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一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用.pdf

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文档编号：8713367

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410068610.5 (22)申请日 2014.02.27 C12N 15/867(2006.01) (73)专利权人南京医科大学地址 210029 江苏省南京市江宁区天元东路 818 号 (72)发明人陈云林喆孙倍成唐俊伟万昕卓晗夏阳 (74)专利代理机构江苏圣典律师事务所 32237 代理人孙忠浩 CN 101684478 A,2010.03.31, CN 102634542 A,2012.08.15, CN 102876698 A,2013.01.16, WO 2009097136 A1,2009.08。

2、.06, 丁洁等 . 携 eGFP 及表达人 gp100-TCR 基因的慢病毒表达载体的构建与鉴定 .免疫学杂志 .2011, 第 27 卷 ( 第 2 期 ),154-157. 王婷婷等 .hNoc4L 基因重组慢病毒表达载体的构建与鉴定 .生物工程学报 .2010, 第 26 卷 ( 第 11 期 ),1574 页右栏第 2 段 . Yu Qi Qiao 等 .LncRNA DQ786243 affects Treg related CREB and Foxp3 expression in Crohns disease.Journal of Biomedical Science 。

3、.2013,1-7. Peter T. Jindra 等 .Costimulation-Dependent Expression of MicroRNA-214 Increases the Ability of T Cells To Proliferate by Targeting Pten. The Journal of Immunology .2010,1-8. Nan Li等.Siva1 suppresses epithelial mesenchymal transition and metastasis of tumor cells by inhibiting stathmin and。

4、 stabilizing microtubules.PNAS .2011, 第 108 卷 ( 第 31 期 ),12855 页右栏第 1 段 . Andrea Ventura 等 .Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.PNAS .2004, 第 101 卷 ( 第 28 期 ),10380-10385. (54) 发明名称一种用于表达 lncRNA 的慢病毒载体及其应用 (57) 摘要本发明公开一种用于表达 lncRNA 的慢病毒载体及其应用，所述慢病毒载体的核苷酸序列如 SEQ ID NO.。

5、5所示，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2 基因替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQ ID NO.4 的合成序列替换 mU6 启动子序列；所述慢病毒载体用于 lncRNA 异位表达，不产生任何有效的细胞免疫应答，可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，转基因表达能持续数月，且引入 luc2 基因，不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员王宽 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书1页说明书7页序列表29页附图3页 CN 103834692 。

6、B 2016.03.30 CN 103834692 B 1.一种用于表达lncRNA的慢病毒载体，其特征在于，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQIDNO.4的合成序列替换mU6启动子序列，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。 2.如权利要求1所述的用于表达lncRNA的慢病毒载体在lncRNA异位表达中的应用。 3.如权利要求2所述的应用，所述lncRNA为LncRNAMEG3。权利要求书 1/1 页 2 CN 103834692 B 2 一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用技术领域 0001 本发明属。

7、于基因工程领域，特别是一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用。技术背景 0002 长链非编码RNA （longnoncodingRNA,以下简称lncRNA）是一类长度大于200nt 且不表现任何蛋白质编码潜能的非编码RNA （ncRNA）。 lncRNA在结构上类似于信使RNA （mRNA），但序列中不存在开放阅读框(openreadingframe， ORF)。许多已知的lncRNA由RNA 聚合酶(RNApolymeraseII， RNApolII)转录并经可变剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。 lncRNA基因转录水平低于蛋白质编码基因，广泛存在于基因间内含子以及蛋。

8、白质编码基因的反义链中，有些与蛋白质编码基因或非编码基因相重叠，有些仅在特定的组织中被优先转录。 Kapranov等提出在人类细胞中，除核糖体RNA和线粒体RNA外，绝大部分RNA是未知功能的ncRNA，其中主要是lncRNA。目前已确定的lncRNA，多数通过顺式作用调控基因的表达，影响表观遗传转录转录后等过程，参与生物体的胚胎发育组织分化器官形成等基本生命活动。与miRNA相比， lncRNA序列更长空间结构更复杂，因此信息含量更加丰富；其参与表达调控的分子机制也更加多样，不仅可以通过直接结合来激活或抑制靶基因的表达，还能参与组蛋白修饰募集调控因子等。

9、； lncRNA作用范围也更加广泛，在染色质水平、表达水平和翻译水平均可发挥调控作用。虽然目前已确定的lncRNA很多，但对其在生命活动过程中的具体调控机制及功能模式仍不清楚。最新发现， lncRNA在一些复杂疾病(如癌症、神经系统疾病等)的发生过程中异常表达，具有促使或抑制疾病发生的作用。因此，研究lncRNA对于认识生命体复杂而多层次的调控体系提高人类预防和治疗疾病的能力以及探索生物进化规律等都具有积极的生物学意义。 0003 目前lncRNA的表达，多以真核质粒载体实现。但是真核质粒载体存在转染效率低，不易构建稳定细胞系等缺点，因此提供一种可以实现ln。

10、cRNA稳定的异位表达的载体，是本领域一直亟待解决的问题。发明内容 0004 针对上述lncRNA表达载体存在转染效率低、不易构建稳定细胞系的问题，构建一种添加人EF-1 启动子序列和SV40polyA转录终止信号序列的慢病毒载体，实现lncRNA稳定的异位表达，本发明是这样实现的： 0005 一种用于表达lncRNA的慢病毒载体，其特征在于，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因(NCBI中GI： 212717248)替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQIDNO.4的合成序列替换质粒mU6启动子序列，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。。

