抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510154033.6 (22)申请日 2015.04.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104744579 A (43)申请公布日 2015.07.01 (73)专利权人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐东二 路2号中国农业科学院油料作物研究 所 (72)发明人 陈李淼单志慧陈海峰张婵娟 袁松莉杨中路陈水莲邱徳珍 周新安 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅任凤华 (51)。

2、Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/20(2018.01) (56)对比文件 Lam H M et al.Myb-related protein Myb4Glycine soja， Genbank序列号： KHN02506. Genbank数据库 .2014, Pereira S.S. et al.Transcription f。

3、actors expressed in soybean roots under drought stress. Genetics and Molecular Research .2011,第10卷(第4期),3689-3701. 审查员 郭婷婷 (54)发明名称 抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的 应用 (57)摘要 本发明公开了抗逆相关蛋白GmL16在调控植 物抗逆性中的应用。 本发明所提供的抗逆相关蛋 白GmL16为a)或b)或c)： a)氨基酸序列是SEQID No.2所示的蛋白质； b)在SEQIDNo.2所示的蛋 白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白 质； c)将SEQ。

4、IDNo.2所示的氨基酸序列经过一 个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加得到的具有所述抗逆相关蛋白功能的蛋白质。 实验证明， 本发明提供的抗逆相关蛋白GmL16能 调控植物的抗逆性， 可以用来提高植物抗旱性。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 104744579 B 2018.10.02 CN 104744579 B 1.抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的应用； 所述抗逆相关蛋白GmL16为氨基酸 序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质； 所述抗逆性为抗旱性。 2.与权利要求1中所述抗逆相关蛋白GmL16相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应 用； 所述。

5、与权利要求1中所述抗逆相关蛋白GmL16相关的生物材料， 为下述A1)至A8)中的任 一种： A1)编码权利要求1所述抗逆相关蛋白GmL16的核酸分子； A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒； A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体； A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物； A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： A1)所述核酸分子为核苷酸序列是SEQ IDNo.1的DNA分子。 4.根据权利要求1-3任一所述的应用。

6、， 其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植 物。 5.一种培育抗逆性转基因植物的方法， 包括向受体植物中导入权利要求1中所述抗逆 相关蛋白GmL16的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤； 所 述抗逆性为抗旱性。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 权利要求1中所述抗逆相关蛋白GmL16的编 码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。 7.根据权利要求5或6所述的方法， 其特征在于： 所述受体植物为单子叶植物或双子叶 植物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104744579 B 2 抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的应用 技术领域。

7、 0001 本发明涉及生物技术领域中抗逆相关蛋白GmL16在调控植物抗逆性中的应用。 背景技术 0002 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应， 伴随着许多生理生化及发育上的 变化。 明确植物对逆境的反应机制， 将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。 目前， 获 得抗逆农作物新品种的途径包括利用经典遗传学方法的常规选育技术和利用基因工程手 段培育转基因新品种技术。 常规选育技术周期长， 不定向， 优异性状难控制； 相比之下， 转基 因技术更快速， 可以定向改良单一性状。 因此， 利用分子生物学技术改造农作物， 提高农作 物的抗逆能力已经成为近年来的研究热点。 0003 大豆是我国重要的粮。

8、食作物和油料作物， 也是我国供需矛盾最为突出的农作物。 由于大豆在生长发育过程中需水量较多， 在豆类作物中对逆境尤其是缺水造成的逆境最敏 感， 所以逆境胁迫会严重影响大豆产量。 因此， 提高大豆抗逆能力对于大豆高产具有重要意 义。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。 0005 为解决上述技术问题， 本发明首先提供了抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应 用。 0006 本发明所提供的抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中， 所述抗逆相关蛋白 的名称为GmL16， 为如下a)或b)或c)的蛋白质： 0007 a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质； 00。

