一种发酵生产那西肽的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410155304.5 (22)申请日 2014.04.17 C12P 21/02(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (73)专利权人 河北圣雪大成制药有限责任公司 地址 051430 河北省石家庄市栾城县圣雪路 50 号 (72)发明人 李敏 张慧 齐巧娟 王绘砖 (74)专利代理机构 石家庄元汇专利代理事务所 ( 特殊普通合伙 ) 13115 代理人 刘闻铎 (54) 发明名称 一种发酵生产那西肽的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种发酵生产那西肽的方法， 该方法包括斜面孢子的制备、 种子罐菌体的培养 。

2、和发酵罐配方及控制， 通过控制发酵罐中 pH 值的 范围及溶氧范围实现了发酵过程的正常进行， 并 使菌体产素能力提高， 从而降低了生产成本， 减轻 了环保压力， 具有重要的经济、 社会和环境效益， 适于规模化生产应用。 (51)Int.Cl. 审查员 李影 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 CN 103898181 B 2016.05.25 CN 103898181 B 1.一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 操作步骤包括： a.斜面孢子的制备： 斜面培养基成分为(g/100mL)： 可溶性淀粉1.5-2.0， 磷酸氢二钾 0.05-0.。

3、08， 硫酸镁0.05-0.10， 硫酸亚铁0.001-0.005， 氯化钠0.01-0.05， 硝酸钾0.1-0.4， 琼脂1.5-2.0， 使用无菌接种针挖取适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40-60湿度培养 7-9天， 向培养成熟的孢子斜面加入无菌水， 使用无菌接种针轻轻刮下孢子， 备用； b.种子罐菌体的培养： 种子罐培养基成分为(g/100mL)： 葡萄糖2-3， 黄豆饼粉2.5-3.5， 硫酸铵0.2-0.4， 硫酸镁0.03-0.07， 碳酸钙0.4-1.0， 磷酸二氢钾0.02-0.08， 豆油0.3-0.8， 消沫剂0.02-0.05， 种子罐培养温度301， 向种子罐。

4、培养基上接种步骤a制备得到的孢 子， 接种量20-30亿， 通气比0.8-1.0， 罐压0.040.005Mp， 溶氧控制在15-35， 繁殖菌 体， 当菌浓达到30以上时进行移种， 移种周期25-30h， 移种pH值控制在6.6-7.0； c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为(g/100mL)： 淀粉5.0-7.0， 豆粉2.5-3.5， 硫 酸铵0.5-1.0， 碳酸钙0.4-1.0， 磷酸二氢钾0.02-0.08， 氯化钠0.05-0.10， 豆油0.3-0.8， 消 沫剂0.02-0.05,发酵罐培养温度301， 向发酵罐培养基上接种步骤b繁殖的菌体， 接种 量10-20， 通气。

5、比0.7-0.9， 罐压0.040.005Mp， 全程流加氨水来调节pH值并补充氮源， 通过调节搅拌转速和通气比来控制溶氧， 放罐周期为180-220h， 发酵结束， 即得到那西肽混 悬液； 所述步骤c中， pH值的范围为6.8-7.3， 搅拌转速为300-600rpm， 通气比为0.7-0.9， 溶氧 的范围为25-60。 2.根据权利要求1所述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤a中， 斜面 培养基成分为(g/100mL)： 可溶性淀粉1.5， 磷酸氢二钾0.05， 硫酸镁0.05， 硫酸亚铁0.001， 氯化钠0.01， 硝酸钾0.1， 琼脂1.5。 3.根据权利要求1所。

6、述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤a中， 斜面 培养基成分为(g/100mL)： 可溶性淀粉2.0， 磷酸氢二钾0.08， 硫酸镁0.10， 硫酸亚铁0.005， 氯化钠0.05， 硝酸钾0.4， 琼脂2.0。 4.根据权利要求1所述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤b中， 种子 罐培养基成分为(g/100mL)： 葡萄糖2， 黄豆饼粉2.5， 硫酸铵0.2， 硫酸镁0.03， 碳酸钙0.4， 磷 酸二氢钾0.02， 豆油0.3， 消沫剂0.02。 5.根据权利要求1所述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤b中， 种子 罐培养基成分为(g/。