11、 0006 本发明中所述luc2(NCBI中GI： 212717248)基因是以SEQIDNO.1为上游引物， SEQ IDNO.2为下游引物，以pmirGLO质粒为模板扩增获得。 0007 本发明中，用于表达lncRNA的慢病毒载体在lncRNA异位表达中的应用。 0008 本发明中，用于表达lncRNA的慢病毒载体在LncRNAMEG3(NCBI中NR_002766.2)异说明书 1/7 页 3 CN 103834692 B 3 位表达中的应用。 0009 本发明的优点在于： 0010 1、相对于目前常用的真核表达质粒，以慢病毒作为表达载体，不产生任何有效的细胞免疫应答，。

12、可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。 0011 2、荧光素酶（Luciferase）基因（luc2基因），表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、 Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，在体外利用敏感的CCD设备形成图像，可以实时连续动态监测体内的各种生物学过程，减少实验动物数量，降低个体间差异的影响，具有较高的敏感性，并且不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察。附图说明 0012 图1为pLL3.7质粒结构示意图。 0013 图2为pLL3.7-lu。

13、c2质粒结构示意图。 0014 图3为pLnc-luc2质粒结构示意图。 0015 图4为pLnc-luc2-MEG3质粒结构示意图。 0016 图5为MEG3表达量表达量示意图。 0017 图6为荧光检测MEG3表达量示意图。具体实施方式 0018 实施例涉及材料： 0019 pmirGLO质粒（pmirGLODual-LuciferasemiRNATargetExpressionVector， E1330）、 pGEM-TEasyVectorSystem(E1910)由Promega公司购入； 0020 感受态细胞DH5 （CB101-03）和质粒小提试剂盒(型号DP103）由天。

14、根生化科技有限公司购入； 0021 TaqPlusDNAPolymerase(PC1200)由北京索莱宝公司购入； 0022 快速DNA产物纯化试剂盒(CW2301)由北京康为世纪公司购入； 0023 T4DNALigase(2011A)、 PrimeScripRTReagentKit(RR037Q)由TAKARA公司购入； 0024 限制性内切酶NheI （R0131S）、 EcoRI （R0101S）、 XbaI （R0145S）、 NotI （R0189S）、 BamHI （R0136S）和XhoI （R0146S）酶由NEB公司购入； 0025 pLL3.7质粒、 HE。

15、K-293T、 pCMVVSVG和pCMVdR8.91由本室保存； 0026 U251细胞由南京医科大学姚堃教授赠予； 0027 polybrene(sc-134220)由SantaCruz公司购入； 0028 RNeasyMiniKit(74104)由Qiagen公司购入； 0029 DMEM高糖培养基（11965-084）和FBS （10099141）由LifeTechnologies公司购入； 0030 AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AP-GX-4）由Axygen公司购入； 0031 胰酶细胞消化液（C0201）和荧光素酶报告基因检测试剂盒（RG005）由碧云天公。

16、司购入；说明书 2/7 页 4 CN 103834692 B 4 0032 实施例培养基配方： 0033 LB液体培养基： 0034 配制每升培养基,在900ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl5g，摇动容器直至溶质溶解，用去离子水定容至1L，在用5mol/LNaOH调pH至7.0；在 121下蒸汽灭菌20min； 0035 LB固体培养基： 0036 在900ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl5g，琼脂粉 15g，用去离子水定容至1L， 5mol/LNaOH调pH至7.0， 121蒸汽灭菌20min，待冷却至55。

17、时加入氨苄青霉素至终浓度100 g/ml，倾倒入无菌平板内，待凝固成LB固体培养基。 0037 DMEM完全培养基（含10%FBS）： DMEM高糖培养基与FBS按体积比9:1混合而成； 0038 实验设备： 0039 PCR仪为C1000Touch ，伯乐生命医学产品（上海）有限公司； 0040 荧光测定仪TurnerDesignsTD-20/20 （E2041）购自Promega公司； 0041 实施例涉及引物序列： 0042 SEQIDNO.1： CGGCTAGCATGGAAGATGCCAAAAACATTA ； 0043 SEQIDNO.2： CGGAATTCTTACA。

18、CGGCGATCTTGCCGCCC ； 0044 SEQIDNO.7： GGGCATTAAGCCCTGACCTT 3 ； 0045 SEQIDNO.8： CCTTGGGGAGGGAAACACTC 3 。 0046 实施例1慢病毒载体的构建 0047 1、 pLL3.7-luc2的构建 0048 1.1PCR反应： 0049 以pmirGLO质粒为模板，上游引物SEQIDNO.1，下游引物SEQIDNO.2扩增luc2； 0050 PCR反应体系40L，其中TaqPlusDNAPolymerase2L， Mastermix12L， pmirGLO质粒2L， 10mol/LSEQIDNO.1。

19、2L， 10mol/LSEQIDNO.22L， ddH2O20L ； 0051 PCR反应程序： 94预变性3min;94变性30s， 58退火30s， 72延伸60s，共进行30个循环； 72复性10min； 0052 1.2凝胶电泳： 0053 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 120V， 30min，依照说明书，用快速DNA产物纯化试剂盒回收目的片段，获得纯化PCR产物； 0054 1.3克隆载体的构建 0055 在0.2mlPCR管中加入5 L步骤1.2获得的纯化PCR产物、 1 L10XLigation buffer、 3 LPGEMTEasyVector、 1 LT4D。

20、NALigase， 4下连接过夜，次日获得连接产物； 0056 1.4感受态细菌的转化 0057 1.4.1取5 L步骤1.3获得的连接产物，加入50 L感受态细胞DH5 ，混匀后冰浴 30min，后42热击90s，再冰浴3min，加入500 LLB液体培养基，混匀后37， 200rpm/min 震荡培养45min，获得转化后的连接产物； 0058 1.4.2将x-gal40 L （20mg/ml）和IPTG4 L （200mg/ml）涂布于LB固体培养基上，说明书 3/7 页 5 CN 103834692 B 5 加入200 L步骤1.4.1获得的转化后的连接产物，。

