藏编号为 CCTCC NO:M2013632。经过生物 学实验验证， 证明该基因对草甘膦具有一定的耐 受性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王宽 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图10页 CN 103834674 B 2016.03.23 CN 103834674 B 1/1 页 2 1.SEQ ID NO ： 1 所述的 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶基因在制备抗草甘膦转基因 植物中的应用。 权 利 要 求 书。
6、 CN 103834674 B 2 1/8 页 3 一种分离的 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶基因 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 具体涉及一种来源于放线细菌基因组的 5- 烯醇丙酮 莽草酸 -3- 磷酸合酶 （EPSPS） 基因的分离， 其编码基因为 AroA， 通过基因重组与遗传转化的 方法， 将该基因转入宿主细胞中， 使宿主细胞获得耐受草甘膦的能力。 本发明涉及该基因的 核苷酸序列和氨基酸序列。 背景技术 0002 草甘膦是世界范围内使用最广泛的广谱传导型除草剂， 对大多数植物具有灭生 性。 草甘膦的理化性质稳定， 对人和牲畜低毒， 在土壤中残留量低， 因此得以大范。
7、围的使用。 0003 莽草酸途径是细菌、 真菌、 藻类及高等植物中的代谢关键途径， 与细胞内芳香族氨 基酸的合成有重要关联。5- 烯醇丙酮酸莽草酸 -3- 磷酸合成酶 （EPSPS） 是该途径中第六步 的关键酶， 催化底物磷酸烯醇式丙酮酸 （PEP） 和 3- 磷酸莽草酸 （S3P） 生成 5- 烯醇丙酮酸莽 草酸 -3- 磷酸 (Bentley and Haslam1990)。由于草甘膦与 EPSPS 的作用底物之一 PEP 的过 渡态具有类似的结构， 因此能竞争性地抑制 EPSPS 的作用。由于草甘膦的作用， 细胞内的分 支酸合成受到阻碍， 后续的色氨酸 (Trp)、 酪氨酸 （Tyr） 。
8、、 苯丙氨酸 （Phe） 等芳香族氨基酸的 合成也受到进一步抑制。因此， 胞内正常的氮代谢被扰乱， 最终导致细胞死亡 (Pollegioni et al.2011)。 0004 目前研究的AroA基因按基因序列特点及抗性特点主要分为两种类型， 即I型和II 型。I 型的 AroA 基因主要来源于大肠杆菌 （E.coli） ， 沙门氏菌 （Aeromonas salmonella） ， 矮牵牛 （Petunia） 和拟南芥 （Arabidopsis thaliana） 等革兰氏阴性菌和植物。I 类 EPSPS 天然对草甘膦敏感， 经诱变改造后可获得一定的草甘膦耐受性， 但同时伴随对底物 PEP 。
9、的 亲和力下降 ； II 型 AroA 基因与 I 型在序列上相似度很低， 且结构差异较大， 主要来自根癌 农杆菌 CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4)， 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 和假 单胞菌属 PG.2982(Pesudomonas sp.) 等革兰氏阳性菌， 对 PEP 有高亲和力， 且天然对草甘 膦不敏感， 这一类基因已得到商业应用 (Funke et al.2006)。 0005 早年由于抗除草剂作物在世界范围内的推广， 类 AroA 基因得到了广泛的研究， 近年新型 aroA 开始被关注， 陆续有与 II 类基因不同的草甘。
10、膦抗性基因被发现 (Heinrichs et al.2012;Sun et al.2005)。对草甘膦抗性较高的 AroA 基因大多被发掘并申请专利保 护， 给我国的实际应用造成很大的局限性。为找到具有自主知识产权的 AroA 基因， 本发明 在放线细菌中分离了新型的 AroA 基因序列， 得到了与同类基因差异较大的草甘膦不敏感 AroA 基因。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种来自放线细菌基因组的 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合 酶 （EPSPS） 基因的分离鉴定， 通过遗传转化方法， 将该基因转入宿主细胞中， 使宿主细胞获 得耐受草甘膦的能力。 说 明 书 CN 10383。
