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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410399682.8 (22)申请日 2014.08.14 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 广东紫金正天药业有限公司 地址 517000 广东省河源市临江高望经济开 发区 (72)发明人 万徐萍 (54) 发明名称 一种人干扰素IFN-2a与LL-37的融合蛋白 (57) 摘要 本发明公开了人干扰素 IFN-2a 与人抗菌 肽LL-37的基因改造、 融合表达与纯化。 所获得的 IFN-2a 与 LL-37 融合蛋白同时具有 IFN。
2、-2a 的抗病毒活性和 LL-37 的抗菌活性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图1页 CN 105330747 A 2016.02.17 CN 105330747 A 1/1 页 2 1. 一种人干扰素 IFN-a2a 与 LL-37 的融合蛋白， 其是 ： a) 具有与 SEQ ID No.1 的 1-232 位氨酸序列所示的肽链， 或 b)在SEQ ID No.1基础上通过缺失、 突变、 重组获得的具有人干扰素IFN-2a与LL-37 活性的多肽。 2. 权 利 要 求 1 的 IFN-2a 。
3、与 LL-37 的 融 合 蛋 白，由 人 IFN-2a 通 过 接 头 GlyGlyGlyGlySer 与 LL-37 相连。 3. 权利要求 1 的 IFN-2a 来源于人， 并按毕赤酵母的密码子偏好性改造而成。 4. 权利要求 1 的 LL-37 来源于人， 并按毕赤酵母的密码子偏好性改造而成。 5. 权利要求 1 的 IFN-2a 与 LL-37 的融合蛋白同时具有 IFN-2a 的抗病毒活性与 LL-37 的抗菌活性。 6.权利要求1的IFN-2a与LL-37的融合蛋白可通过基因工程重组的毕赤酵母表达， 并通过盐析、 疏水层析和阴离子交换得到。 权 利 要 求 书 CN 105330。
4、747 A 2 1/4 页 3 一种人干扰素 IFN-2a 与 LL-37 的融合蛋白 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域 背景技术 0002 蛋白融合技术， 是通过 DNA 重组技术获得两个基因重组后的表达产物。现广泛用 于新的蛋白药物或新功能蛋白分子产品的开发。 0003 蛋白融合的目的包括 ： 一是使一种分子具有两种蛋白的功能。例如， 将人 B7-2 分 子与荧光蛋白融合表达， 使新形成的融合蛋白同时具有 B7-2 分子的功能和荧光蛋白的功 能。二是增加二种蛋白中某一蛋白的稳定性以提高其效率， 例如将人干扰素蛋白与人血清 蛋白融合表达， 就可以提高干扰在人体内的半衰期。三是蛋。
5、白产物定向的需要。例如将信 号肽序列与目标蛋白融合表达， 就可以实现产物的胞外表达。 0004 目前干扰素均通过基因工程技术生产。 干扰素在生产和使用过程中存在的主要 问题一是基因工程菌产量低， 生产成本高 ； 二是 干扰素分子量小， 容易被肾小球滤过， 临 床应用时半期短， 约每 2 天就需要重新用药一次。对于产量低的问题， 目前主要通过优化表 达系统和发酵工艺方面着力。对于半衰期短的问题， 目前常采取的方法包括 PEG 修饰以增 加分子量， 掩盖分子表面的抗原决定簇和蛋白酶作用位点 ； 同人白蛋白或免疫球蛋白 Fc 片 断融合增加分子量， 减少肾小球滤过 ； 在合适的位置引入糖基化掩蔽蛋白。
6、酶位点和增大分 子量等。很多病毒均具有诱发肿瘤的能力， 因此同时具有抗病毒与抗肿瘤能力的 干扰在 此类疾病的治疗方面作用重要。同时， 多数肿瘤患者由于其自身的免疫系统不同程度的受 到破坏， 因此， 还需特别预防细菌感染。 基于临床需要同时抗菌、 抗细菌和抗肿瘤的特点， 将 人 IFN-2a 与 LL-37 经过按毕赤酵母的密码子偏好性进行优化， 构建高产工程菌， 在此基 础上生产出长效的三联干扰素。 发明内容 0005 1. 人 LL-37 与 IFN-2a DNA 序列的密码子优化 0006 在保证人 LL-37 与 IFN-2a 氨基酸序列完整性的前提下， 按照 P.pastoris 对密。