21、37倒置培养20h，培养基上生成白色菌落，这些白色菌即具有重组质粒； 0059 1.5鉴定 0060 随机挑取步骤1.4.2获得的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37， 250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照说明书，使用质粒小提试剂盒获得重组质粒 DNA；然后由金斯瑞生物科技有限公司对所获得的的重组质粒DNA进行测序验证，其序列与 NCBI中GI： 212717248序列相同，确定为luc2基因。 0061 1.6重组pLL3.7质粒 0062 1.6.1对步骤1.5获得重组质粒DNA和pLL3.7 （其质粒结构如图1所示）质粒分别进行NheI和。

22、EcoRI双酶切，酶切体系分别为： 0063 重组质粒DNA6 L （310ng/ L） +10 xbuffer2 L+NheI1 L+EcoRI1 L+ ddH2O10 L； 0064 pLL3.7质粒（300ng/ L） 10 L+10 xbuffer2 L+NheI1 L+EcoRI1 L+ddH2O 6 L； 0065 将上述反应体系分别于37，反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳， 120V， 30min，后使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，分别按照说明书回收电泳产物，即分别为重组质粒DNA酶切后纯化产物和pLL3.7质粒酶切后纯化产物； 0066 1.6.2在0.。

23、2mlPCR管中加入5 L步骤1.6.1获得的重组质粒DNA酶切后纯化产物、 1 L10XLigationbuffer、 3 L步骤1.6.1获得的pLL3.7质粒酶切后纯化产物、 1 LT4 DNALigase， 4下连接过夜，次日获得连接产物；取10 L连接产物，加入50 L感受态细胞 DH5 ，混匀后冰浴30min，后42热击90s，再冰浴3min，加入500 LLB液体培养基，混匀后 37， 200rpm/min震荡培养45min后获得菌液；取200 L获得的菌液涂布于LB固体培养基上， 37倒置培养20h，培养基上生成菌落。 0067 1.6.3鉴定： 0068。

24、随机挑取步骤1.6.2获得的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37， 250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照其说明，使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，浓度为270ng/ L；然后将获得的重组质粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成测序，其序列如 SEQIDNO.3所示，申请人将其命名为pLL3.7-luc2，其质粒结构如图2所示。 0069 2、 pLnc-luc2构建 0070 2.1依人EF-1 启动子序列、 SV40polyA转录终止信号序列及XbaI和NotI酶切位点序列设计合成序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，交由金斯瑞生物科技有限。

25、公司完成基因合成； 0071 2.2对步骤2.1获得的的合成产物和步骤1.6.获得的pLL3.7-luc2质粒进行双酶切：酶切体系分别为： 0072 合成产物6 L （150ng/ L） +10 xbuffer2 L+XbaI1 L+NotI1 L+ddH2O 10 L； 0073 pLL3.7-luc2质粒10 L （300ng/ L） +10 xbuffer2 L+XbaI1 L+NotI1 L+ ddH2O6 L； 0074 将上述酶切体系分别置于37反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳， 120V， 30min，再使说明书 4/7 页 6 CN 103834692 B 6 用Ax。

26、yPrepDNA凝胶回收试剂盒，按照试剂盒操作要求回收电泳产物，获得合成序列酶切后纯化产物和pLL3.7-luc2质粒酶切后纯化产物； 0075 在0.2mlPCR管中加入5L合成序列酶切后纯化产物、 1L10XLigation buffer、 3 LpLL3.7-luc2质粒酶切后纯化产物、 1 LT4DNALigase， 4下连接过夜，次日获得连接产物；取10 L连接产物，加入50 L感受态细胞DH5 ，混匀后冰浴30min，后42 热击90s，再冰浴3min，加入500 LLB液体培养基，混匀后37， 200rpm/min震荡培养45min 后获得菌液；取200。

27、 L获得的菌液涂布于LB固体培养基上， 37倒置培养20h，培养基上生成菌落。 0076 鉴定：随机挑取生成的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37， 250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照其说明使用质粒小提试剂盒获得目的质粒，浓度为250ng/ L；将目的质粒交由金斯瑞生物科技有限公司对目的基因进行测序，其序列如 SEQIDNO.5所示，申请人将其命名为pLnc-luc2，其质粒结构如图3所示。 0077 实施例2 pLnc-luc2质粒表达LncRNAMEG3 0078 LncRNAMEG3质粒(NCBI中NR_002766.2)由金斯瑞生物科。

28、技有限公司完成基因合成。 0079 1、对LncRNAMEG3质粒和实施例1获得的pLnc-luc2质粒进行BamHI和XhoI双酶切，反应体系如下： 0080 LncRNAMEG3质粒6 L （260ng/ L） +10 xbuffer2 L+BamHI1 L+XhoI1 L+ ddH2O10 L； 0081 pLnc-luc2质粒10 L （320ng/ L） +10 xbuffer2 L+BamHI1 L+XhoI1 L+ ddH2O6 L； 0082 将上述反应体系分别置于37反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳， 120V， 30min，电泳后，使用AxyPrepDNA凝胶。

29、回收试剂盒，按照说明书，回收电泳产物，获得LncRNAMEG3 DNA酶切后纯化产物和pLnc-luc2质粒酶切后纯化产物； 0083 鉴定：在0.2mlPCR管中加入5 LLncRNAMEG3DNA酶切后纯化产物、 1 L10X Ligationbuffer、 3 LpLnc-luc2质粒酶切后纯化产物、 1 LT4DNALigase， 4下连接过夜，次日获得连接产物；取10 L连接产物，加入50 L感受态细胞DH5，混匀后冰浴 30min，后42热击90s，再冰浴3min，加入500 LLB液体培养基，混匀后37， 200rpm/min 震荡培养45min，获得。

