技术领域
本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种用于核酸实时荧光检测的新型探针。本发 明还涉及到“品形”探针的技术应用。
背景技术
聚合酶链反应（PCR）技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过 程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特 异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需 要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床 上应用越来越广泛。
实时荧光定量PCR检测技术最早使用荧光染料，例如SYBR GREEN， EVE-GREEN，以指示PCR反应。随后，实时荧光PCR检测技术中开始应用标记荧光 的核酸探针，例如5`-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标、荧光能量转移 探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩 增，尤其是由于引物二聚体引起的非特异性扩增，因此在实际应用中受到很大限制。探 针法对扩增产物具有第二识别步骤，从而避免了非特异扩增，结果更加可靠。不过，如 前所述的探针普遍存在设计复杂，荧光本底高，对单碱基突变识别能力有限等不足。
发明内容
本发明所要解决的首要技术问题是提供一种对核酸实时检测的探针，该探针在设计 思路上与前述的当前探针根本不同。此探针设计简单、易于合成、荧光本底低。本发明 的“品形”探针检测技术是基于对靶核酸的直接杂交，该探针由于5`端和3`端都具有与 探针内部互补的序列，可以形成3段双链和2个环形结构，5`端的荧光基团或荧光供体 与3`端的淬灭基团或荧光受体能充分靠近、荧光淬灭充分，所以在PCR退火时荧光本 底低，而两个环形结构也很容易打开，因此对靶序列的杂交效率高。
本发明所要解决的另外一个技术问题是提供上述探针的应用。
本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案为：一种用于核酸实时检测的探 针，其特征在于：探针是一条寡核苷酸，包括十个部分区域，3`端的第一区域与5`端的 第八区域形成第一段双链，使得5`端连接的荧光基团或荧光供体与3`端连接的淬灭基 团或荧光受体靠近，从而无荧光发出；第二区域和第四区域配对、第五区域和第七区域 配对，构成另外2段双链；而第三区域和第六区域分别形成两个环形结构；并使探针的 第三区、第四区、第五区、第六区的碱基与靶序列互补，形成靶序列结合区。
作为优选，所述的位于3`端和5`端第一段双链结合区的长度为5-20bp。
作为优选，所述的位于3`端与所述的靶序列结合区中一段序列互补双链结合区的 长度为3-10bp。也就是第二区域和第四区域配对一段双链的长度是3-10bp。
作为优选，所述的位于5`端与所述的靶序列结合区中一段序列互补双链结合区的长 度为3-10bp。也就是第五区域和第七区域配对一段双链的长度是3-10bp。
作为优选，靠近所述的靶序列结合区3`端的3`端环形结构的长度为3-15bp。也就 是第三区域的单链环形结构的长度是3-15bp。
作为优选，靠近所述的靶序列结合区5`端的5`端环形结构的长度为3-15bp。也就 是第六区域的单链环形结构的长度是3-15bp。
作为优选，所述的探针总长度为20-100bp，其中靶序列结合区10-50bp。
优选，所述的探针为DNA或RNA。
再改进，所述的靶序列结合区中，可以引入至少一个或不引入非自然的核苷。
作为改进，所述的第一段双链在中心线位置，而第二区域和第四区域配对双链和第 五区域和第七区域配对双链接着分布在第一段双链的两侧，第三区域的环形结构在第二 区域和第四区域配对双链之间，第六区域的环形结构在第五区域和第七区域配对双链之 间。最后构成大体品字形探针。
最后，所述的探针内部双链结合区域Tm值与扩增引物Tm值相当或高于退火温度 2-12℃。
本发明解决另外一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述的用于核酸实时检测 的探针，其特征在于在靶序列实时PCR检测方法上应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
设计简单：品形探针时没有太多要求，探针序列为扩增靶序列的一部分，只要探针 的双链结合区的Tm值与相应的PCR反应体系中的引物或使用的退火温度保持一致或高 出。任何设计过PCR引物的人员都可以设计。
荧光本底低：荧光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果理想。
适用范围广：对于目前现存的荧光探针而言，其对AT富集区和GC富集区的困难 模板，有着很好的应用性。
易于设计兼并探针：设计时在保证有效特异性的情况下，可对存在着小区域的多变 碱基的多型别模板能很好的指示，现有的多种探针大多数是通过增加与相应的模板匹配 探针条数来解决问题，而“品形”探针则能很好的通过设计解决类似问题。
合成简单：无需任何特别的仪器，只需普通的DNA合成仪即可完成合成。
特异性高：由于本探针存在三段自身的反向互补双链结构，只有当靶序列与探针结 合区的结合力大于反向互补链结合的能量，探针才可以与靶序列发生杂交，放出荧光信 号。如果与靶序列中存在突变，如单碱基的改变，该探针可以保持自身环形结构的稳定。 另外，由于自身存在三段反向互补双链结构，设计时可以调节互补区域的长短，来调整 探针的特异性。