11、4674 B 3 2/8 页 4 0007 本发明分离克隆的草甘膦抗性基因 AroA 来自于放线细菌 Isoptericola Variabilis 的 aroA 基因序列 （Genbank Accession Number:YP_004542951） 。申请人通过 化学合成得到该基因并将其克隆到大肠杆菌 aroA 缺失菌株 AB2829 中。在含 150mM 草甘膦 的 M9 培养基中该重组菌株仍能生长。申请人将该分离得到的基因命名为 AroAI.vari基因。 将 AroAI.vari基因转化到大肠杆菌 DH5 中 （转化过程参见实施例 1 中转化的步骤） ， 得到重 组大肠杆菌 LZD0。
12、02， 于 2013 年 12 月 6 日送交中国 . 武汉 . 武汉大学中国典型培养物保藏 中心 （CCTCC） 保藏， 其保藏号为 CCTCC NO:M2013632） 。酶学测定结果表明， 草甘膦抗性基因 AroAI.vari在 pH8.0 时活性最高， 为该基因转入植物中在偏碱性条件下能正常发挥作用提供 了条件。 草甘膦抗性基因AroAI.vari对其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸 （PEP） 的Km值为28M， 对莽草酸 -3 磷酸 （S3P） 的 Km值为 115M， 对草甘膦的半抑制常数 IC50 值和抑制常数 Ki值 分别为 5.4mM 和 1.2mM. 0008 将上述草甘膦抗性基。
13、因 AroAI.vari重组到 pGEX-6P-1 质粒表达载体 ( 购自美国 GE Healthcare 公司 ) 并位于 GST 标签后， 可以在大肠杆菌 （Escherichia coli） BL21 （DE3）（购 自Invitrogen公司） 中进行异源表达， 表达出的含GST标签的融合蛋白 （命名为GST-EPSPS） 大小为 73kDa， 去掉 GST 标签后的目的蛋白 （EPSPS） 大小为 47kDa。 0009 本发明分离克隆的草甘膦抗性基因AroAI.vari的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1 所示序列全长为 1374bp， 它编码 457 个氨基酸， 将其氨基酸。
14、序列与典型的 I 类 AroA 氨基酸 序列 （AroAE.coli） 和典型的 II 类 AroA 氨基酸序列 （AroACP4） 比较， 结果显示， AroAI.vari基因 序列与两个代表型 AroA 基因序列的核苷酸序列同源性最高值仅为 35% 和 29%。 （http:/ blast.ncbi.nlm.nih.gov） 。根据草甘膦抗性基因 AroAI.vari序列的特点申请人将其归类为 I 型， 是发现的一种新基因。 附图说明 0010 序列表 SEQ ID NO:1 ： 是本发明合成的草甘膦抗性基因 AroAIvari的核苷酸序列， 序 列全长为 1374bp， 第 1-1374。
15、bp 处为编码区。 0011 序列表 SEQ ID NO:2 ： 本发明分离的草甘膦抗性基因 AroAIvari的氨基酸序列， 编码 457 个氨基酸。 0012 图 1 ： 本发明技术流程图。 0013 图 2 ： AroAIvari基因的克隆过程。 0014 图 2A 是以 pUC57-aroAI.vari为模板扩增出的 AroA I.vari基因序列 ； 0015 图 2B 将 AroAI.vari基因克隆到 pGEX-6P-1 中得到的重组质粒。 0016 图 3 ： 大肠杆菌 DE3（BL21） 表达的 I.vari EPSPS 蛋白的 SDS-PAGE 分析。 0017 图中泳道 。
16、1 ： pGEX-6p-1-AroAI.vari诱导沉淀 ； 0018 泳道 2 ： pGEX-6p-1-AroAI.vari诱导上清 ； 0019 泳道 3 ： proteins Marker ； 0020 泳道 4 ： 纯化的 I.vari EPSPS 蛋白。 0021 图 4 ： 由南京金斯瑞公司合成的含有 AroAI.vari基因的质粒 pUC57-AroA I.vari图谱。 0022 图 5 ： 含 AroAI.vari基因的重组质粒 pGEX-6p-1-AroA I.vari的图谱。 0023 图 6 ： 蛋白质浓度测定标准曲线图。 说 明 书 CN 103834674 B 4 。
