技术领域
本发明涉及微生物发酵及发酵制品的应用，特别是指桦褐孔菌发酵液的 制备方法以及该发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用。
背景技术
桦褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.)Pilat]为多孔菌科(Polyporacea)褐 卧孔菌属(PoriahypobrunneaPetch)的药用真菌，主要分布于俄罗斯北部、 北欧、中国黑龙江、吉林长白山等北纬40-50度地区，生长在白桦树的树皮下。 是东欧、俄罗斯、波兰、芬兰等民间广泛利用的药用真菌，用来防治各种疑 难杂症，如各种癌病、心脏病、糖尿病等，是一种具有开发前景的药用真菌； 桦褐孔菌的化学成分主要有桦褐孔菌多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种 氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、 芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、 类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。临 床实验表明：桦褐孔菌没有任何毒副作用，且在治疗糖尿病、预防艾滋病、 增强免疫力等方面具有明显的作用。目前的研究报道表明，桦褐孔菌的主要 活性成份有多糖、多酚、甾体、桦褐孔菌素、黑色素、三萜、鞘胺酯类化合 物、生物碱、叶酸衍生物、香草酸、丁香酸及γ-羟基苯甲酸等，最近还有报 道指出有学者已分离出单宁化合物、类固醇、低分子多酚类及木质素类化合 物。该菌具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、增强免疫、抗氧化作用，能诱导肿 瘤细胞凋亡，俄罗斯的堪索莫乐斯基(Kolnsomlski)制药公司生产的桦褐孔 菌精粉对糖尿病的治愈率达93％。由于其独特的药用价值，人为采集频繁，使 得野生桦褐孔菌菌核越来越少，而人工菌核培养存在一定的难度，还无法进 行大规模利用。因此，工业化发酵生产的桦褐孔菌发酵液及其产物的利用， 对于有效的开发利用桦褐孔菌资源有十分重要的现实意义。
目前，人工栽培桦褐孔菌生产菌核虽已有报道，但均局限于实验室阶段， 未能实现规模化生产，主要问题还在于生产周期长，生产难度大，对菌核的 生长规律还未能全面掌握。因此，桦褐孔菌的菌核获得尚以野生采集为主。
通过发酵的方法生产食药用真菌，用发酵液替代子实体提取有效成份， 是目前高效利用食药用真菌的研究热点和新型的技术方法，目前此类研究主 要是在实验室阶段，未见有工业化生产的报道。
申请人检索的背景文献包括：
1、相关的研究报道情况为：陈才法等利用麦芽糖发酵制取桦褐孔菌多糖， 胞外多糖的量达7.8g/L；何长川等利用响应面法优化桦褐孔菌发酵培养基， 多糖产量提高到12g/L。
2、目前相关的专利文献主要采用单一成分的培养基通过深层通气发酵的 方法进行，其制备工艺复杂且生产成本较高，所制备的桦褐孔菌发酵液中的 胞外多糖含量较低。例如：
(1)申请号为201010591235.4的发明专利申请公开说明书中公开了一 种桦褐孔菌深层发酵培养基及桦褐孔菌的深层发酵方法，通过分阶段发酵的 方法使所制备的桦褐孔菌胞外多糖含量达到5.24g/L。
(2)申请号为201210351087.8的发明专利申请公开说明书中公开了用 于桦褐孔菌发酵的培养基及发酵产多糖的方法与应用，通过优化培养基和培 养条件，使优化后的培养条件下粗多糖量(胞内多糖及胞外多糖之和)达到 0.511g/100mL。
(3)申请号为201310055029.5的发明专利申请中公开了一种液体深层 发酵生产桦褐孔菌免疫增强活性物质的工艺，通过通过优化培养基和培养条 件，获得的免疫增强活性物质含量更高，活性更好，其胞外多糖的含量达到 1.62g/L。