7、100mL)： 葡萄糖3， 黄豆饼粉3.5， 硫酸铵0.4， 硫酸镁0.07， 碳酸钙0.4- 1.0， 磷酸二氢钾0.02-0.08， 豆油0.3-0.8， 消沫剂0.02-0.05。 6.根据权利要求1所述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤c中， 发酵 罐培养基成分为(g/100mL)： 淀粉5.0， 豆粉2.5， 硫酸铵0.5， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 氯 化钠0.05， 豆油0.3， 消沫剂0.02。 7.根据权利要求1所述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤c中， 发酵 罐培养基成分为(g/100mL)： 淀粉7.0， 豆粉3.5， 硫。

8、酸铵1.0， 碳酸钙1.0， 磷酸二氢钾0.08， 氯 化钠0.10， 豆油0.8， 消沫剂0.05。 8.根据权利要求1所述的一种发酵生产那西肽的方法， 其特征在于， 所述步骤c中， pH值 的范围为7.0-7.1， 溶氧的范围为45-50。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103898181 B 2 一种发酵生产那西肽的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物发酵工程技术领域， 涉及一种发酵生产那西肽的方法。 背景技术 0002 那西肽是由12个氨基酸及其衍生物组成的含硫多肽类抗生素， 由活跃链霉菌 （Streptomycesactuosus） 产生， 在体外能有效抑制革兰氏阳性菌的生。

9、长， 且毒性低。 1961 年法国科学家在发酵液中发现了那西肽， 但由于其产率低， 成本太高而未能大规模推广。 0003 由于那西肽具备高效、 低毒、 在体内不残留的特性， 目前已用作饲料添加剂， 在欧 共体、 北美、 日本等国广泛使用。 法国、 日本已将该产品开发成动物抗生素， 用于饲料添加 剂。 0004 因此， 开发新的那西肽发酵技术， 进一步提高那西肽发酵水平， 降低生产成本， 减 轻环保压力， 具有重要的经济、 社会和环境效益。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵生产那西肽的方法， 该方法能保证发 酵代谢正常， 提高菌体产素能力， 降低生产成本， 减轻环保压力。

10、。 0006 为了解决上述技术问题， 发明人提供了以下技术方案： 0007 一种发酵生产那西肽的方法， 操作步骤包括： 0008 a.斜面孢子的制备： 斜面培养基成分为 （g/100mL） ： 可溶性淀粉1.5-2.0， 磷酸氢二 钾0.05-0.08， 硫酸镁0.05-0.10， 硫酸亚铁0.001-0.005， 氯化钠0.01-0.05， 硝酸钾0.1- 0.4， 琼脂1.5-2.0， 使用无菌接种针挖取适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40-60%湿度 培养7-9天， 向培养成熟的孢子斜面加入无菌水， 使用无菌接种针轻轻刮下孢子， 备用； 0009 b.种子罐菌体的培养： 种子罐培养。

11、基成分为 （g/100mL） ： 葡萄糖2-3， 黄豆饼粉2.5- 3.5， 硫酸铵0.2-0.4， 硫酸镁0.03-0.07， 碳酸钙0.4-1.0， 磷酸二氢钾0.02-0.08， 豆油0.3- 0.8， 消沫剂0.02-0.05， 种子罐培养温度301， 向种子罐培养基上接种步骤a制备得到的 孢子， 接种量20-30亿， 通气比0.8-1.0， 罐压0.040.005Mp， 溶氧控制在15%-35%， 繁殖菌 体， 当菌浓达到30%以上时进行移种， 移种周期25-30h， 移种pH值控制在6.6-7.0； 0010 c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ： 淀粉。

12、5.0-7.0， 豆粉2.5- 3.5， 硫酸铵0.5-1.0， 碳酸钙0.4-1.0， 磷酸二氢钾0.02-0.08， 氯化钠0.05-0.10， 豆油0.3- 0.8， 消沫剂0.02-0.05,发酵罐培养温度301， 向发酵罐培养基上接种步骤b繁殖的菌 体， 接种量10%-20%， 通气比0.7-0.9， 罐压0.040.005Mp， 全程流加氨水来调节pH值并补充 氮源， 通过调节搅拌转速和通气比来控制溶氧， 放罐周期为180-220h， 发酵结束， 即得到那 西肽混悬液。 0011 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤c中， pH值的范围为6.8-7.3， 搅拌转速为 300-600。

