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1、(10)申请公布号 CN 103834571 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103834571 A (21)申请号 201210471741.9 (22)申请日 2012.11.21 C12N 1/14(2006.01) C12R 1/82(2006.01) (71)申请人 青岛百草汇中草药研究所 地址 266600 山东省青岛市莱西市上海路 65 号 (72)发明人 张伟宝 (54) 发明名称 一种产黄青霉菌的梯度高浓度青霉素培养基 选育法 (57) 摘要 本发明涉及一种产黄青霉菌菌种的优选方 法， 具体是， 将普通工业生产用产黄青霉菌菌株从 米孢子出发， 经调配溶液、。
2、 梯度高浓度青霉素平板 培养基筛选、 复筛、 验证而获得耐受性好的高产菌 株。采用梯度高浓度青霉素培养基筛选的菌株的 方法， 开辟了工业发酵生产用产黄青霉菌的优选 的新途径。该方法操作简便， 所用仪器设备少， 成 本低廉， 效率高， 易于工业生产推广应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103834571 A CN 103834571 A 1/1 页 2 1. 一种产黄青霉菌菌种的优选方法， 其特征在于 ： 将工业发酵用米孢子的悬浊液， 涂 布在含有高。
3、浓度梯度青霉素的 PDA 培养基上诱变并初筛， 在培养箱中培养， 以菌落的形态 为特征选出优良菌株， 然后再用含青霉素的 PDA 平板复筛， 选出表现优良的菌株， 接种到摇 瓶中微量发酵， 以效价为特征选出优良高产菌株。 2. 如权利要求 1 所述的一种产黄青霉菌菌种的优选方法， 其特征在于所述米孢子悬 浊液 ： 是将工业发酵用米孢子用灭菌水洗脱， 制成 1106 1107个孢子 /ml 的悬浊液。 3. 如权利要求 1 所述的一种产黄青霉菌菌种的优选方法， 其特征在于 ： 初筛用 PDA 培养基所含青霉素的浓度分别为 ： 5060mg/ml， 6070mg/ml， 7080mg/ml， 80。
4、90mg/ml， 90100mg/ml， 100110mg/ml。 4. 如权利要求 1 所述的一种产黄青霉菌菌种的优选方法， 其特征在于 ： 复筛用 PDA 培 养基所含青霉素的浓度为 6070mg/ml。 权 利 要 求 书 CN 103834571 A 2 1/3 页 3 一种产黄青霉菌的梯度高浓度青霉素培养基选育法 0001 摘要 本发明涉及一种产黄青霉菌菌种的优选方法， 具体是， 将普通工业生产用产黄青霉菌 菌株从米孢子出发， 经调配溶液、 梯度高浓度青霉素平板培养基筛选、 复筛、 验证而获得耐 受性好的高产菌株。采用梯度高浓度青霉素培养基筛选的菌株的方法， 开辟了工业发酵生 产用产。
5、黄青霉菌的优选的新途径。 该方法操作简便， 所用仪器设备少， 成本低廉， 效率高， 易 于工业生产推广应用。 技术领域 0002 本发明属于工业发酵生产用产黄青霉菌的高产菌株优选， 特别涉及的是一种用含 梯度高浓度的青霉素的 PDA 培养基诱变筛选普通菌株， 从而获得高产菌株的方法。 背景技术 0003 青霉素作为我国两大战略性原料药品之一， 不仅是人们健康生活的保障， 同时也 对我国在世界药品市场的地位有重要的影响。 0004 我国青霉素工业菌种的发酵能力， 发酵指数和生产成本与国外企业相比还有很大 差距， 国外工业菌株发酵能力约是我国的 1.8 倍， 其发酵成本仅占售价的 25%， 而我国。