黑木耳(Auriculariaauricula)能提高人体免疫力，是天然的血液抗凝 剂，有防治动脉硬化、冠心病、高血压和高血脂症的作用，中老年人经常食 用有益于预防中风、冠心病、减少血栓和心肌梗塞发生。
发明目的
本发明的目的在于提供一种桦褐孔菌发酵液的制备方法以及该发酵液在 制备降低血糖保健饮品中的应用。通过优化培养基及培养条件，达到降低生 产成本、有效提高发酵液中胞外多糖含量的目的，并利用桦褐孔菌发酵液制 备降低血糖保健饮品，该保健饮品可在一定程度上控制血糖浓度。
本发明的整体技术构思是：
桦褐孔菌发酵液的制备方法，是将桦褐孔菌接种于含有碳源、氮源及营 养元素的无菌培养基中通气发酵后制成；包括如下步骤：
A、深层通气发酵
将桦褐孔菌InonotusobliquusCGMCCNO.1535接种于无菌发酵培养基中 进行通气发酵制成深层通气发酵液，发酵培养基由如下原料组成：液体PDA培 养基，每1000ml培养基中含维生素B110-30mg；
通气发酵的条件如下：发酵培养基装量体积比为40％-60％，接种量为菌种： 发酵培养基体积比＝0.03-0.1：1，通气量按体积比为0.5-0.7:1，发酵温度为 25-30℃，发酵8-10天后测定菌丝体湿重达到18.0g/L时结束发酵；
B、组培瓶静止发酵
将步骤A制备的深层通气发酵液接种于盛装有无菌产糖培养基的组培瓶 中静止发酵制成桦褐孔菌发酵液，产糖培养基由如下单位质量份的原料组成： 土豆粉5-15，麦芽糖1-8，蛋白胨0.2-1.5，水1000,pH值5.0-7.0；
静止发酵的条件如下：产糖培养基装量体积比＝0.7-0.85:1，接种量为步 骤A制成的深层通气发酵液：产糖培养基的体积比＝0.005-0.02：1，在温度 为24-30℃的洁净培养室中培养20-30天，或胞外多糖达到13.0g/L以上时结 束发酵。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用。
本发明中所用的桦褐孔菌菌种申请人已于2005年11月16日提交中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏机构的地址位于北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，该保藏机构原地址为海淀区中关村北一条13 号中国科学院微生物研究所内，该保藏机构的简称为CGMCC。该菌种的保藏编 号为CGMCCNO.1535。
本发明的具体技术解决方案包括：
步骤B中胞外多糖的测定采用苯酚-硫酸法。
为便于实现工业化生产，降低生产成本，较为常见的方式是通过扩大培 养的方式将斜面菌种制备成种子液用于工业发酵，优选的技术实现方式是， 所述的步骤A前还包括一扩大培养步骤，即将斜面菌种制成种子液。
优选的斜面培养条件是，斜面菌种培养基选用PDA培养基，自然pH值。
优选的种子液的培养条件是，种子液的制备过程如下：
种子培养基选用液体PDA培养基，种子培养基的装量体积比＝0.2-0.6:1， 将斜面菌种培养基上的菌丝体接种至灭菌后冷却的种子培养基中，每支斜面 菌种接3-5瓶，在温度为28℃、转速为180转/分钟的摇床上振荡培养10-18 天，得到种子液，镜检查菌丝生长良好，无杂菌即可。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用，包括如下工艺步骤：
Ⅰ、混配
按照桦褐孔菌发酵液：黑木耳浆液＝1-5:2-10的体积比混合，加入占混合 物料质量2-8％的木糖醇，混合搅拌10分钟制成原液；
Ⅱ、后处理
将步骤Ⅰ中制备的匀浆、均质、脱气、灌装灭菌后制成保健饮品；
步骤Ⅰ中的黑木耳浆液是将黑木耳经过去杂、粉碎打粉、过筛后，用水 浸泡后制成。
所述的步骤Ⅱ中匀浆是用胶体磨将原浆打成粒径5-8微米的匀浆。
所述的步骤Ⅱ中的均质将匀浆后的料液经均质机均质处理使得液粒小于 2微米。
所述的步骤Ⅱ中脱气采用负压脱气，灭菌条件为95-98℃，时间20-30分 钟。