13、rpm， 通气比为0.7-0.9， 溶氧的范围为25%-60%。 0012 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤a中， 斜面培养基成分为 （g/100mL） ： 可溶性 说明书 1/4 页 3 CN 103898181 B 3 淀粉1.5， 磷酸氢二钾0.05， 硫酸镁0.05， 硫酸亚铁0.001， 氯化钠0.01， 硝酸钾0.1， 琼脂1.5。 0013 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤a中， 斜面培养基成分为 （g/100mL） ： 可溶性 淀粉2.0， 磷酸氢二钾0.08， 硫酸镁0.10， 硫酸亚铁0.005， 氯化钠0.05， 硝酸钾0.4， 琼脂2.0。 0014 上述发酵生。

14、产那西肽的方法， 所述步骤b中， 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ： 葡萄 糖2， 黄豆饼粉2.5， 硫酸铵0.2， 硫酸镁0.03， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 豆油0.3， 消沫剂 0.02。 0015 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤b中， 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ： 葡萄 糖3， 黄豆饼粉3.5， 硫酸铵0.4， 硫酸镁0.07， 碳酸钙0.4-1.0， 磷酸二氢钾0.02-0.08， 豆油 0.3-0.8， 消沫剂0.02-0.05。 0016 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤c中， 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ： 淀粉 5.0，。

15、 豆粉2.5， 硫酸铵0.5， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 氯化钠0.05， 豆油0.3， 消沫剂0.02。 0017 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤c中， 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ： 淀粉 7.0， 豆粉3.5， 硫酸铵1.0， 碳酸钙1.0， 磷酸二氢钾0.08， 氯化钠0.10， 豆油0.8， 消沫剂0.05。 0018 上述发酵生产那西肽的方法， 所述步骤c中， pH值的范围为7.0-7.1， 溶氧的范围为 45%-50%。 0019 在那西肽发酵过程中， 菌种生长快， 溶氧需求高。 在流加氨水调节pH值和补充氮源 时， pH值不易控制， 如果pH值超出。

16、7.5以上， 则不能再继续补加氨水， 而不能补加氨水则会造 成pH值快速上升， 从而导致代谢异常， 菌体自溶， 发酵提前中止， 产能低。 全程控制高溶氧， 也会导致菌丝生长异常， 同时造成动力成本浪费， 全程控制低溶氧， 将不能满足菌体正常生 产和代谢。 因此pH值和溶氧是工艺控制的关键指标， 两者协调控制可提高那西肽发酵水平。 0020 发明人在那西肽发酵方法的研究过程中， 意外发现， 在发酵代谢的步骤中， 流加氨 水调节pH值在合适的范围内， 同时控制溶氧的水平， 能显著提高那西肽的发酵水平在55%以 上。 0021 本发明所述的发酵生产那西肽的方法， 将发酵代谢的步骤中pH值范围限定在6。

17、.8- 7.3之间， 溶氧的范围限定在25%-60%， 在此条件下， 发酵过程能够正常进行， 菌体产素能力 提高， 从而降低了生产成本， 减轻了环保压力。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。 0023 实施例1 0024 a.斜面孢子的制备： 斜面培养基成分为 （g/100mL） ： 可溶性淀粉1.5， 磷酸氢二钾 0.05， 硫酸镁0.05， 硫酸亚铁0.001， 氯化钠0.01， 硝酸钾0.1， 琼脂1.5， 使用无菌接种针挖取 适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40%-60%湿度条件下培养7-9天， 向培养成熟的孢子斜 面中加入10mL无菌。

18、水， 用无菌接种针轻轻刮下孢子， 制备成孢子悬液。 0025 b.种子罐菌体的培养： 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ， 葡萄糖2， 黄豆饼粉2.5， 硫 酸铵0.2， 硫酸镁0.03， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 豆油0.3， 消沫剂0.02， 种子罐培养温度 301， 接种量20亿-30亿孢子/L， 通气比0.8-1.0 （V/V/m） ， 罐压0.040.005MPa， 溶氧控 制在15%-35%， 移种周期25-30h， 移种pH控制在6.6-7.0， 菌浓30%以上。 0026 c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ， 淀粉5.0， 豆粉2。