9、08 b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； 0009 c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有抗逆功能的蛋白质。 0010 其中， SEQ ID No.2由291个氨基酸残基组成。 0011 为了使a)中的蛋白质便于纯化， 可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧 基末端连接上如表1所示的标签。 0012 表1、 标签的序列 0013 标签残基序列 Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRR Poly-His2-10(通常为6个)HHHHHH 0014 FLAG8DY。

10、KDDDDK Strep-tag II8WSHPQFEK 说明书 1/8 页 3 CN 104744579 B 3 c-myc10EQKLISEEDL 0015 上述c)中的蛋白质GmL16， 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 0016 上述c)中的蛋白质GmL16可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得 到。 0017 上述c)中的蛋白质GmL16的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失 一个或几个氨基酸残基的密码子， 和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5 端和/或3 。

11、端连上表1所示的标签的编码序列得到。 0018 上述抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中， 所述植物为陆生植物。 所述陆 生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。 所述双子叶植物可为十字花科植物， 如拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。 0019 为解决上述技术问题， 本发明还提供了与所述GmL16相关的生物材料。 0020 本发明所提供的与所述GmL16相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中， 与 所述GmL16相关的生物材料， 为下述A1)至A20)中的任一种： 0021 A1)编码所述GmL16的核酸分子； 0022 A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒； 0023 。

12、A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体； 0024 A4)含有A2)所述表达盒的重组载体； 0025 A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物； 0026 A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物； 0027 A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物； 0028 A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物； 0029 A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； 0030 A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系； 0031 A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系； 0032 A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系； 0033 A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植。

13、物组织； 0034 A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织； 0035 A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织； 0036 A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织； 0037 A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官； 0038 A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官； 0039 A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官； 0040 A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。 0041 上述与所述GmL16相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中， A1)所述核酸分 子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因： 0042 a1)核苷酸序列是SEQ I。

14、D No.1的DNA分子或cDNA分子； 0043 a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75或75以上同一性， 且编码所述GmL16的 cDNA分子或基因组DNA分子； 说明书 2/8 页 4 CN 104744579 B 4 0044 a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交， 且编码所述GmL16的cDNA分 子或基因组DNA分子。 0045 其中， 所述核酸分子可以是DNA， 如cDNA、 基因组DNA或重组DNA； 所述核酸分子也可 以是RNA， 如mRNA或hnRNA等。 0046 其中， SEQ ID No.1为CDS， 由876个核苷酸组成， 编码SEQ ID No.。

15、2所示的氨基酸序 列。 0047 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法， 例如定向进化和点突变的方 法， 对本发明的编码GmL16的核苷酸序列进行突变。 那些经过人工修饰的， 具有与本发明分 离得到的GmL16的核苷酸序列75或者更高同一性的核苷酸， 只要编码GmL16且具有GmL16 功能， 均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。 0048 这里使用的术语 “同一性” 指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性” 包括与本发 明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75或更高， 或 85或更高， 或90或更高， 或95或更高同一性的核苷酸序。

16、列。 同一性可以用肉眼或计算 机软件进行评价。 使用计算机软件， 两个或多个序列之间的同一性可以用百分比()表示， 其可以用来评价相关序列之间的同一性。 0049 上述生物材料中， 所述严格条件是在2SSC， 0.1SDS的溶液中， 在68下杂交并 洗膜2次， 每次5min， 又于0.5SSC， 0.1SDS的溶液中， 在68下杂交并洗膜2次， 每次 15min； 或， 0.1SSPE(或0.1SSC)、 0.1SDS的溶液中， 65条件下杂交并洗膜。 0050 上述75或75以上同一性， 可为80、 85、 90或95以上的同一性。 0051 上述生物材料中， B2)所述的含有编码GmL16。