附图说明
图1“品形”探针及其反应原理的示意图；
图2“品形”探针应用在实时PCR检测的有效性示意图；
图3“品形”探针用于区分单碱基突变(或SNP)靶序列示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明的技术方案如下：
该探针为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5`端和3`端分别存在10-30个碱基，在一定条 件下可以和探针内部序列互补配对结合，形成3段双链和2个环形结构，寡核苷酸的5` 端标记有荧光基团或荧光供体，3`端标记有淬灭基团或者荧光受体。在一定条件下，探 针部分形成双链和环形结构，当探针与靶序列杂交时，双链部分被打开，环形结构消失， 探针呈线性结构，5`端标记的荧光基团或荧光供体与3`端标记的淬灭基团或者荧光受体 充分展开，荧光强度随之增强。合适条件下，该探针可以与之完成互补的靶序列结合； 而只要靶序列里含有一个碱基的突变，该探针仍然保持双链和环形结构。据此，本发明 的探针可以被用于实时PCR中靶核酸的检测。
本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，LNA(锁核酸)，或PNA(肽核酸)， 或任何非自然核苷组成。
“品形”探针的设计方法
探针内部双链结合区域Tm值：在大多数情况下，探针互补碱基为15-30bp，其Tm 值与扩增引物Tm值相当或高于退火温度2-5℃。根据本发明的一部分具体实施方案的 实验结果，如用于单碱基突变区分检测的实时PCR的“品形”探针互补区Tm值可以高 于退火温度3-8℃。对于作为拥有多突变去靶序列的共用探针，双链结合部分的Tm值， 可以高于退火温度5-12℃。
探针的长度：一般情况，探针总长度为30-80bp，靶序列区8-30bp，探针内部互补 区即双链结合区10-40bp，5`端与3`端环形区域长度3-10bp。
荧光标记位置：荧光基团和淬灭基团都可以标记在探针的5`端和3`端，但是一端 只能标记荧光基团和淬灭基团其中的一种。
非自然核苷酸的使用：任何非自然核苷酸，如LNA，均可以在探针的任何位置使 用。
“品形”探针的最适检测结构：“品形”探针可以用于实时PCR中特异靶序列的扩 增检测。荧光基团的信号在退火阶段被检测。目前“品形”探针适用实时PCR仪器包 括：Roche公司的LightCycler2.0、LightCycler480，Applied Biosystems(ABI)公司的7300、 7500、7700，Bio-Rad公司的IQ Cycler，Corbett Research公司的Rotor-Gene3000、6000， Strategene公司的MX3000P和MX3005P等等。
具体实施方式
“品形”探针的构成
本发明的“品形”探针为一条寡核苷酸，寡核苷酸的5`端和3`端都存在可以与探 针内部互补、结合的15-30bp，在一定条件下此2个区域的序列可以与探针内部结合为 双链，使探针形成3段双链和2个环状结构，寡核苷酸的5`端标记有荧光基团或荧光供 体，3`端标记有淬灭基团或荧光受体，荧光基团和2个环形结构构成“品”字形状，谓 之“品形”探针。在不同的条件下“品形”探针可以有不同的形态，荧光值也随之变化。 当探针自身杂交为部分双链，形成3段双链和2个环形结构时，荧光基团和淬灭基团空 间上距离很近，荧光基团发射出的荧光被淬灭基团淬灭，探针无荧光发出。当条件发生 变化时，比如酸性、碱性或高温时，探针双链被打开，环形结构消失，荧光基团和淬灭 基团分开，距离拉大，超过淬灭基团吸收荧光的范围，荧光基团发出荧光。在一定的杂 交条件下，比如PCR的退火阶段，探针可以和反应液中的靶序列结合，探针的双链部 分被打开，环形结构消失，荧光基团和淬灭基团分开，超过淬灭基团吸收荧光的范围， 荧光基团发出荧光。
“品形”探针与靶序列反应
“品形”探针可以与溶液中单链寡核苷酸发生反应。探针的环状部分以及探针内部 双链结合区可以和靶序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。“品形”探针双链的 打开和环形的消失引起荧光的产生。“品形”探针可以在该反应中，将完全匹配的靶序 列检测出来，见图1。
根据图1，“品形”探针由十个部分组成，3`端的1与5`端的8形成第一段双链， 使得5`端连接的荧光基团或荧光供体10与3`端连接的淬灭基团或荧光受体9靠得很近， 此时无荧光发出；此外，第二区域2和第四区域4配对、第五区域5和第七区域7配对 构成另外2段双链，并形成第三区域3和第六区域6的两个环形结构；探针的第三区域 3、第四区域4、第五区域5、第六区域6区的碱基与靶序列互补，本发明中谓之靶序列 结合区。当温度升高探针变性后，其3段双链打开，环形结构消失；在靶序列11存在 时发生退火，探针的靶序列结合区与靶DNA结合，探针内部的双链结构和环形结构不 再形成，使探针5`端和3`端的荧光基团和淬灭基团分开，无法靠近，从而发出荧光；在 靶序列11不存在时发生退火，探针的靶序列结合区无法与靶DNA结合，探针内部碱基 互补形成双链和环形结构，使探针5`端和3`端的荧光基团和淬灭基团靠近，无荧光发出； 在延伸阶段，探针会从靶序列上解离。这样在PCR反应的变性、退火和延伸三个周期 中，探针也会发生内部双链打开环形结构消失荧光基团和淬灭基团远离、在靶序列存在 时探针与靶序列结合发出荧光，无靶序列时探针内部形成双链和环形结构探针无荧光发 出、探针与靶序列解离的周期形变化。通过对PCR每个循环的退火阶段的荧光信号的 检测，在实时状态中扩增产物就可以被检测到了。