6、发酵 产品的生产成本占到售价的 50%60%。这使得我国发酵产品的利润空间和发酵工业的赢 利能力远低于国外同类企业。我国更多是以规模生产在国际市场参与竞争。 0005 青霉素的技术创新势在必行。而在技术创新中， 优良菌株的选育工作是其中的重 要组成部分， 一个耐受性好的高产菌株可以直接提高发酵效率， 带来巨大的经济效益。 0006 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种廉价高效的产黄青霉菌菌种的优选方法， 具体是， 将普 通工业生产用产黄青霉菌菌株从米孢子出发， 经调配溶液、 梯度高浓度青霉素平板培养基 筛选、 复筛、 验证而获得耐受性好的高产菌株。 0008 本发明的技术方案是 ： 将工。
7、业发酵用米孢子的悬浊液， 涂布在含有高浓度梯度青 霉素的 PDA 培养基上诱变并初筛， 在培养箱中培养， 以菌落的形态为特征选出优良菌株， 然 后再用含青霉素的 PDA 平板复筛， 选出表现优良的菌株， 接种到摇瓶中微量发酵， 以效价为 特征选出优良高产菌株。 0009 米孢子是工业发酵生产接种用的小米孢子。米孢子悬浊液是将工业发酵用米孢 子用灭菌水洗脱， 制成 1106 1107个孢子 /cm3的悬浊液。在无菌工作台上， 将稀释好 的悬浊液涂布在含青霉素浓度分别为 ： 5060mg/ml， 6070mg/ml， 7080mg/ml， 8090mg/ml， 90100mg/ml， 100110。
8、mg/ml 的 PDA 平板培养基上， 每个浓度四个培养皿。然在培养箱中遮 光， 25培养 79 天观察菌落的特征和形态。 0010 菌落呈圆台型突起、 突起布满褶皱、 褶皱厚实均匀、 颜色呈灰绿色、 突起高且粗壮 说 明 书 CN 103834571 A 3 2/3 页 4 的为待验证的菌株， 选取靠近高浓度的一端的涂布 12 个平板， 一般每个平板上会有 36 个 符合要求的菌株， 把这些菌株全部挑出、 编号、 接种到含青霉素6070mg/ml的PDA平板培养 基上进行复筛， 同样在培养箱中 25静置培养。6 天后， 最符合上述优良菌落特征的菌株挑 出、 编号， 进一步验证， 将挑出的菌株。
9、接种到10ml试管培养基中， 在摇床上25， 摇床200转 / 分钟， 培养 56 小时， 再转接到装有 30ml 培养基的 250ml 摇瓶中， 摇床上 26， 摇床 200 转 / 分钟继续培养 6 天， 每天补加 2ml 浓度为 30% 的苯乙酸灭菌溶液。 0011 用培养六天后的发酵液， 测青霉素的效价， 效价在 3104IU/ml 以上的即为优良高 产菌株。 0012 本发明的优点是 ： 1、 采用含特定梯度浓度青霉素的 PDA 培养基诱变育种， 效率高， 操作程序简便， 所用仪 器设备少， 成本低， 是一种易于推广的青霉菌育种方法。 0013 2、 复筛和验证保证了诱变后新菌株的耐。
10、受性和稳定性， 高产效果明显， 在不到一 个月的时间里选育到 2 株新菌株， 效价增产分别为 9% 和 12%， 经济效益显著。 0014 具体实施方式 ： 实施例 1 ： 将工业发酵用米孢子用灭菌水洗脱， 制成 1106个孢子 /cm3的悬浊液。在无菌工作台 上， 将稀释好的悬浊液涂布在含青霉素浓度分别为 ： 50mg/ml， 60mg/ml， 70mg/ml， 80mg/ml， 90mg/ml， 100mg/ml 的 PDA 平板培养基上， 每个浓度四个直径 90mm 培养皿。然在培养箱中 遮光， 25培养 79 天观察菌落的特征和形态。菌落呈圆台型突起、 突起布满褶皱、 褶皱厚 实均匀、。