30、菌液；取200 L获得的菌液涂布于LB固体培养基上， 37倒置培养 20h，培养基上生成菌落。 0084 随机挑取生成的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37， 250rpm/min 条件下震荡培养过夜，次日使用质粒小提试剂盒，依照说明书，获得重组质粒DNA，其浓度为 350ng/ L；将重组质粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成测序，其序列如SEQIDNO.6所示，从核苷酸序列中可以看出， MEG3基因已经插入到pLnc-luc2质粒中，申请人将该重组质粒自命名为pLnc-luc2-MEG3，其结构如图4所示。 0085 2、细胞培养及病毒包装 008。

31、6 2.1细胞培养及pLnc-luc2-MEG3病毒包装 0087 在6孔细胞培养板中每孔接种约1106个HEK-293T细胞，分别加入2mLDMEM完全培养基， 37， 5%CO2培养24h，当细胞汇合度达到80%90%时，按照lipofectin2000 说明书 5/7 页 7 CN 103834692 B 7 TransfectionReagent说明书（LifeTechnologies， 11668019）将三质粒系统(pLnc-luc2- MEG3， 1.5g;pCMVVSVG， 0.5g;pCMVdR8.91， 1g)转染至HEK-293T细胞中，转染 48h后，收。

32、集培养上清液， 4下， 3000g离心10min，去除细胞碎片，然后将所得上清液用0.22 m滤膜过滤，滤液即为pLnc-luc2-MEG3病毒液； 0088 2.2细胞培养及pLnc-luc2病毒包装 0089 在6孔细胞培养板中每孔接种约1106个HEK-293T细胞，分别加入2mLDMEM完全培养基， 37， 5%CO2培养24h，当细胞汇合度达到80%90%时，按照lipofectin2000 TransfectionReagent说明书（LifeTechnologies， 11668019）将三质粒系统(pLnc-luc2， 1.5g;pCMVVSVG， 0.5g;。

33、pCMVdR8.91， 1g)转染至HEK-293T细胞中，转染48h后，收集培养上清液， 4下， 3000g离心10min，去除细胞碎片，然后将上清液用0.22 m滤膜过滤，滤液即为pLnc-luc2病毒； 0090 3、慢病毒感染U251细胞 0091 3.1取步骤2.1获得的pLnc-luc2-MEG3病毒液0.2ml，加入1ml的DMEM高糖培养基稀释病毒，在加入终浓度为5 g/ml的polybrene，获得含pLnc-luc2-MEG3病毒的DMEM 培养基； 0092 3.2接种U251细胞于6孔板， 105个/孔，分别加入DMEM完全培养基2ml/孔， 3。

34、7， 5% CO2培养24h，待细胞密度约为50%时，去除培养基，分别加入步骤3.1获得的含pLnc-luc2- MEG3病毒的DMEM培养基， 1ml/孔，培养24h后，去除含pLnc-luc2-MEG3病毒的DMEM培养基培养基，分别加入DMEM完全培养基， 2ml/孔；再分别每孔加入1ml的胰酶细胞消化液，待细胞消化后，用DMEM完全培养基稀释成20个/ml，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔 0.05ml，细胞含量分别为1个/孔， 37， 5%CO2培养7天；选择只有一个集落生长的孔，待集落布满孔底的1/31/2时，传代入六孔板，即为pLnc。

35、-luc2-MEG3载体过表达细胞克隆株； 0093 3.3取步骤2.2获得的pLnc-luc2病毒液0.2ml，加入1ml的DMEM高糖培养基稀释病毒，在加入终浓度为5 g/ml的polybrene，获得含pLnc-luc2病毒的DMEM培养基； 0094 3.4接种U251细胞于6孔板， 105个/孔，加入DMEM完全培养基2ml/孔， 37， 5%CO2 培养24h，待细胞密度约为50%时，去除培养基，加入步骤3.3获得的含pLnc-luc2病毒的DMEM 培养基， 1ml/孔，培养24h后，去除含pLnc-luc2病毒的DMEM培养基，加入DMEM完全培养基， 2。

36、 ml/孔；再每孔加入1ml的胰酶细胞消化液，待细胞消化后，用DMEM完全培养基稀释成20个/ ml，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为1个/孔， 37， 5% CO2培养7天。选择只有一个集落生长的孔，待集落布满孔底的1/31/2时，传代入六孔板，即为pLnc-luc2载体过表达细胞克隆株； 0095 4、荧光定量PCR检测MEG3基因表达量 0096 分别接种U251细胞、步骤3.4获得的pLnc-luc2载体过表达细胞和步骤3.2获得的 pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞于培养瓶（25cm生长面积）中，分别编号1-3。

37、，在细胞铺满 80%90%瓶底面积时，依照说明书，分别用RNeasyMiniKit提取各组细胞的总RNA，利用 PrimeScripRTReagentKit将总RNA逆转录为cDNA （依照PrimeScripRTReagentKit说明书），分别以1-3组细胞的cDNA为模板，上游引物SEQIDNO.7，下游引物SEQIDNO.8，利用SYBRPrimescriptRT-PCRKit （依照PrimescriptRT-PCRKit说明书），依照表1所示反应体系检测各组细胞MEG3基因相对表达量。说明书 6/7 页 8 CN 103834692 B 8 0097 。

38、表1MEG3基因检测20L体系中各组分 0098 编号cDNA上游引物10mol/L下游引物10mol/LSYBR Green solution灭菌双蒸水 1U251 2 L0.4 L0.4 L10 L7.2 L 2pLnc-luc2 2 L0.4 L0.4 L10 L7.2 L 3pLnc-luc2-MEG3 2 L0.4 L0.4 L10 L7.2 L 0099 所得数据用2- CT方法分析，结果如图5所示， pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞相对于对照MEG3表达量升高，表明过表达构建成功。 0100 5、分别接种U251细胞、步骤3.4获得的Lnc-luc2载体过表达。