7、 码子的偏好性特点， 对他们的 DNA 序列进行优化。 0007 2 重组质粒构建 0008 分别用 EcoR I 和 Not I 双酶切 pPIC9K 和 pMD-18Fall-IFN 质粒， 经凝胶电泳后切 胶分别回收约 9300bp 利 700bp 的片断， 用胶回收试剂盒回收片断， 并用 T4ligase 连接， 构 建分泌型重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN， 用 CaCl 法转化大肠杆菌 DH5， 利用 LB-Amp 平板筛 选重组子。挑选阳性转化子送上海生工进行测序， 确定质粒的结构。 0009 3 重组质粒转化毕赤酵母 0010 用 Sac I 单酶切 pPIC9K-Fa。
8、ll-IFN 成线性重组质粒， 通过电击转化法将其转入 P.pastoris GS115中构建重组菌P.pastoris GS115LI。 电击条件为1500kV， 200， 25F。 转化液涂布于 MD 平板 30静止培养 3 天， 挑选阳性克隆， 摇瓶后， 用真菌基因组提取试剂 说 明 书 CN 105330747 A 3 2/4 页 4 盒提取基因组进行 PCR 鉴定。引物为 ： SenseP1 ： TTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTC， AntisP2 ： TCACTCCTTAGATCTCAAAGACTC， 退火温度为 58， 以 GS115 基因组及未加模板的体系为对照 。
9、组。 0011 4 重组菌表型鉴定及多拷贝筛选 0012 通过甲醇利用情况进行重组菌表型鉴定。将 PCR 鉴定的阳性转化子编号， 并将每 菌株用灭菌牙签同时接种 MD 和 MM 平板， 30静止培养 5 天， 观察各菌株在两种平板上的生 长情况。 0013 通过遗传霉素 (G418) 浓度梯度筛选多拷贝重组株。首先制备遗传霉素质量浓度 为 0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0mg/mL 的 YPD 平板， 然后将前面筛选的表型正常的重组菌株用灭 菌牙签点在 5 个遗传霉素梯度平板上， 30静止培养 4 天， 观察结果， 能在高浓度下生长良 好的菌株为多拷贝菌株。 0014 5 融合。
10、蛋白发酵与纯化 0015 将筛选的重组菌株， 接种于 25mL BMGY 培养液中， 30 250rpm/min 培养约 16h， 至 菌液 OD600 5， 4 4000rpm/min 离心 5min， 收集菌体， 用 25mL BMMY 培养液重悬细胞， 诱 导培养， 每 24h 按体积比为 0.5加入纯甲醇， 连续诱导 144h 以上， 4 12000rpm/min 离心 5min， 收集上清于 -20冻存待用。 0016 上清液中的融合蛋白先用 35饱和度 (NH4)2SO4盐析， 12000rpm/min 离心收集盐 析沉淀， 再将沉淀溶于 0.8mol/L(NH4)2SO4(pH8。
11、.3)， 上样 Phenyl-Sepharose FF 疏水柱， 用 0.5mol/L(NH4)2SO4洗脱后透析除盐， 样品浓缩后再上样DEAE SephadexA-25阴离子交换柱， 采用0.3mol/L NaCl洗脱， 收集含目的蛋白洗脱峰， 浓缩后采用Sephacyal-HR200分子筛脱 盐， 冷冻干燥得最终产品。 0017 6 IFN-2a 与 LL-37 融合蛋白的检测 0018 6.1 融合蛋白纯度检测 0019 用 SDS-PAGE 法检测融合蛋白纯度， 检测参照文献进行。以 Takara 蛋白分子质量 标准 ( 低 ) 为 Marker。以未经诱导的发酵液为空白对照。 00。
12、20 6.2 融合蛋白浓度检测 0021 以牛血清白蛋白为标准， 按 Lowry 法测定融合蛋白浓度。 0022 6.3 融合蛋白产物活性分析 0023 培养液中 IFN-2a 的活性分析参照 中国药典 2010 版 中 干扰素效价测定 ( 细 胞病变抑制法 ) 。活性标准品购自广州市药品检测所。以总 IFN-2a 活性计算纯化过程 中的回收率。 0024 培养液中 LL-37 的活性测定参照文献 17。用大肠杆菌 ATCC 25922 以及 ML 35p 作 为检测菌种， 用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径 3mm 的圆孔， 每孔加 10L 发 酵液， 37孵化 3h 后， 在底层上。