17、的核酸分子的表达盒(GmL16基因表达 盒)， 是指能够在宿主细胞中表达GmL16的DNA， 该DNA不但可包括启动GmL16基因转录的启动 子， 还可包括终止GmL16基因转录的终止子。 进一步， 所述表达盒还可包括增强子序列。 可用 于本发明的启动子包括但不限于： 组成型启动子， 组织、 器官和发育特异的启动子， 和诱导 型启动子。 启动子的例子包括但不限于： 花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S： 来自西红柿 的创伤诱导型启动子， 亮氨酸氨基肽酶(LAP,Chao等人(1999)Plant Physiol 120： 979- 992)； 来自烟草的化学诱导型启动子， 发病机理相关1(PR1。

18、)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑- 7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)； 西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉 酮酸甲酯诱导)； 热休克启动子(美国专利5， 187， 267)； 四环素诱导型启动子(美国专利5， 057,422)； 种子特异性启动子， 如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利 200710099169.7)， 种子贮存蛋白质特异的启动子(例如， 菜豆球蛋白、 napin,oleosin和大 豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4： 3047-3053)。 它们可单独使用 或与其它。

19、的植物启动子结合使用。 此处引用的所有参考文献均全文引用。 合适的转录终止 子包括但不限于： 农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、 花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止 子、 tml终止子、 豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见， 例如： Odell 等人(I985)Nature 313:810； Rosenberg等人(1987)Gene,56:125； Guerineau等人(1991) Mol.Gen.Genet,262:141； Proudfoot(1991)Cell,64:671； Sanfacon等人Genes Dev.,5: 141； Mogen等人(。

20、1990)Plant Cell,2:1261； Munroe等人(1990)Gene,91:151； Ballad等人 (1989)Nucleic Acids Res.17:7891； Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。 0052 可用现有的表达载体构建含有所述GmL16基因表达盒的重组载体。 所述植物表达 说明书 3/8 页 5 CN 104744579 B 5 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。 如pAHC25、 pBin438、 pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、 pCAMBIA1301、 pCAMBIA13。

21、00、 pBI121、 pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。 所述植物表达载体还可包含外源基因的3 端非翻译区 域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。 所述聚腺苷酸信 号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3 端， 如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱 合成酶基因Nos)、 植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3 端转录的非翻译区均具有类似功能。 使用本发明的基因构建植物表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的。

22、阅 读框相同， 以保证整个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 为了便 于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可 在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因 等)、 抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因， 赋予对除草剂 膦丝菌素抗性的bar基因， 赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因， 和赋予对氨甲喋呤抗性的 dhfr基因， 赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因。

23、等(如抗除莠剂基 因)、 提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。 从转基因植物的安全性考虑， 可不 加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。 0053 上述与所述GmL16的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中， 所述载体可为质粒、 黏粒、 噬菌体或病毒载体。 0054 上述与所述GmL16的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中， 所述的微生物可为 酵母、 细菌、 藻或真菌， 如农杆菌。 0055 上述与所述GmL16的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中， 所述转基因植物细 胞系、 转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。 0056 在本发明的一个实施方式中， GmL16。

24、的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子) 通过含有GmL16的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌GV3101中。 所述重组载体为将 载体pCXSN用XcmI单酶切后， 插入SEQ ID No.1所示的DNA分子得到的重组载体pCXSN- GmL16， pCXSN-GmL16表达GmL16蛋白。 0057 上述与所述GmL16的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中， 所述植物为陆生植 物。 所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。 所述双子叶植物可为十字花科植物， 如拟南芥(Arabidopsis thaliana)。 0058 为解决上述技术问题， 本发明还提供了一种培育抗逆。

25、性转基因植物的方法。 0059 本发明所提供的一种培育抗逆性转基因植物的方法， 包括向受体植物中导入所述 GmL16的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。 0060 上述培育抗逆性转基因植物的方法中， 所述GmL16的编码基因的编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子。 0061 在本发明的实施例中， 所述GmL16的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通 过含有GmL16基因表达盒的GmL16基因重组表达载体导入所述受体植物中。 0062 上述方法中， 其中所述GmL16基因可先进行如下修饰， 再导入受体植物中， 以达到 更好的表达效果： 说明书 。