39、细胞和步骤3.2获得的pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞于培养瓶中（（25cm生长面积）），在细胞铺满80%90%瓶底面积时，吸尽细胞培养液后，按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书分别加入报告基因细胞裂解液0.5ml，充分裂解后， 10000-15000g离心5min，取离心后的上清液100 l，分别加入100 l荧光素酶检测试剂，测定RLU(relativelightunit)，以细胞裂解液为背景荧光组，实验结果如图6所示， pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞相对于对照荧光值升高，表明过表达构建成功。说明书 7/7 页 9 CN 10。

40、3834692 B 9 SEQUENCELISTING 南京医科大学一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用 8 8 PatentInversion3.3 1 30 DNA 人工合成 1 cggctagcatggaagatgccaaaaacatta30 2 30 DNA 人工合成 2 cggaattcttacacggcgatcttgccgccc30 3 8583 DNA 人工合成 3 gtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctg60 atgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgt。

41、gttggaggtcgctgagtagt120 序列表 1/29 页 10 CN 103834692 B 10 gcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatc180 tgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgac240 attgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccat300 atatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc。

42、gcccaacg360 acccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactt420 tccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaag480 tgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc540 attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattag600 tcatcgctattaccatggtgatgcggttttgg。

43、cagtacatcaatgggcgtggatagcggt660 ttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggc720 accaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgg780 gcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtct840 ctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgctt900 aagcctcaataa。

44、agcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgac960 tctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggc1020 gcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactc1080 ggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaa1140 ttttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtatt。

45、aagcggg1200 ggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatata1260 序列表 2/29 页 11 CN 103834692 B 11 aattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcc1320 tgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcaga1380 caggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatc1。

46、440 aaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaaca1500 aaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgcgctgatcttcagacctggaggagga1560 gatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaacca1620 ttaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtg1680 ggaataggagctttgttccttgggttcttgggagca。

47、gcaggaagcactatgggcgcagcg1740 tcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaac1800 aatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatc1860 aagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctg1920 gggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagt1980 tggagtaataa。

48、atctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacaga2040 gaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaa2100 gaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggttt2160 aacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggta2220 ggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcag。

49、ggatattca2280 ccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaata2340 gaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggca2400 ctgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaagg2460 序列表 3/29 页 12 CN 103834692 B 12 ggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacataca2520 aactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacaggga2580 cagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagagatccgacgccgccatctc2640 taggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactc。

摘要
申请专利号：	CN201410068610.5	申请日：	20140227
公开号：	CN103834692B	公开日：	20160330
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12N15/867	主分类号：	C12N15/867
申请人：	南京医科大学
发明人：	陈云,林喆,孙倍成,唐俊伟,万昕,卓晗,夏阳
地址：	210029 江苏省南京市江宁区天元东路818号
优先权：	CN201410068610A
专利代理机构：	江苏圣典律师事务所	代理人：	孙忠浩
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内容摘要

本发明公开一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQ?ID?NO.4的合成序列替换mU6启动子序列；所述慢病毒载体用于lncRNA异位表达，不产生任何有效的细胞免疫应答，可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，转基因表达能持续数月，且引入luc2基因，不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察。

权利要求书

1.一种用于表达lncRNA的慢病毒载体，其特征在于，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQIDNO.4的合成序列替换mU6启动子序列，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。 2.如权利要求1所述的用于表达lncRNA的慢病毒载体在lncRNA异位表达中的应用。 3.如权利要求2所述的应用，所述lncRNA为LncRNAMEG3。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用。

技术背景

长链非编码RNA（longnoncodingRNA,以下简称lncRNA）是一类长度大于200nt 且不表现任何蛋白质编码潜能的非编码RNA（ncRNA）。lncRNA在结构上类似于信使RNA （mRNA），但序列中不存在开放阅读框(openreadingframe，ORF)。许多已知的lncRNA由RNA 聚合酶(RNApolymeraseII，RNApolII)转录并经可变剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。 lncRNA基因转录水平低于蛋白质编码基因，广泛存在于基因间内含子以及蛋白质编码基因的反义链中，有些与蛋白质编码基因或非编码基因相重叠，有些仅在特定的组织中被优先转录。Kapranov等提出在人类细胞中，除核糖体RNA和线粒体RNA外，绝大部分RNA是未知功能的ncRNA，其中主要是lncRNA。目前已确定的lncRNA，多数通过顺式作用调控基因的表达，影响表观遗传转录转录后等过程，参与生物体的胚胎发育组织分化器官形成等基本生命活动。与miRNA相比，lncRNA序列更长空间结构更复杂，因此信息含量更加丰富；其参与表达调控的分子机制也更加多样，不仅可以通过直接结合来激活或抑制靶基因的表达，还能参与组蛋白修饰募集调控因子等；lncRNA作用范围也更加广泛，在染色质水平、表达水平和翻译水平均可发挥调控作用。虽然目前已确定的lncRNA很多，但对其在生命活动过程中的具体调控机制及功能模式仍不清楚。最新发现，lncRNA在一些复杂疾病(如癌症、神经系统疾病等)的发生过程中异常表达，具有促使或抑制疾病发生的作用。因此，研究lncRNA对于认识生命体复杂而多层次的调控体系提高人类预防和治疗疾病的能力以及探索生物进化规律等都具有积极的生物学意义。

目前lncRNA的表达，多以真核质粒载体实现。但是真核质粒载体存在转染效率低，不易构建稳定细胞系等缺点，因此提供一种可以实现lncRNA稳定的异位表达的载体，是本领域一直亟待解决的问题。