本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：
1、本发明优化了桦褐孔菌的发酵工艺，创造性地采用了深层通气发酵、 组培瓶静止发酵两步发酵法生产桦褐孔菌发酵液，能有效提高桦褐孔菌胞外 多糖的产量，桦褐孔菌发酵液中胞外多糖最高可达到15.0g/L以上，至少可 达到12.0g/L。
2、由于采用组培瓶静止发酵，培养设备及工艺简单，成本较低，相比传 统的深层发酵生产成本可下降50％以上。
3、由于桦褐孔菌发酵液中含有包括桦褐孔菌多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔 菌醇、多种氧化三萜类化合物多糖等多种营养物质，配合黑木耳所制备的具 有降低血糖功能的浓稠桦褐孔菌保健饮品，饮品中不含增稠剂、悬浮剂，符 合GB16740-2014《食品安全国家标准保健食品》的要求，经小鼠试验证明降 糖效果较为明显(P<0.01)，降血糖率在30％以上，可做为糖尿病患者的保健 饮品。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本 发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技 术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
桦褐孔菌发酵液的制备方法，是将桦褐孔菌接种于含有碳源、氮源及营 养元素的无菌培养基中通气发酵后制成；包括如下步骤：
A、深层通气发酵
将桦褐孔菌InonotusobliquusCGMCCNO.1535接种于无菌发酵培养基中 进行通气发酵制成深层通气发酵液，发酵培养基由如下原料组成：液体PDA培 养基，每1000ml培养基中含维生素B110mg；
通气发酵的条件如下：发酵培养基装量体积比为0.4:1，接种量为菌种： 发酵培养基体积比＝0.03：1，通气量按体积比为0.5:1，发酵温度为25℃，发 酵8-10天后测定菌丝体湿重达到18.0g/L时结束发酵；
B、组培瓶静止发酵
将步骤A制备的深层通气发酵液接种于盛装有无菌产糖培养基的组培瓶 中静止发酵制成桦褐孔菌发酵液，产糖培养基由如下单位质量份的原料组成： 土豆粉5，麦芽糖1，蛋白胨0.2，水1000,pH值5.0-7.0；
静止发酵的条件如下：产糖培养基装量体积比为0.7:1，接种量为步骤A 制成的深层通气发酵液：产糖培养基的体积比＝0.005：1，在温度为24℃的洁 净培养室中培养20-30天，或胞外多糖达到13.0g/L时结束发酵。
步骤B中胞外多糖的测定采用苯酚-硫酸法。
所述的步骤A前还包括一扩大培养步骤，即将斜面菌种制成种子液。
斜面菌种培养基选用PDA培养基，自然pH值。
种子液的制备过程如下：
种子培养基选用液体PDA培养基，种子培养基的装量体积比为0.2:1，将 斜面菌种培养基上的菌丝体接种至灭菌后冷却的种子培养基中，每支斜面菌 种接3-5瓶，在温度为28℃、转速为180转/分钟的摇床上振荡培养10-18天， 得到种子液，镜检查菌丝生长良好，无杂菌即可。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用，包括如下工艺步骤：
Ⅰ、混配
按照桦褐孔菌发酵液：黑木耳浆液＝1:2的体积比混合，加入占混合物料 质量2％的木糖醇，混合搅拌10分钟制成原液；
Ⅱ、后处理
将步骤Ⅰ中制备的匀浆、均质、脱气、灌装灭菌后制成保健饮品；
步骤Ⅰ中的黑木耳浆液是将黑木耳经过去杂、粉碎打粉、过筛后，用水 浸泡后制成。
所述的步骤Ⅱ中匀浆是用胶体磨将原浆打成粒径5-8微米的匀浆。
所述的步骤Ⅱ中的均质将匀浆后的料液经均质机均质处理使得液粒小于 2微米。
所述的步骤Ⅱ中脱气采用负压脱气，灭菌条件为95-98℃，时间20-30分 钟。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵培养基由如下原料组成：液体PDA培养基，每1000ml培养基中含维生 素B130mg；