11、 颜色呈灰绿色、 突起高且粗壮的为待验证的菌株， 选取靠近高浓度的一端的涂布 12 个平板， 共计 60 个符合要求的菌株， 把这些菌株全部挑出、 编号、 接种到含青霉素 60mg/ml 的PDA平板培养基上进行复筛， 同样在培养箱中25静置培养6天， 最符合上述优良特征的 菌株共计 74 个挑出、 编号。再将挑出的菌株接种到 10ml 试管培养基中， 在摇床上 25， 摇 床 200 转 / 分钟， 培养 56 小时 ； 再转接到装有 30ml 培养基的 250ml 摇瓶中， 摇床上 26， 摇床 200 转 / 分钟继续培养 6 天， 每天补加 2ml 浓度为 30% 的苯乙酸灭菌溶液。用。
12、培养六 天后的发酵液， 测青霉素的效价， 效价在 3104IU/ml 以上的即为优良高产菌株。通过本实 施例， 获得一个耐受性好遗传稳定的新菌株， 其效价为 3.3104IU/ml， 可增产 9%。其中本 实施例中用到的培养基配方如下 ： 试管培养基 ( ) ： 蔗糖 2， 玉米浆 6.7， 碳酸钙 0.5， pH5.8 摇瓶培养基 ( ) ： 乳糖 13， 玉米浆 3， 甘 油 1.5， 碳酸钙 1， 部分无机盐类硫酸钠 0.5， 磷酸二氢钾 0.3， 硫酸镁 0.005， 硫酸铜 0.002， 磷酸二氢钾 0.03， 硫酸亚铁 0.0015， pH5.9。 0015 实施例 2 ： 将工业。
13、发酵用米孢子用灭菌水洗脱， 制成 1107个孢子 /cm3的悬浊液。在无菌工作台 上， 将稀释好的悬浊液涂布在含青霉素浓度分别为 ： 60mg/ml， 70mg/ml， 80mg/ml， 90mg/ml， 100mg/ml， 110mg/ml 的 PDA 平板培养基上， 每个浓度四个直径 90mm 培养皿。然在培养箱中 遮光， 25培养 79 天观察菌落的特征和形态。菌落呈圆台型突起、 突起布满褶皱、 褶皱厚 实均匀、 颜色呈灰绿色、 突起高且粗壮的为待验证的菌株， 选取靠近高浓度的一端的涂布 12 个平板， 共计 49 个符合要求的菌株， 把这些菌株全部挑出、 编号、 接种到含青霉素 60m。
14、g/ml 说 明 书 CN 103834571 A 4 3/3 页 5 的PDA平板培养基上进行复筛， 同样在培养箱中25静置培养6天， 最符合上述优良特征的 菌株共计 68 个挑出、 编号。再将挑出的菌株接种到 10ml 试管培养基中， 在摇床上 25， 摇 床 200 转 / 分钟， 培养 56 小时 ； 再转接到装有 30ml 培养基的 250ml 摇瓶中， 摇床上 26， 摇床 200 转 / 分钟继续培养 6 天， 每天补加 2ml 浓度为 30% 的苯乙酸灭菌溶液。用培养六 天后的发酵液， 测青霉素的效价， 效价在 3104IU/ml 以上的即为优良高产菌株。通过本实 施例， 获得一个耐受性好遗传稳定的新菌株， 其效价为 3.4104IU/ml， 可增产 12%。其中本 实施例中用到的培养基配方如下 ： 试管培养基 ( ) ： 蔗糖 2， 玉米浆 6.7， 碳酸钙 0.5， pH5.8 摇瓶培养基 ( ) ： 乳糖 13， 玉米浆 3， 甘 油 1.5， 碳酸钙 1， 部分无机盐类硫酸钠 0.5， 磷酸二氢钾 0.3， 硫酸镁 0.005， 硫酸铜 0.002， 磷酸二氢钾 0.03， 硫酸亚铁 0.0015， pH5.9。 说 明 书 CN 103834571 A 5 。