发明内容

针对上述lncRNA表达载体存在转染效率低、不易构建稳定细胞系的问题，构建一种添加人EF-1α启动子序列和SV40polyA转录终止信号序列的慢病毒载体，实现lncRNA稳定的异位表达，本发明是这样实现的：

一种用于表达lncRNA的慢病毒载体，其特征在于，以pLL3.7质粒为骨架，以luc2基因(NCBI中GI：212717248)替换质粒EGFP基因，以核苷酸序列为SEQIDNO.4的合成序列替换质粒mU6启动子序列，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

本发明中所述luc2(NCBI中GI：212717248)基因是以SEQIDNO.1为上游引物，SEQ IDNO.2为下游引物，以pmirGLO质粒为模板扩增获得。

本发明中，用于表达lncRNA的慢病毒载体在lncRNA异位表达中的应用。

本发明中，用于表达lncRNA的慢病毒载体在LncRNAMEG3(NCBI中NR_002766.2)异位表达中的应用。

本发明的优点在于：

1、相对于目前常用的真核表达质粒，以慢病毒作为表达载体，不产生任何有效的细胞免疫应答，可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。

2、荧光素酶（Luciferase）基因（luc2基因），表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，在体外利用敏感的CCD设备形成图像，可以实时连续动态监测体内的各种生物学过程，减少实验动物数量，降低个体间差异的影响，具有较高的敏感性，并且不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察。

附图说明

图1为pLL3.7质粒结构示意图。

图2为pLL3.7-luc2质粒结构示意图。

图3为pLnc-luc2质粒结构示意图。

图4为pLnc-luc2-MEG3质粒结构示意图。

图5为MEG3表达量表达量示意图。

图6为荧光检测MEG3表达量示意图。

具体实施方式

实施例涉及材料：

pmirGLO质粒（pmirGLODual-LuciferasemiRNATargetExpressionVector， E1330）、pGEM-TEasyVectorSystem(E1910)由Promega公司购入；

感受态细胞DH5α（CB101-03）和质粒小提试剂盒(型号DP103）由天根生化科技有限公司购入；

TaqPlusDNAPolymerase(PC1200)由北京索莱宝公司购入；

快速DNA产物纯化试剂盒(CW2301)由北京康为世纪公司购入；

T4DNALigase(2011A)、PrimeScripRTReagentKit(RR037Q)由TAKARA公司购入；

限制性内切酶NheI（R0131S）、EcoRI（R0101S）、XbaI（R0145S）、NotI（R0189S）、 BamHI（R0136S）和XhoI（R0146S）酶由NEB公司购入；

pLL3.7质粒、HEK-293T、pCMV－VSV－G和pCMV－dR8.91由本室保存；

U251细胞由南京医科大学姚堃教授赠予；

polybrene(sc-134220)由SantaCruz公司购入；

RNeasyMiniKit(74104)由Qiagen公司购入；

DMEM高糖培养基（11965-084）和FBS（10099141）由LifeTechnologies公司购入；

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AP-GX-4）由Axygen公司购入；

胰酶细胞消化液（C0201）和荧光素酶报告基因检测试剂盒（RG005）由碧云天公司购入；

实施例培养基配方：

LB液体培养基：

配制每升培养基,在900ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl5g，摇动容器直至溶质溶解，用去离子水定容至1L，在用5mol/LNaOH调pH至7.0；在 121℃下蒸汽灭菌20min；

LB固体培养基：

在900ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，琼脂粉 15g，用去离子水定容至1L，5mol/LNaOH调pH至7.0，121℃蒸汽灭菌20min，待冷却至55℃ 时加入氨苄青霉素至终浓度100μg/ml，倾倒入无菌平板内，待凝固成LB固体培养基。

DMEM完全培养基（含10%FBS）：DMEM高糖培养基与FBS按体积比9:1混合而成；

实验设备：

PCR仪为C1000Touch?，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；

荧光测定仪TurnerDesignsTD-20/20（E2041）购自Promega公司；

实施例涉及引物序列：

SEQIDNO.1：５′CGGCTAGCATGGAAGATGCCAAAAACATTA３′；

SEQIDNO.2：５′CGGAATTCTTACACGGCGATCTTGCCGCCC３′；

SEQIDNO.7：５′GGGCATTAAGCCCTGACCTT3′；

SEQIDNO.8：５′CCTTGGGGAGGGAAACACTC3′。

实施例1慢病毒载体的构建

1、pLL3.7-luc2的构建

1.1PCR反应：

以pmirGLO质粒为模板，上游引物SEQIDNO.1，下游引物SEQIDNO.2扩增luc2；

PCR反应体系40μL，其中TaqPlusDNAPolymerase2μL，Mastermix12μL， pmirGLO质粒2μL，10μmol/LSEQIDNO.12μL，10μmol/LSEQIDNO.22μL，ddH2O20μL ；

PCR反应程序：94℃预变性3min;94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共进行30个循环；72℃复性10min；

1.2凝胶电泳：

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，依照说明书，用快速DNA产物纯化试剂盒回收目的片段，获得纯化PCR产物；

1.3克隆载体的构建

在0.2mlPCR管中加入5μL步骤1.2获得的纯化PCR产物、1μL10XLigation buffer、3μLPGEMTEasyVector、1μLT4DNALigase，4℃下连接过夜，次日获得连接产物；

1.4感受态细菌的转化

1.4.1取5μL步骤1.3获得的连接产物，加入50μL感受态细胞DH5α，混匀后冰浴 30min，后42℃热击90s，再冰浴3min，加入500μLLB液体培养基，混匀后37℃，200rpm/min 震荡培养45min，获得转化后的连接产物；

1.4.2将x-gal40μL（20mg/ml）和IPTG4μL（200mg/ml）涂布于LB固体培养基上，加入200μL步骤1.4.1获得的转化后的连接产物，37℃倒置培养20h，培养基上生成白色菌落，这些白色菌即具有重组质粒；