17、3/8 页 5 0024 图 7 ： 无机磷 （KH2PO4） 标准曲线图。 0025 图 8 ： 最适温度和最适 pH 测定曲线。图 8 中 A 图是最适温度测定曲线， 图 8 中 B 图 是最适温度测定曲线。 0026 图 9 ： 离子对活性的影响。 0027 图 10 ： Km(PEP) 的测定。 0028 图 11 ： Km（S3P） 的测定。 0029 图 12 ： 半抑制剂量 IC50值的测定。 0030 图 13 ： Ki(glyphosate) 的测定。 0031 图14 ： 含有AroAI.vari基因的大肠杆菌AroA缺陷型菌株AB2829的草甘膦抗性验证 的生长曲线。 具。
18、体实施方式 0032 实施例 15- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶基因的合成与克隆 0033 （1） AroAI.vari基因序列的合成 0034 在 Genbank 数据库获得编码 Isoptericola Variabilis 菌株的 EPSPS 的 AroAI. vari基因序列， 由南京金斯瑞公司合成该基因的核苷酸序列 1374bp 并提供重组质粒 pUC57-AroAI.vari（图 4） 。其核苷酸序列和编码的氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。 0035 （2） AroAI.vari基因序列的克隆 0036 根据 AroAI.vari。
19、的序列设计引物 ： 在引物 5 端添加 BamHI 酶切位点， 在 3 端添加 酶切位点 EcoRI， 所述的引物对的 DNA 序列如下所示 ： 0037 正向引物 (5 -AroAI.vari-BamHI):5 -CGCGGATCCATGACGCCAGCGCCCGCCAGC-3 ， 其中 下划线部分为酶切位点 ； 0038 反向引物 (3 -AroAI.vari-EcoRI):5 -CCGGAATTCTCAGGCGCCGGCCCCCACGGT-3 ， 下划 线部分为酶切位点。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 0039 以 pUC57-AroAI.vari为模板， PCR 扩增 EPSPS。。
20、PCR 反应体系如下 ： 0040 5TransStart FastPfu buffer 10L ； 0041 dNTP（10mM） 1L ； 0042 pUC57-AroAI.vari（1g/L） 1L ； 0043 正向引物 (5 -AroAI.vari-BamHI,10M) 1L ； 0044 反向引物 (3 -AroAI.vari-EcoRI,10M) 1L ； 0045 TransStart FastPfu DNA Polymerase 1L ； 0046 加双蒸水至 50L ； 0047 PCR 反应条件 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 55退火 30s， 72延。
21、伸 450s ； 30 个循环 ； 72延伸 10min， 4保存 5min 结束。PCR 产物电泳的结果如图 2 中图 2A 所示。 0048 （3） 酶解 PCR 产物和质粒载体 pGEX-6p-1 构建 0049 将获得的 PCR 产物用限制性内切酶 BamHI/EcoRI（购自宝生物工程大连有限 公司）进行酶解， 酶解体系 ： 60L 中含 15L PCR 产物或 pGEX-6P-1 质粒 （购自美国 GE Healthcare公司） ； 37L ddH2O,6L10H Buffer ； 1L BamHI ； 1L EcoRI ； 于37放置 说 明 书 CN 103834674 B 。
22、5 4/8 页 6 过夜。酶切产物的回收使用胶回收试剂盒 ( 购自北京庄盟公司） ， 按照该试剂盒的说明书回 收电泳产物。 具体过程是:在紫外灯下将目的条带切下后置于1.5mL的离心管中， 每100mg 加入 300L 的溶胶液 （该试剂盒自带） ， 于 55水浴锅温浴 10min， 直到凝胶全部融化。 ， 将 溶胶液加入到 2mL 吸附管 12000rpm， 4离心 1min， 加入 500uL 洗脱液 （该试剂盒自带） 离心 洗脱 1min， 再加入 700uL 洗脱液离心洗脱 1min， 将缓冲液弃去后再离心 1min 尽可能除去乙 醇， 加入 30L 双蒸水洗脱收集 DNA。 0050。