26、4/8 页 6 CN 104744579 B 6 0063 1)根据实际需要进行修饰和优化， 以使基因高效表达； 例如， 可根据受体植物所偏 爱的密码子， 在保持本发明所述GmL16基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物 偏爱性； 优化过程中， 最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量， 以最好地实现植物 中导入基因的高水平表达， 其中GC含量可为35、 多于45、 多于50或多于约60； 0064 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列， 以使翻译有效起始； 例如， 利用在植物中已 知的有效的序列进行修饰； 0065 3)与各种植物表达的启动子连接， 以利于其在植物中的表达； 所述启动。

27、子可包括 组成型、 诱导型、 时序调节、 发育调节、 化学调节、 组织优选和组织特异性启动子； 启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化， 而且也取决于靶物种； 例如组织或器官的特异性 表达启动子， 根据需要受体在发育的什么时期而定； 尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的， 反之亦然， 但是理想地， 选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达， 单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达； 0066 4)与适合的转录终止子连接， 也可以提高本发明基因的表达效率； 例如来源于 CaMV的tml， 来源于rbcS的E9； 任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可。

28、以与本发明 基因进行连接； 0067 5)引入增强子序列， 如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列 (例如来源于TMV,MCMV和AMV)。 0068 所述GmL16基因重组表达载体可通过使用Ti质粒， 植物病毒栽体， 直接DNA转化， 微 注射， 电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998， Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463； Geiserson and Corey, 1998,Plant Molecular Biology(2n。

29、d Edition).)。 0069 上述方法中， 所述转基因植物理解为不仅包含将所述GmL16基因转化目的植物得 到的第一代转基因植物， 也包括其子代。 对于转基因植物， 可以在该物种中繁殖该基因， 也 可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种， 特别包括商业品种中。 所述转 基因植物包括种子、 愈伤组织、 完整植株和细胞。 0070 为解决上述技术问题， 本发明还提供了扩增编码所述GmL16的核酸分子全长或其 片段的引物对。 0071 本发明中， 所述抗逆性可为抗旱、 抗冷害、 抗盐性中三种、 两种或一种。 本发明中， 所述抗逆性具体可为抗旱性。 所述抗旱性具体可为整个生长期的抗。

30、旱性。 所述整个生长时 期的抗旱性具体可体现为与受体植物相比， 1)植株存活率大于所述受体植株； 2)植株叶片 相对含水量大于所述受体植株； 3)植株叶片相对电导率小于所述受体植株。 0072 实验证明， 本发明提供的抗逆相关蛋白GmL16及其编码基因能提高植物的抗旱性： 200mM甘露醇处理T3代纯合转GmL16基因拟南芥植株株系L1、 L2、 L6第6天的幼苗存活率分别 为野生型拟南芥幼苗存活率的4.67倍、 4.52倍和4.61倍； 干旱处理T3代纯合转GmL16基因拟 南芥植株株系L1、 L2、 L6的第10天、 第12天、 第14天、 第16天、 第18天和第20天的拟南芥叶片 相对。

31、含水量均高于干旱处理野生型拟南芥相应天数的拟南芥叶片相对含水量； 干旱处理T3 代纯合转GmL16基因拟南芥植株株系L1、 L2、 L6的第10天、 第12天、 第14天、 第16天、 第18天和 第20天的拟南芥叶片相对电导率均低于干旱处理野生型拟南芥相应天数的拟南芥叶片相 对电导率。 结果表明， 可以利用本发明的抗逆相关蛋白GmL16及其编码基因提高植物的抗逆 说明书 5/8 页 7 CN 104744579 B 7 性。 附图说明 0073 图1为T3代纯合转GmL16基因植株的PCR检测结果。 其中泳道M为Direct-loadTMStar Marker Plus(D2000Plus)。