19、.5， 硫酸铵 说明书 2/4 页 4 CN 103898181 B 4 0.5， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 氯化钠0.05， 豆油0.3， 消沫剂0.02， 发酵罐培养温度前30 1， 接种量10%-20%， 通气比0.7-0.9， 罐压0.040.005MPa， 发酵9h后流加氨水自控pH至 7.1-7.3， 20h后溶氧自控在50%-60%， 发酵周期为220h， 检测那西肽效价为2490U/mL。 0027 实施例2 0028 a.斜面孢子的制备： 斜面培养基成分为 （g/100mL） ： 可溶性淀粉2.0， 磷酸氢二钾 0.08， 硫酸镁0.10， 硫酸亚铁0.005， 。

20、氯化钠0.05， 硝酸钾0.4， 琼脂2.0， 使用无菌接种针挖取 适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40%-60%湿度条件下培养7-9天， 向培养成熟的孢子斜 面中加入10mL无菌水， 用无菌接种针轻轻刮下孢子， 制备成孢子悬液。 0029 b.种子罐菌体的培养： 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ， 葡萄糖3， 黄豆饼粉3.5， 硫 酸铵0.4， 硫酸镁0.07， 碳酸钙1.0， 磷酸二氢钾0.08， 豆油0.8， 消沫剂0.05， 种子罐培养温度 301， 接种量20亿-30亿孢子/L， 通气比0.8-1.0 （V/V/m） ， 罐压0.040.005MPa， 溶氧控 制在15。

21、%-35%， 移种周期25-30h， 移种pH控制在6.6-7.0， 菌浓30%以上。 0030 c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ， 淀粉7.0， 豆粉3.5， 硫酸铵 1.0， 碳酸钙1.0， 磷酸二氢钾0.08， 氯化钠0.10， 豆油0.8， 消沫剂0.05， 发酵罐培养温度前30 1， 接种量10%-20%， 通气比0.7-0.9， 罐压0.040.005MPa， 发酵9h后流加氨水自控pH至 7.0-7.1， 20h后溶氧自控在45%-50%， 发酵周期为180h， 检测那西肽发酵效价为2550U/mL。 0031 实施例3 0032 a.斜面孢子制备。

22、： 斜面培养基成分为 （g/100mL） ， 可溶性淀粉2.0， 磷酸氢二钾 0.05， 硫酸镁0.05， 硫酸亚铁0.001， 氯化钠0.05， 硝酸钾0.1， 琼脂2.0。 使用无菌接种针挖取 适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40-60%湿度培养7-9天至孢子成熟。 将培养成熟的孢 子斜面加入10mL无菌水， 使用无菌接种针轻轻刮下孢子制备成孢子悬液。 0033 b.种子罐配方及控制： 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ， 葡萄糖2， 黄豆饼粉3.5， 硫 酸铵0.4， 硫酸镁0.07， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.08， 豆油0.3， 消沫剂0.05， 种子罐培养温度 30。

23、1， 接种量20亿-30亿孢子/L， 通气比0.8-1.0， 罐压0.040.005MPa， 溶氧控制在15%- 35%， 移种周期25-30h， 移种pH控制在6.6-7.0。 0034 c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ， 淀粉7.0， 豆粉2.5， 硫酸铵 1.0， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.08， 氯化钠0.05， 豆油0.8， 消沫剂0.02-， 100L百仑不锈钢发 酵罐中装入60L发酵液， 发酵罐培养温度为301， 接种量10%-20%， 通气比0.7-0.9， 罐压 0.040.005MPa， 发酵9h后流加氨水自控pH至6.9-7.0， 20。

24、h后溶氧自控在35%-40%至发酵周 期为220h， 检测那西肽发酵效价为2480U/mL。 0035 实施例4 0036 a.斜面孢子制备： 斜面培养基成分为 （g/100mL） ， 可溶性淀粉2.0， 磷酸氢二钾 0.05， 硫酸镁0.05， 硫酸亚铁0.001， 氯化钠0.05， 硝酸钾0.1， 琼脂2.0。 使用无菌接种针挖取 适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40-60%湿度培养7-9天至孢子成熟。 将培养成熟的孢 子斜面加入10mL无菌水， 使用无菌接种针轻轻刮下孢子制备成孢子悬液。 0037 b.种子罐配方及控制： 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ， 葡萄糖3， 黄豆。