通气发酵的条件如下：发酵培养基装量体积比为0.6:1，接种量为菌种： 发酵培养基的体积比＝0.1：1，通气量按体积比为0.7:1，发酵温度为30℃；
B、组培瓶静止发酵
产糖培养基由如下单位质量份的原料组成：土豆粉15，麦芽糖8，蛋白 胨1.5，水1000，pH值5.0-7.0；
产糖培养基装量体积比为0.85:1，接种量为步骤A制成的深层通气发酵 液：产糖培养基的体积比＝0.02:1，在温度为30℃的洁净培养室中培养25天， 或胞外多糖达到13.0g/L以上时结束发酵。
种子培养基的装量体积比为60％。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用，包括如下工艺步骤：
Ⅰ、混配
按照桦褐孔菌发酵液：黑木耳浆液＝1:10的体积比混合，加入占混合物料 质量8％的木糖醇，混合搅拌10分钟制成原液；
其余内容同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
A、深层通气发酵
发酵培养基由如下原料组成：液体PDA培养基，每1000ml培养基中含维生 素B120mg；
通气发酵的条件如下：发酵培养基装量体积比为0.5:1，接种量为菌种： 发酵培养基的体积比＝0.07：1，通气量按体积比为0.6:1，发酵温度为28℃；
B、组培瓶静止发酵
产糖培养基由如下单位质量份的原料组成：土豆粉10，麦芽糖5，蛋白 胨0.9，水1000,pH值5.0-7.0；
静止发酵的条件如下：产糖培养基装量体积比为0.75:1，接种量为步骤 A制成的深层通气发酵液：产糖培养基的体积比＝0.012：1，在温度为27℃的 洁净培养室中培养20-30天，或胞外多糖达到13.0g/L以上时结束发酵。
种子培养基的装量体积比为0.4:1。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用，包括如下工艺步骤：
Ⅰ、混配
按照桦褐孔菌发酵液：黑木耳浆液＝5:2的体积比混合，加入占混合物料 质量5％的木糖醇，混合搅拌10分钟制成原液；
其余内容同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
A、深层通气发酵
发酵培养基由如下原料组成：液体PDA培养基，每1000ml培养基中含维生 素B115mg；
通气发酵的条件如下：发酵培养基装量体积比为0.45:1，接种量为菌种： 发酵培养基的体积比＝0.04：1，通气量按体积比为0.55:1，发酵温度为28℃；
B、组培瓶静止发酵
产糖培养基由如下单位质量份的原料组成：土豆粉8，麦芽糖3，蛋白胨 0.5，水1000,pH值5.0-7.0；
静止发酵的条件如下：产糖培养基装量体积比为0.75:1，接种量为步骤 A制成的深层通气发酵液：产糖培养基的体积比＝0.008：1，在温度为26℃的 洁净培养室中培养20-30天，或胞外多糖达到13.0g/L以上时结束发酵。
种子培养基的装量体积比为0.3:1。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用，包括如下工艺步骤：
Ⅰ、混配
按照桦褐孔菌发酵液：黑木耳浆液＝1.5:6的体积比混合，加入占混合物 料质量4％的木糖醇，混合搅拌10分钟制成原液；
其余内容同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
A、深层通气发酵
发酵培养基由如下原料组成：液体PDA培养基，每1000ml培养基中含维生 素B125mg；
通气发酵的条件如下：发酵培养基装量体积比为0.55:1，接种量为菌种： 发酵培养基的体积比＝0.08：1，通气量为0.65:1，发酵温度为28℃；
B、组培瓶静止发酵
产糖培养基由如下单位质量份的原料组成：土豆粉12，麦芽糖6，蛋白 胨1.2，水1000,pH值5.0-7.0；