只要调节探针自身双链结合部位互补碱基的数量以及环形区域碱基的数量，就可以 调节探针对突变碱基或不匹配碱基的区分检测能力。对单碱基突变区分，双链结合部分 要有一定的Tm值和碱基数量，探针区域Tm值约比双链结合部分Tm值高2-5℃。对于 作为拥有多变区靶序列的共用探针，探针区域Tm值约比双链结合部分Tm值高5-10℃。
应用实施例1：“品形”探针应用在实时PCR检测的有效性
为考察“品形”探针应用在实时PCR检测的有效性，PCR模板为一系列稀释的标 准DNA样品，其序列为 CCAGAGGTCATCGAGGTGCTCGTAGTCGGAGCGTCCCTGCGAGGCTATGACCTCT GGATACGACCTTCCAGTCGAGGATGTTTACAAGCTGA，长93bp，反应总体积为20 μl，包括Universal PCR Master Mix（美国AB公司产品，产品号：4324018）10μl， 10μM的正、反向引物及探针各0.5μl，DEPC水7.0μl，102、103、104、105、106稀 释的DNA模板1.5μl，水1.5μl作为阴性对照。实时PCR反应在AB7500实时PCR 仪上进行。反应条件为95℃10min；93℃15s，59℃20s(检测FAM荧光信号)，72℃15s， 共40个循环。前向引物为：5`-TCAGCTTGTAAACATCCTCG-3`，反向引物为： 5`-CCAGAGGTCATCGAGGTGCT-3`，探针的靶序列靠近前向引物，序列为： FAM-5`-ttcctagAGATATGACCTCTGGATACGACCCCTctaggaa-3`-TAMRA。探针中小写 部分的碱基互补配对形成第一段双链，使得连接在5`端和3`端荧光基团和淬灭基团靠近 在一起，下划线标示的碱基互补配对形成另外两段双链和两个环形结构。
在整个PCR扩增中荧光实时检测测量了40个循环，其结果如图2所示。102、103、 104、105、106稀释的靶DNA模板对应的扩增曲线依次为14、15、16、17、18，曲线 19为无靶DNA（水）的空白对照。可见“品形”探针能够很快与靶序列杂交，显示出 荧光信号。没有靶序列存在时，探针内部互补的碱基内部配对形成双链和环形结构，荧 光基团和淬灭基团靠近，发出的荧光被自身淬灭。因此，“品形”探针可以用于实时核 酸扩增检测，具有实际应用价值。
应用实施例2：“品形”探针用于区分单碱基突变(或SNP)靶序列
选择上述实施例1中的靶序列，使其某个位点发生人为突变，突变后的序列为： CCAGAGGTCATCGAGGTGCTCGTAGTCGGAGCGTCCCTGCGAGGCTATGCTCTG GATACGACCTTCCAGTCGAGGATGTTTACAAGCTGA，方框标示的碱基为突变碱基。 针对突变序列设计的“品形”探针序列为 FAM-5`-ttcctagAGATATGCTCTGGATACGACCCCTctaggaa-3`-TAMRA，探针中小写 部分的碱基互补配对形成第一段双链，使得连接在5`端和3`端荧光基团和淬灭基团靠近 在一起，下划线标示的碱基互补配对形成另外两段双链和两个环形结构，方框标示的碱 基为突变碱基。反应总体积为20μl，包括Universal PCR Master Mix（美国AB公司产 品，产品号：4324018）10μl，10μM的正、反向引物及探针各0.5μl，DEPC水7.0μ l，102、103、104、105、106稀释的DNA模板1.5μl，水1.5μl作为阴性对照。实时 PCR反应在AB7500实时PCR仪上进行。反应条件为95℃10min；93℃15s，59℃20s (检测FAM荧光信号)，72℃15s，共40个循环。
图3显示对完全互补的突变靶序列(曲线20)和野生靶序列(曲线21)的实时荧光信号 的示意图。可见如果在靶序列中探针结合区只要有一个或以上的核苷酸不同，将不会产 生荧光信号。
序列表
<110>刘晓光
<120>一种用于核酸实时检测的探针及其应用
<160>6
<210>1
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ccagaggtcatcgaggtgctcgtagtcggagcgtccctgcgaggctatgacctctggata
cgaccttcca gtcgaggatgtttacaagctga 92
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcagct tgta aacatcctgg 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccagaggtcatcgaggtgct 20
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ttcctagaga tatgacctctggatacgacc cctctaggaa 40
<210>5
<211>92
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccagaggtca tcgaggtgct cgtagtcgga gcgtccctgc gaggctatga cctctggata
cgaccttcca gtcgaggatgtttacaagctga 92
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttcctagaga tatgatctctggatacgacc cctctaggaa 40