32、(M121)的DNA分子量标准； 泳道1-8为分别以T3代转GmL16基因拟 南芥植株的株系L1L8的植株DNA为模板的PCR检测结果； 泳道9为以水做模板的PCR检测结 果； 泳道10为以野生型拟南芥的植株DNA为模板的PCR检测结果； 泳道11为以质粒pCXSN- GmL16为模板的PCR检测结果。 0074 图2为T3代纯合转GmL16基因植株的荧光定量PCR检测结果。 0075 WT： 野生型拟南芥； L1L8： 8个T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系。 0076 图3为T3代纯合转GmL16基因拟南芥的抗旱性分析： A为200mM甘露醇处理6天的拟 南芥幼苗的生长状态； B为200。

33、mM甘露醇处理6天的T3代纯合转GmL16基因拟南芥幼苗的生长 状态。 0077 图4为3个T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系的植株存活率统计结果。 0078 WT： 野生型拟南芥； L1： T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系L1； L2： T3代纯合转GmL16 基因拟南芥株系L2； L6： T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系L6。 0079 图5为3个T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系的植株相对含水量和相对电导率的测 定结果。 0080 WT： 野生型拟南芥； L1： T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系L1； L2： T3代纯合转GmL16 基因拟南芥株系L2； L6： T3代纯。

34、合转GmL16基因拟南芥株系L6。 具体实施方式 0081 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为 常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0082 下述实施例中的pCXSN为The Arabidopsis Biological Resource Center产品， 产品目录号为CD3-1250。 0083 下述实施例中的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)(Kim H,Hyun。

35、 Y,Park J,Park M,Kim M,Kim H,Lee M,Moon J,Lee I,Kim J.A genetic link between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171)公众可从中国农业科学院作物科学研究所 获得， 以重复本申请实验。 拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)在下文中简 称野生型拟南芥。 0084 实施例1、 利用抗逆相关蛋白基因培育抗逆性增强的转基因拟南。

36、芥植物 0085 本实施例提供了一个来源于大豆的抗逆相关蛋白基因， 将其命名为抗逆相关蛋白 GmL16基因。 0086 制备序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子(即抗逆相关蛋白GmL16基因,简称 GmL16基因)， SEQ ID No.1所示的DNA分子编码SEQ ID No.2所示的蛋白质(即抗逆相关蛋白 GmL16， 简称GmL16蛋白)。 说明书 6/8 页 8 CN 104744579 B 8 0087 1、 重组载体和重组农杆菌的构建 0088 将载体pCXSN的用XcmI单酶切， 插入核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子， 保持载 体pCXSN的其它序列不变得。

37、到GmL16基因表达载体， 其名称为pCXSN-GmL16。 pCXSN-GmL16表 达SEQ ID No.2所示的GmL16蛋白。 0089 将重组载体pCXSN-GmL16导入根癌农杆菌GV3101中， 得到含有重组载体pCXSN- GmL16的重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmL16。 0090 将空载体质粒pCXSN转入根癌农杆菌GV3101， 得到含有质粒pCXSN的重组农杆菌 GV3101/pCXSN。 0091 2、 转GmL16基因拟南芥植株的获得 0092 2.1、 转基因拟南芥植株的获得 0093 将野生型拟南芥种子用灭菌水(含有10(体积百分含量)次氯酸钠和10(。

38、体积 百分含量)吐温-20的水溶液)摇动消毒15min， 在超净工作台中用灭菌水清洗上述消毒的种 子至少5次。 将清洗完的种子均匀播种在MS培养基上。 MS平板于4春化3天， 然后置于22 光照培养箱培养一周。 待小苗长出四片真叶后移栽至营养钵中培养， 保湿2-3天。 拟南芥的 生长对温度比较敏感， 20-22为比较适宜的培养温度。 当野生型拟南芥植株生长至大部分 花蕾处于即将开花状态时， 采用花序浸泡转化法(尚爱华等， 2013)用重组农杆菌GV3101/ pCXSN-GmL16侵染液转化野生型拟南芥获得T1代转pCXSN-GmL16拟南芥种子。 0094 2.2、 阳性转GmL16基因拟南。