23、 将上述酶切后回收的 AroAI.vari基因和 pGEX-6P-1 质粒载体进行连接。10L 连 接体系中含有 ： 经上述过程构建好的含 BamHI/EcoRI 双酶切位点的 pGEX-6P-1 质粒载体 0.03nmol ； 经 BamHI/EcoRI 双酶切的目的基因 0.21nmol ； T4DNA ligase （购自 Transgene 公 司） 1L ； 5T4DNA ligase buffer2L ； 加双蒸水补至 10L， 于 4酶连过夜。取酶连产 物 1L 与 50L 大肠杆菌感受态细胞 DH5（购自 Invitrogen 公司） 混合， 加入到预冷的 1mm电转杯 （购自。
24、BioRad公司） 中， 用2.1KV电压电击 ； 然后迅速加入600L液体LB培养基， 于 37复苏 40min ； 涂布在含有 100g/mL 氨苄青霉素 （Ampicillin， 购自北京 Transgene 公司） 的 LB 平板上， 37过夜。挑取转化子， 接种到液体 LB 培养基于 37震荡培养， 抽取 质粒并进行电泳验证。 0051 （4） 质粒的提取 0052 从划线平板上挑取单菌落， 用装有 5mL 含 100g/mL Ampicillin 的 LB 液体培养 基的试管内， 37震荡培养过夜。用 1.5mL 离心管收集菌体， 12000rpm 离心 1min， 弃上清， 加入。
25、 200L 溶液 （配方 ： 50mM 葡萄糖， 25mM Tris HCl， 补足双蒸水至 1L， 调 pH 至 8.0， 备 用， 10mM EDAT， 调 pH 至 8.0) 重悬菌体 ； 混匀， 加入 400mL 溶液 （配方 ： 0.2M NaOH， l%SDS， 补足双蒸水至 1L， 备用） ， 轻轻颠倒混匀， 放置时间不超过 5min。加入 300mL 溶液 （配方 ： 3M KAc， 用冰乙酸调至 pH4.8， 备用） ， 颠倒混匀。于 12000rpm 离心 10min， 取上清， 加入上 清 2/3 体积的异丙醇， 于 12000rpm4低温离心 10min ； 弃上清， 。
26、沉淀用 70% 乙醇洗涤后， 于 12000rpm4低温离心 10min。弃上清， 沉淀用 30L 去离子水溶解。取 5L 电泳检测， 得 到的阳性克隆子即含有AroAI.vari基因的重组质粒pGEX-6p-1-AroAI.vari。 电泳结果如图2中 图 2B 所示， 重组质粒图谱见图 5。 0053 实施例 2EPSPS 蛋白的表达、 纯化与分析 0054 (1) 目的蛋白 EPSPS 的表达 0055 将重组质粒 pGEX-6p-1-AroAI.vari转化到表达宿主细胞大肠杆菌 E.coli BL21 （DE3） 。将鉴定阳性克隆子过夜活化， 以体积比 1% 的接种量转接至 1L 含。
27、 100g/mL Ampicillin 的 LB 液体培养基中， 于 37培养 2-3h， 直至 OD600达到 0.6 左右， 加入诱导剂 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 (IPTG) 终浓度至 0.5mM， 于 22， 180rpm 下培养 25h。离心 收集菌体， 然后用 Hepes 缓冲液 （配方 ： 50mM4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 （Hepes） ， 2mM 二硫苏糖醇 （DTT） , 调 pH 至 7.0， 补足双蒸水至 1L， 备用） 将菌体洗涤一遍， 再用 50mL Hepes 缓冲液悬 浮后用高压细胞破碎仪 （购自 GEA Niro Soari 公司型号 ： NSI0012K）。
28、 破碎细胞。将细胞破 碎液于4、 12000rpm下离心30min， 收集上清。 用SDS-PAGE法检测获得的上清是否含有目 的蛋白。 0056 SDS-PAGE 配方如下 ： 0057 浓缩胶 （5% 聚丙烯酰胺） ， 配方如下 ： 说 明 书 CN 103834674 B 6 5/8 页 7 0058 0059 分离胶 （12% 聚丙烯酰胺） ， 配方如下 ： 0060 0061 取 80L 细 胞 破 碎 液， 加 20L5 蛋 白 上 样 缓 冲 液 （6mL1mol/L Tris-HCl， pH8.8） ， 20mL10%SDS,50mL50% 甘油， 5mL- 巯基乙醇， 1mL。