1.5鉴定

随机挑取步骤1.4.2获得的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37℃， 250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照说明书，使用质粒小提试剂盒获得重组质粒 DNA；然后由金斯瑞生物科技有限公司对所获得的的重组质粒DNA进行测序验证，其序列与 NCBI中GI：212717248序列相同，确定为luc2基因。

1.6重组pLL3.7质粒

1.6.1对步骤1.5获得重组质粒DNA和pLL3.7（其质粒结构如图1所示）质粒分别进行NheI和EcoRI双酶切，酶切体系分别为：

重组质粒DNA6μL（310ng/μL）+10xbuffer2μL+NheI1μL+EcoRI1μL+ ddH2O10μL；

pLL3.7质粒（300ng/μL）10μL+10xbuffer2μL+NheI1μL+EcoRI1μL+ddH2O 6μL；

将上述反应体系分别于37℃，反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，后使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，分别按照说明书回收电泳产物，即分别为重组质粒DNA酶切后纯化产物和pLL3.7质粒酶切后纯化产物；

1.6.2在0.2mlPCR管中加入5μL步骤1.6.1获得的重组质粒DNA酶切后纯化产物、 1μL10XLigationbuffer、3μL步骤1.6.1获得的pLL3.7质粒酶切后纯化产物、1μLT4 DNALigase，4℃下连接过夜，次日获得连接产物；取10μL连接产物，加入50μL感受态细胞 DH5α，混匀后冰浴30min，后42℃热击90s，再冰浴3min，加入500μLLB液体培养基，混匀后 37℃，200rpm/min震荡培养45min后获得菌液；取200μL获得的菌液涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养20h，培养基上生成菌落。

1.6.3鉴定：

随机挑取步骤1.6.2获得的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37℃， 250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照其说明，使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，浓度为270ng/μL；然后将获得的重组质粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成测序，其序列如 SEQIDNO.3所示，申请人将其命名为pLL3.7-luc2，其质粒结构如图2所示。

2、pLnc-luc2构建

2.1依人EF-1α启动子序列、SV40polyA转录终止信号序列及XbaI和NotI酶切位点序列设计合成序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，交由金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成；

2.2对步骤2.1获得的的合成产物和步骤1.6.获得的pLL3.7-luc2质粒进行双酶切：酶切体系分别为：

合成产物6μL（150ng/μL）+10xbuffer2μL+XbaI1μL+NotI1μL+ddH2O 10μL；

pLL3.7-luc2质粒10μL（300ng/μL）+10xbuffer2μL+XbaI1μL+NotI1μL+ ddH2O6μL；

将上述酶切体系分别置于37℃反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，再使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，按照试剂盒操作要求回收电泳产物，获得合成序列酶切后纯化产物和pLL3.7-luc2质粒酶切后纯化产物；

在0.2mlPCR管中加入5μL合成序列酶切后纯化产物、1μL10XLigation buffer、3μLpLL3.7-luc2质粒酶切后纯化产物、1μLT4DNALigase，4℃下连接过夜，次日获得连接产物；取10μL连接产物，加入50μL感受态细胞DH5α，混匀后冰浴30min，后42℃ 热击90s，再冰浴3min，加入500μLLB液体培养基，混匀后37℃，200rpm/min震荡培养45min 后获得菌液；取200μL获得的菌液涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养20h，培养基上生成菌落。

鉴定：随机挑取生成的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37℃， 250rpm/min条件下震荡培养过夜，次日依照其说明使用质粒小提试剂盒获得目的质粒，浓度为250ng/μL；将目的质粒交由金斯瑞生物科技有限公司对目的基因进行测序，其序列如 SEQIDNO.5所示，申请人将其命名为pLnc-luc2，其质粒结构如图3所示。

实施例2pLnc-luc2质粒表达LncRNAMEG3

LncRNAMEG3质粒(NCBI中NR_002766.2)由金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。

1、对LncRNAMEG3质粒和实施例1获得的pLnc-luc2质粒进行BamHI和XhoI双酶切，反应体系如下：

LncRNAMEG3质粒6μL（260ng/μL）+10xbuffer2μL+BamHI1μL+XhoI1μL+ ddH2O10μL；

pLnc-luc2质粒10μL（320ng/μL）+10xbuffer2μL+BamHI1μL+XhoI1μL+ ddH2O6μL；

将上述反应体系分别置于37℃反应4h，后进行琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，电泳后，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，按照说明书，回收电泳产物，获得LncRNAMEG3 DNA酶切后纯化产物和pLnc-luc2质粒酶切后纯化产物；

鉴定：在0.2mlPCR管中加入5μLLncRNAMEG3DNA酶切后纯化产物、1μL10X Ligationbuffer、3μLpLnc-luc2质粒酶切后纯化产物、1μLT4DNALigase，4℃下连接过夜，次日获得连接产物；取10μL连接产物，加入50μL感受态细胞DH5α，混匀后冰浴 30min，后42℃热击90s，再冰浴3min，加入500μLLB液体培养基，混匀后37℃，200rpm/min 震荡培养45min，获得菌液；取200μL获得的菌液涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养 20h，培养基上生成菌落。

随机挑取生成的2个菌落，分别接种于2mLLB液体培养基中，在37℃，250rpm/min 条件下震荡培养过夜，次日使用质粒小提试剂盒，依照说明书，获得重组质粒DNA，其浓度为 350ng/μL；将重组质粒交由金斯瑞生物科技有限公司完成测序，其序列如SEQIDNO.6所示，从核苷酸序列中可以看出，MEG3基因已经插入到pLnc-luc2质粒中，申请人将该重组质粒自命名为pLnc-luc2-MEG3，其结构如图4所示。