39、芥的初步筛选： 将2.1的T1代转pCXSN-GmL16拟南芥种 子， 于37烘箱中烘干(6-8天)， 然后4春化3天。 将T1代转pCXSN-GmL16种子在含潮霉素的 MS培养基(潮霉素在MS培养基中的浓度为100mg/L)上进行筛选， 非阳性转GmL16基因拟南芥 出现萎蔫并停止生长， 2周后基本死亡； 得到初筛阳性T1代转GmL16基因拟南芥幼苗。 0095 2.3、 转GmL16基因的阳性拟南芥植株的鉴定： 提取2.2中的初筛阳性T1代转GmL16 拟 南 芥 植 株 叶 片 的 基 因 组 D N A ， 以 其 为 模 板 ， 以 G m L 1 6 基 因 引 物 F ： 5-。

40、 ATGGGGAGAGCTCCATGCTG-3 和GmL16基因引物R： 5 -TCACAATTCCAGTAACTGGGTA-3 进行PCR扩 增， 得到PCR扩增产物。 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,能得到876bp的目的条带的初 筛阳性T1代转GmL16拟南芥植株即为T1阳性转GmL16基因拟南芥。 以水和野生型拟南芥DNA为 模板进行上述鉴定实验无目的条带； 以质粒pCXSN-GmL16为模板进行上述鉴定实验有876bp 的目的条带(图1)。 0096 用上述方法进行鉴定T1阳性转GmL16基因拟南芥的后代， 直至获得T3代纯合转 GmL16基因拟南芥的种子。 0097 按照上述2。

41、.1-2.3的方法， 将重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmL16替换为重组农杆菌 GV3101/pCXSN， 其他步骤均相同， 得到T3代纯合转空载体拟南芥的种子。 0098 3、 转GmL16基因拟南芥的抗逆性鉴定及分析 0099 3.1、 定量PCR鉴定转GmL16基因拟南芥植株中目的基因的表达 0100 实验重复三次， 每次重复的具体步骤如下： 0101 以野生型拟南芥植株为对照， 分别鉴定步骤2的T3代纯合转GmL16基因拟南芥植株 株系L1-L9和T3代纯合转空载体拟南芥株系空1中目的基因的表达， 内参为大豆 -actin， 内 参的 引物为a c ti n - F ： 5- 。

42、A T TG G A C T C TG G TG A TG G TG - 3和a c ti n -R ： 5- TCAGCAGAGGTGGTGAACAT-3 。 鉴定T3代纯合转GmL16基因拟南芥植株的引物对为： 5 - 说明书 7/8 页 9 CN 104744579 B 9 TGGGAAACAGATGGTCGGC-3 和5 -GCGTCTTGGTTGGATTTGGAG-3 。 0102 实验结果见图2， T3代纯合转GmL16基因拟南芥植株株系L1-L9中GmL16基因的表达 量分别为野生型拟南芥中GmL16基因的表达量的37031倍、 12477倍、 3735倍、 12386倍、 83。

43、6 倍、 22341倍、 437倍、 163倍和6024倍； T3代纯合转空载体拟南芥株系空1中GmL16基因的表达 量为野生型拟南芥中GmL16基因的表达量的1.6倍。 结果表明， T3代纯合转GmL16基因拟南芥 植株株系L1-L9中均有GmL16基因的表达。 0103 3.2、 转GmL16基因拟南芥的抗旱性分析 0104 将野生型拟南芥(WT)和三个T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系(L1、 L2、 L6)的种子 直接撒播在1/2MS培养基中， 在22， 16h光照下培养10天得到10天幼苗。 0105 从上述10天幼苗中的各株系随机挑选20株分别移至1/2MS培养基和含甘露醇的1/。