29、1% 溴酚蓝， 加双蒸水至 100mL， 备 用） ， 沸水浴5min， 然后点样10L电泳检测， SDS-PAGE电泳检测结果见图3。 图3表明， 目的 蛋白EPSPS在大肠杆菌中得到正确表达， 含GST标签和目的蛋白的融合蛋白， 申请人将此融 合蛋白命名为 GST-EPSPS， 其大小约为 73kDa， 去掉 GST 标签后的目的蛋白 EPSPS 为 46kDa， 符合预测结果。 0062 (2) 目的蛋白 EPSPS 的纯化 0063 本发明利用还原型谷胱甘肽 （GST）亲和纯化系统纯化重组蛋白 (Nilsson et al.1997)， 具体操作步骤 （所有操作均在 4下进行） 如下 。
30、： 取 1ml 柱材料 GSH Sepharose4B （购自 Amersham-Pharmacia 公司） 于层析柱中， 用 50mL Hepes 缓冲液洗脱平衡 ； 将细胞破 碎液的上清以1.0ml/min的流速过柱 ； 用500mL Hepes缓冲液洗脱没有结合的杂蛋白， 流速 控制在 1.0mL/min 以下。再取 5L 浓度为 10unit/L 的 3C 蛋白酶 （购自 Merck 公司） 与 1mL Hepes 缓冲液混匀， 加入层析柱混匀后放 4酶解 12 小时。收集上一步骤中经酶解后 含目的蛋白 EPSPS 的 Hepes 缓冲液至 1.5ml 的离心管中， 再加等体积的甘油混。
31、合后分装， 置 于 -80保存 (Rippert and Matringe2002)。 0064 (3) 目的蛋白 EPSPS 的浓度定量测定 0065 采用定量 Bradford 法 (Bradford1976) 测定纯化的目的蛋白 EPSPS 的浓度。具体 步骤如下 ： 用 Bradford 蛋白定量试剂盒 （购自上海生工生物工程有限公司） 测定目的蛋白 EPSPS 的浓度， 按照试剂盒的说明书操作。具体步骤为 ： 取 20L1mg/mL 蛋白标准品牛血清 蛋白 （购自上海生工生物工程技术有限责任公司） 加 Hepes 缓冲液稀释至 100L， 使终浓度 为 0.2mg/mL。取稀释后的标。
32、准品按 0， 5， 10， 15， 20， 25， 30L 分别加到 96 孔板中， 加 Hepes 缓冲液补足到 1mL， 每孔蛋白含量分别为 0， 5， 10， 15， 20， 25， 30g/mL。每组设计 3 个平行 说 明 书 CN 103834674 B 7 6/8 页 8 试验。每孔加入 200L Bradford Reagent（Bradford 蛋白定量试剂盒自带） ， 混匀， 室温 放置 5min 后用预热的酶标仪 （Thermo Scientific 公司） 测定 OD595值， 绘制标准曲线， 得到 如图 6 所示的蛋白质浓度测定标准曲线， 计算样品的蛋白浓度。 006。
33、6 （4） 目的蛋白 EPSPS 的活性测定 0067 目的蛋白EPSPS活性测定参照文献(Lanzetta et al.1979)报道的无机磷的测定 方法。具体步骤如下 ： 0068 无机磷标准曲线的制作 ： 配制10mM的无机磷标准溶液 （称取0.2282gK2HPO4 3H2O， 用 Hepes 缓冲液溶解定容至 100mL） ， 分别取 0-20L 于 20 个 1.5mL 离心管中， 加入适量 Hepes 缓冲液补足至 1mL， 使 20 个离心管中无机磷终浓度分别为 0-0.2mM. 每管取 100L， 于 28静置 3min 后， 加入 0.8mL MAT 溶液 （现配现用 ： 。
34、0.045% 孔雀石绿 75mL， 4.2% 钼酸铵 用 10mL 浓盐酸溶解后定容至 25mL， 混合后过滤， 加入 200L Tritonx-100, 备用） ， 室温放 置1min后加入0.1mL34%柠檬酸钠溶液， 放置30min后取200L于96孔板中测定OD660值。 设计三个实验组(Jin et al.2007)。 以无机磷浓度为横坐标， 以OD660为纵坐标作图得到无 机磷标准曲线图 （见图 7） 。 0069 最适温度和最适 pH 测定 ： 50L 反应体系 ： 1mM 莽草酸三磷酸， 1mM 磷酸烯醇式 丙酮酸 （PEP） ， 加入 1uL 纯化的 EPSPS 蛋白， 加 。
35、Hepes 缓冲液补足到 50L。28反应 4min， 加入 800L MAT 溶液， 1min 后加入 100L34% 柠檬酸钠 （SC） 溶液， 室温放置 30min 后， 取 200L 于 96 孔板中， 用预热的酶标仪测定 OD660值。对照组不加莽草酸三磷酸， 设计 3 个实 验组。以与上述 50L 体系相同的反应体系在不同温度 （0、 10、 20、 30、 40、 50、 60） 下反应 后测定 OD660值并计算反应速度。以温度为横坐标， 以相对活性的平均值为纵坐标作图， 得 到最适温度测定曲线 （见图 8A） 。用不同 pH（4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11）。