25、饼粉2.5， 硫 酸铵0.4， 硫酸镁0.03， 碳酸钙1.0， 磷酸二氢钾0.02， 豆油0.8， 消沫剂0.02， 种子罐培养温度 301， 接种量20亿-30亿孢子/L， 通气比0.81.0， 罐压0.040.005Mp， 溶氧控制在15%- 35%， 移种周期25-30h， 移种pH控制在6.6-7.0。 说明书 3/4 页 5 CN 103898181 B 5 0038 c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ， 淀粉7.0， 豆粉2.5， 硫酸铵 1.0， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.08， 氯化钠0.05， 豆油0.8， 消沫剂0.02， 100L百仑不。

26、锈钢发酵 罐中装入60L发酵液， 发酵罐培养温度为301， 接种量10%-20%， 通气比0.7-0.9， 罐压 0.040.005MPa， 发酵9h后流加氨水自控pH至6.8-6.9， 20h后溶氧自控在25%-35%至发酵周 期为220h， 检测那西肽发酵效价为2650U/mL。 0039 为了说明本发明所述发酵生产那西肽的方法制备那西肽效价水平提高的程度， 发 明人进行了对比试验， 并将试验结果进行了对比， 具体见表1。 0040 对比实施例 0041 a.斜面孢子的制备： 斜面培养基成分为 （g/100mL） ： 可溶性淀粉1.5， 磷酸氢二钾 0.05， 硫酸镁0.05， 硫酸亚铁0。

27、.001， 氯化钠0.01， 硝酸钾0.1， 琼脂1.5， 使用无菌接种针挖取 适量砂土接种至斜面培养基上， 28， 40%-60%湿度条件下培养7-9天， 向培养成熟的孢子斜 面中加入10mL无菌水， 用无菌接种针轻轻刮下孢子， 制备成孢子悬液。 0042 b.种子罐菌体的培养： 种子罐培养基成分为 （g/100mL） ， 葡萄糖2， 黄豆饼粉2.5， 硫 酸铵0.2， 硫酸镁0.03， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 豆油0.3， 消沫剂0.02， 种子罐培养温度 301， 接种量20亿-30亿孢子/L， 通气比0.8-1.0 （V/V/m） ， 罐压0.040.005MPa， 溶氧。

28、控 制在15%-35%， 移种周期25-30h， 移种pH控制在6.6-7.0， 菌浓30%以上。 0043 c.发酵罐配方及控制： 发酵罐培养基成分为 （g/100mL） ， 淀粉5.0， 豆粉2.5， 硫酸铵 0.5， 碳酸钙0.4， 磷酸二氢钾0.02， 氯化钠0.05， 豆油0.3， 消沫剂0.02， 发酵罐培养温度前30 1， 接种量10%-20%， 通气比0.7-0.9， 罐压0.040.005MPa， 发酵9h后流加氨水自控 pH7.3-7.4， 溶氧未控制具体范围， 发酵周期为220h， 检测那西肽效价为1600U/mL。 0044 表1 0045 实施例pH控制范围溶氧控制范。

29、围那西肽效价U/ml较对比实施例提高 实施例17.1-7.350%-60%249055.6% 实施例27.0-7.145%-50%255059.4% 实施例36.9-7.035%-40%248055.0% 实施例46.8-6.925%-35%265065.6% 对比实施例7.3-7.4未控制具体范围1600- 0046 由表1中数据可以看出， 本发明所述发酵生产那西肽的方法制备得到那西肽的效 价与对比实施例 （现有技术） 相比， 有显著的提高， 提高程度可达在55%以上。 0047 综上所述， 本发明所述发酵生产那西肽的方法， 提高了生产效率， 降低了生产成 本， 减轻了环保压力， 具有重要的经济、 社会和环境效益， 适于规模化生产应用。 说明书 4/4 页 6 CN 103898181 B 6 。