44、 2MS培养基(向1/2MS培养基中添加甘露醇得到该含甘露醇的1/2MS培养基， 甘露醇在该含甘 露醇的1/2MS培养基中的浓度为200mM)培养， 第6天观察植株表型并统计拟南芥幼苗存活率 (甘露醇胁迫处理后叶片保持绿色且能够正常生长的植株株数与甘露醇胁迫处理前植株总 株数之比)。 实验重复三次， 每次重复每个株系20株。 0106 将野生型拟南芥(WT)和三个T3代纯合转GmL16基因拟南芥株系(L1、 L2、 L6)的种子 在1/2MS培养基中， 在22， 16h光照下培养10天， 然后分别移植至装有营养土的花盆(花盆 中营养土和蛭石的体积比为1:1)， 在22， 12h光照下进行培养7。

45、天， 得到7天幼苗。 将上述7 天幼苗分别进行干旱处理后测定拟南芥叶片的相对含水量和相对电导率。 具体为上述7天 幼苗干旱处理前浇足营养液， 之后一直不浇任何液体(包括营养液和水)然后分别测定干旱 处理第10天、 第12天、 第14天、 第16天、 第18天和第20天拟南芥叶片的相对含水量和相对电 导率。 相对含水量测定方法参照Larbi A,Mekliche A.2004.Relative water content (RWC)and leaf senescence as screening tools for drought tolerance in wheat.Optionsennes.。

46、rie A,minairesens 60,193- 196 .， 相对电导率测定方法参照Liu FH ,Guo Y ,Gu DM ,Xiao G ,Chen ZH ,Chen SY.1997.Salt tolerance of transgenic plants with BADH cDNA.Acta Genetica Sinica 24,54-58.， 实验重复三次， 每次重复每个株系20株。 0107 实验结果表明， 在1/2MS培养基生长的野生型拟南芥(WT)和T3代纯合转GmL16基因 拟南芥的三个株系生长状态良好， 和野生型拟南芥(WT)相比T3代纯合转GmL16基因拟南芥 的三个株。

47、系的拟南芥生长更茂盛、 叶片更浓绿； 在含甘露醇的1/2MS培养基生长的T3代纯合 转GmL16基因拟南芥的三个株系生长状态良好， 而野生型拟南芥(WT)生长状态较差(图3)。 0108 拟南芥幼苗存活率的统计结果见图4， 200mM甘露醇处理T3代纯合转GmL16基因拟 南芥植株株系L1、 L2、 L6第6天的幼苗存活率分别为野生型拟南芥幼苗存活率的4.67倍、 4.52倍和4.61倍。 拟南芥叶片的相对含水量的测定结果见图5中A， 干旱处理T3代纯合转 GmL16基因拟南芥植株株系L1、 L2、 L6的第10天、 第12天、 第14天、 第16天、 第18天和第20天的 拟南芥叶片相对含水。

48、量均高于干旱处理野生型拟南芥相应天数的拟南芥叶片相对含水量。 拟南芥叶片的相对电导率的测定结果见图5中B， 干旱处理T3代纯合转GmL16基因拟南芥植 株株系L1、 L2、 L6的第10天、 第12天、 第14天、 第16天、 第18天和第20天的拟南芥叶片相对电 导率均低于干旱处理野生型拟南芥相应天数的拟南芥叶片相对电导率。 0109 结果表明， T3代纯合转GmL16基因拟南芥的抗旱性明显提高。 说明书 8/8 页 10 CN 104744579 B 10 0001 序列表 1/3 页 11 CN 104744579 B 11 0002 序列表 2/3 页 12 CN 104744579 B 12 0003 序列表 3/3 页 13 CN 104744579 B 13 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 14 CN 104744579 B 14 图4 图5 说明书附图 2/2 页 15 CN 104744579 B 15 。