2、细胞培养及病毒包装

2.1细胞培养及pLnc-luc2-MEG3病毒包装

在6孔细胞培养板中每孔接种约1×106个HEK-293T细胞，分别加入2mLDMEM完全培养基，37℃，5%CO2培养24h，当细胞汇合度达到80%～90%时，按照lipofectin2000 TransfectionReagent说明书（LifeTechnologies，11668019）将三质粒系统(pLnc-luc2- MEG3，1.5g;pCMV－VSV－G，0.5g;pCMV－dR8.91，1g)转染至HEK-293T细胞中，转染 48h后，收集培养上清液，4℃下，3000g离心10min，去除细胞碎片，然后将所得上清液用0.22 μm滤膜过滤，滤液即为pLnc-luc2-MEG3病毒液；

2.2细胞培养及pLnc-luc2病毒包装

在6孔细胞培养板中每孔接种约1×106个HEK-293T细胞，分别加入2mLDMEM完全培养基，37℃，5%CO2培养24h，当细胞汇合度达到80%～90%时，按照lipofectin2000 TransfectionReagent说明书（LifeTechnologies，11668019）将三质粒系统(pLnc-luc2， 1.5g;pCMV－VSV－G，0.5g;pCMV－dR8.91，1g)转染至HEK-293T细胞中，转染48h后，收集培养上清液，4℃下，3000g离心10min，去除细胞碎片，然后将上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为pLnc-luc2病毒；

3、慢病毒感染U251细胞

3.1取步骤2.1获得的pLnc-luc2-MEG3病毒液0.2ml，加入1ml的DMEM高糖培养基稀释病毒，在加入终浓度为5μg/ml的polybrene，获得含pLnc-luc2-MEG3病毒的DMEM 培养基；

3.2接种U251细胞于6孔板，105个/孔，分别加入DMEM完全培养基2ml/孔，37℃，5% CO2培养24h，待细胞密度约为50%时，去除培养基，分别加入步骤3.1获得的含pLnc-luc2- MEG3病毒的DMEM培养基，1ml/孔，培养24h后，去除含pLnc-luc2-MEG3病毒的DMEM培养基培养基，分别加入DMEM完全培养基，2ml/孔；再分别每孔加入1ml的胰酶细胞消化液，待细胞消化后，用DMEM完全培养基稀释成20个/ml，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔 0.05ml，细胞含量分别为1个/孔，37℃，5%CO2培养7天；选择只有一个集落生长的孔，待集落布满孔底的1/3～1/2时，传代入六孔板，即为pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞克隆株；

3.3取步骤2.2获得的pLnc-luc2病毒液0.2ml，加入1ml的DMEM高糖培养基稀释病毒，在加入终浓度为5μg/ml的polybrene，获得含pLnc-luc2病毒的DMEM培养基；

3.4接种U251细胞于6孔板，105个/孔，加入DMEM完全培养基2ml/孔，37℃，5%CO2培养24h，待细胞密度约为50%时，去除培养基，加入步骤3.3获得的含pLnc-luc2病毒的DMEM 培养基，1ml/孔，培养24h后，去除含pLnc-luc2病毒的DMEM培养基，加入DMEM完全培养基，2 ml/孔；再每孔加入1ml的胰酶细胞消化液，待细胞消化后，用DMEM完全培养基稀释成20个/ ml，用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为1个/孔，37℃，5% CO2培养7天。选择只有一个集落生长的孔，待集落布满孔底的1/3～1/2时，传代入六孔板，即为pLnc-luc2载体过表达细胞克隆株；

4、荧光定量PCR检测MEG3基因表达量

分别接种U251细胞、步骤3.4获得的pLnc-luc2载体过表达细胞和步骤3.2获得的 pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞于培养瓶（25cm2生长面积）中，分别编号1-3，在细胞铺满 80%~90%瓶底面积时，依照说明书，分别用RNeasyMiniKit提取各组细胞的总RNA，利用 PrimeScripRTReagentKit将总RNA逆转录为cDNA（依照PrimeScripRTReagentKit说明书），分别以1-3组细胞的cDNA为模板，上游引物SEQIDNO.7，下游引物SEQIDNO.8，利用SYBRPrimescriptRT-PCRKit（依照PrimescriptRT-PCRKit说明书），依照表1所示反应体系检测各组细胞MEG3基因相对表达量。

表1MEG3基因检测20μL体系中各组分

编号 cDNA 上游引物10μmol/L 下游引物10μmol/L SYBR Green solution 灭菌双蒸水 1 U251 2 μL 0.4 μL 0.4 μL 10 μL 7.2 μL 2 pLnc-luc2 2 μL 0.4 μL 0.4 μL 10 μL 7.2 μL 3 pLnc-luc2-MEG3 2 μL 0.4 μL 0.4 μL 10 μL 7.2 μL

所得数据用2-ΔΔCT方法分析，结果如图5所示，pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞相对于对照MEG3表达量升高，表明过表达构建成功。

5、分别接种U251细胞、步骤3.4获得的Lnc-luc2载体过表达细胞和步骤3.2获得的pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞于培养瓶中（（25cm2生长面积）），在细胞铺满80%~90%瓶底面积时，吸尽细胞培养液后，按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书分别加入报告基因细胞裂解液0.5ml，充分裂解后，10000-15000g离心5min，取离心后的上清液100μl，分别加入100μl荧光素酶检测试剂，测定RLU(relativelightunit)，以细胞裂解液为背景荧光组，实验结果如图6所示，pLnc-luc2-MEG3载体过表达细胞相对于对照荧光值升高，表明过表达构建成功。

SEQUENCELISTING

<110>南京医科大学

<120>一种用于表达lncRNA的慢病毒载体及其应用

<130>8

<160>8

<170>PatentInversion3.3

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