静止发酵的条件如下：产糖培养基装量体积比为82％，接种量为步骤A制 成的深层通气发酵液：产糖培养基的体积比＝0.015：1，在温度为28℃的洁净 培养室中培养20-30天，或胞外多糖达到13.0g/L以上时结束发酵。
种子培养基的装量体积比为0.55:1。
桦褐孔菌发酵液在制备降低血糖保健饮品中的应用，包括如下工艺步骤：
Ⅰ、混配
按照桦褐孔菌发酵液：黑木耳浆液＝3:4的体积比混合，加入占混合物料 质量2-8％的木糖醇，混合搅拌10分钟制成原液。
其余内容同实施例1。
申请人对本实施例中降低血糖的桦褐孔菌保健饮品进行了检验，符合 GB16740-2014《食品安全国家标准保健食品》的要求，结果如下：
(1)感官指标：浅咖啡色均质粘稠液体，无沉淀。有桦褐孔菌和黑木耳 的复合香味，无异味，适口性好。
(2)理化指标：固形物总量大于5％，pH＝6.7。
作为保健食品，我国目前执行的标准是GB16740-2014《食品安全国家标 准保健食品》，此标准自2015年5月24日实施，替代GB16710-1997《保健(功 能)食品通用标准》。GB16740-2014中未对功效成份的证实和对有明显、稳定 的调节人体机能作用的证实作要求，而在GB16710-1997中对此有相应的要求， 但对于如何证实以及动物或人群功能试验均未有具体要求。
因此，申请人选择通过小鼠(一般动物试验的首选动物都是小鼠)试验， 证实上述实施例中桦褐孔菌保健饮品在降低血糖方面的应用效果。
降低血糖的实验过程及结果如下。
1、实验材料
1.1、药品与试剂：
本实施例中方法制备的具有降低血糖功能的桦褐孔菌保健饮品。
葡萄糖氧化酶试剂盒：保定长城临床试剂公司。
盐酸二甲双胍片：天安堂，北京京丰制药有限公司。
四氧嘧啶：Sigma公司产品。
羧甲基纤维素钠(CMC—Na)、葡萄糖等药品均为国产优质分析纯试剂。
1.2、实验动物：
体重(20±2)g的ICR雄性小鼠，清洁级，购自中国医学科学院实验动物 研究所。
1.3、试验仪器：
恒温旋转式摇床，旋转蒸发仪(BUCHI)，分光光度计，高速台式离心机。
2、试验方法
2.1、动物分组：ICR小鼠80只，随机分为8组，每组10只。
Ⅰ对照组：8g1％的CMC-Na溶液灌胃；
Ⅱ模型组：8g1％的CMC-Na溶液灌胃；
Ⅲ盐酸二甲双胍组：按125mg/kg药量溶解到8g的1％CMC-Na溶液中灌胃；
Ⅳ桦褐孔菌饮品组：饮品中加入1％CMC-Na，按每只小鼠8g的量灌胃；
2.2、诱导小鼠形成糖尿病：
对除对照组外的其余70只小鼠腹腔注射四氧嘧啶(按200mg/kg体重)诱 导，造成小鼠血糖值升高2.5-3倍，3d后测空腹血糖，血糖值高于12mmol/L视 为造模成功。
2.3、药物治疗试验：
小鼠禁食(不禁水)过夜后，通过2.1的方法进行药物灌胃，对小鼠进行 3周的治疗试验，分别在给药后3天、7天、14天、21天断尾法采集血样，用葡 萄糖氧化酶试剂盒法测定血糖。SPSS法进行统计分析和t检验。
3、桦褐孔菌保健饮品对患糖尿病小鼠血糖的影响试验结果见表1。
表1桦褐孔菌饮品对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠血糖的影响
注：与对照组相比较，*P<0.01；与模型组相比较：#P<0.01；
由表1可见：各试验组Ⅳ(实施例1-5)与模型组Ⅱ比较降血糖效果都较 为明显(P<0.01)，降糖率分别为：29.98％、31.95％、31.97％、30.47％、31.48％， 平均降糖率为31.17％，与盐酸二甲双胍组Ⅲ39.29％的降糖率相比仅低8.12％。 其中各试验组Ⅳ(实施例1-5)之间的降糖率没有明显差异(P>0.05)。
由上述试验结果可得出如下结论：通过四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠降血 糖实验表明：桦褐孔菌发酵饮品对糖尿病小鼠具有一定降血糖作用，且降糖 效果较为明显(P<0.01)，降血糖率在为30％以上。由此来看可以作为糖尿病 患者的日常保健品饮用。