36、 的 Hepes 缓冲液配置上 述 50uL 反应体系， 反应后测定 OD600 值并计算反应速度， 以 pH 值为横坐标， 以相对活性为 纵坐标作图， 得到所示的最适 pH 测定曲线 （见图 8B） 。 0070 阳离子对酶活性的影响 ： 50L 反应体系 ： 1mM 莽草酸三磷酸， 1mM 磷酸烯醇式丙 酮酸 （PEP） ， 加入 1uL 纯化的 EPSPS 蛋白， 分别添加 KCl、 KBr、 NacCl、 MgSO4、 NH4Cl、 K2SO4、 CaCl2、 MgCl2 的盐溶液至终浓度为 100mM 后测定酶反应速度。离子对酶活性的影响见图 9. 0071 Km(PEP) 测定 ：。
37、 将体系中莽草酸三磷酸 （S3P） 的浓度固定为 1mM， 在不同 PEP 浓度 （0.05、 0.067、 0.1、 0.2、 0.5、 1.0mM） 下按上述 50L 反应体系测定酶反应速度， 以 PEP 浓度 为横坐标， 以反应速度 V（U/mg） 为纵坐标作图， 得到如图 10 所示的 Km(PEP) 的测定结果。 0072 Km(S3P) 测定 ： 将体系中磷酸烯醇式丙酮酸 （PEP） 的浓度固定为 1mM， 在不同莽草 酸三磷酸 （S3P） 浓度 （0、 0.02、 0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.0mM） 下按上述 50L 反应体系测 定酶反应速度， 以 。
38、S3P 浓度为横坐标， 以反应速度 V（U/mg） 为纵坐标作图， 得到如图 11 所 示的 Km（S3P） 的测定结果。 0073 半抑制剂量 （IC50）测定 ： 在上述反应体系中添加不同浓度 （10-5、 10-4、 10-3、 10-2、 10-1、 100、 101、 100、 1000mM） 的草甘膦， 所得数据以草甘膦浓度为横坐标， 采用对数坐标， 以反 应速度 V（U/mg） 为纵坐标作图， 得到如图 12 所示的半抑制剂量 IC50值的测定结果。 0074 抑制常数 Ki(glyphosate) 测定 ： 将体系中莽草酸三磷酸 （S3P） 的浓度固定为 1mM， 采用不同 P。
39、EP 浓度 （0.067、 0.1、 0.2、 0.5、 1.0mM） 配制 50ul 反应体系， 不同 PEP 浓度的体系 中分别添加 0.5mM、 1mM、 2mM、 5mM 的草甘膦， 测定酶反应速度， 以草甘膦的浓度为横坐标， 以 说 明 书 CN 103834674 B 8 7/8 页 9 反应速度 V（U/mg） 的倒数为纵坐标作图， 得到如图 13 所示的 Ki(PEP) 的测定结果。 0075 实施例 3 ： 遗传转化实验 （功能互补验证） 0076 将重组质粒 pGEX-6p-1-AroAJ.limo转化到 AroA 基因缺陷型大肠杆菌感受态细胞 （转化过程参见上述实施例 1。
40、 中转化过程。该菌株不含 AroA 基因， 能够排除一般大肠杆菌 中带有的 AroA 基因的干扰） (Vaithanomsat and Brown2007)， 分别转接到含 0mM、 50mM、 100mM， 150mM 草甘膦的 M9 液体培养基 （配方 ： Na2HPO46.8g/L， KH2PO43.0g/L， NaCl0.5g/L， NH4Cl1.0g/L， MgSO4 7H2O0.4929g/L， CaCl20.111g/L， 葡萄糖 4.0g/L， 补充双蒸水至 1L， 灭 菌前调 pH 至 7.4， 在 115下高压蒸汽灭菌 10min） 中， 测定生长曲线。 0077 将构建好。
41、的重组质粒 pGEX-6p-1-AroAI.vari转化到感受态细胞大肠杆菌 AroA 缺陷 型菌株 AB2829， 将转化子分别接种到含有含 0mM、 50mM、 100mM,150mM 草甘膦的 M9 液体培养 基中 （含100g/mL Ampicillin） ， 于37震荡培养40h。 每组设计三个平行实验， 每10h取 100L 培养液测定细胞浓度， 即 OD600值。以培养时间为横坐标， 以 OD 600值为纵坐标作图， 得到的生长曲线如图 14 所示。 0078 参考文献 0079 1.Bentley R,Haslam E(1990)The Shikimate Pathway-A 。
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