13、覆盖一层营养琼脂， 37继续培养 20h， 测量无菌生长的透 明环直径。抗菌活性以下式计算 ： 0025 抗菌活性单位 (U) ( 抗菌环直径 -3)10 附图说明 0026 图 1 重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN 构建过程 说 明 书 CN 105330747 A 4 3/4 页 5 0027 图 2 重组 P.pastoris GS115LI 与原始菌 P.pastoris GS115 基因 PCR 结果 0028 1 道为 200bp marker， 2、 3、 4、 5 道为 P.pastoris GS115LI， 6、 7、 8 为 P.pastoris GS115。 00。
14、29 图 3 经过诱导和未诱导的 GS115LI1 发酵液的 SDS-PAGE。 具体实施方式 0030 下面结合附图和实施例子对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于此。 0031 1 IFN-2a 与 LL-37 的密码子优化 0032 自 Genebank 中查询， 获得 Homo sapiens interferon alpha 2a 序列， Sequence ID ： gb|JN848522.1， 全长为 567 序列， 按毕赤酵母密码子偏好性优化后， 所得结果见 SEQ ID No.2。 0033 自 Genebank 中查询的人抗菌肽 LL-37 基因， 按毕赤酵母密码子偏好性优。
15、化后， 所 得结果见 SEQ ID NO.3。 0034 2 人 LL-37 与 IFN-2a 融合重组质粒的构建 0035 经过优化的人 LL-37DNA 序列 (3端不带终止密码子 )， 通过 4 个甘氨酸和 1 个丝 氨酸与 IFN-2a 柔性联结。重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN 的构建过程见图 1。 0036 将构建的质粒 pPIC9K-Fall-IFN 转入化感受态 E.coli DH5， 所挑选的阳性转化 子经摇瓶提取质粒， 用 EcoRI 和 NotI 双酶切鉴定得到大小约为 9300 和 690 的两条片断， 与 预期的结构一致。同时将质送样测序， 得到的 DNA 序。
16、列与设计的结果一致。 0037 3 重组质料 pPIC9K-Fall-IFN 整合入毕赤酵母 GSP 115 0038 重组菌 P.pastoris GS115LI 与原始菌 P.pastoris GS115 基因 PCR 结果电泳图见 图 2。 0039 重组酵母基因组可扩增得到大小约为 690bp 的条带， 而空白的原始菌株 GS115 却 在相应位置未出现相应的条带， 这表明重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN 成功整合进入了酵母的 基因组中， 所获得的重组菌 P.pastoris GS115LI 与预期结果一致。 0040 4 筛选 Mut+及多拷贝编码基因重组菌 0041 P.p。
17、astoris GS115为组氨酸缺陷型(His-)， 因此不能在不含组氨酸的MD平板上生 长。 整合了含组氨酸编码基因(His4)质粒pPIC9K-Fall-IFN的菌株P.pastoris GS115LI， 由于获得了组氨酸的合成能力， 因此可以在不含组氨酸的 MD 平板上正常生长， 以此证明重 组菌株 P.pastoris GS115LI 可以正确的表达质粒 pPIC9K-Fall-IFN 的转录单元。实验结 果表明， 前述实验所筛选出来的阳性克隆 pPIC9K-Fall-IFN 均可以在 MD 平板上正常生长， 表明他们都具有正确的表型 (Mut-)。 0042 通常情况下， 重组菌株。
18、中质粒 pPIC9K-Fall-IFN 的拷贝数越高， 其表达目的产物 的能力就越强， 同时对遗传霉素 G418 的抗性就越强。因此， 通过遗传霉素浓度梯度筛选出 在高浓度下生长的菌株， 即表明其具有较高的拷贝数。本实验得到了在遗传霉素为 3mg/mL 浓度下能正常生长的重组菌二株， 分别命名为 GS115LI1 和 GS115LI2， 以供后续实验。 0043 5 表达产物 IFN-2a 与 LL-37 融合蛋白的分子检测 0044 表达产物 IFN-2a 与 LL-37 融合蛋白的分子检测结果见图 3。 0045 从图中可以看出， 在蛋白 Marker 的 20.1 至 29kDa 之间，。
19、 如图中箭头所示， 诱导的 说 明 书 CN 105330747 A 5 4/4 页 6 具有明显的条带， 未诱导的在相应位置没有条带。LL-37 与 IFN-2a 融合蛋白的分子量 约为 26kDa， 与图中预期的一致。因此， 可以判断 GS115LI1 成功表达出了所需的 LL-37 与 IFN-2a 融合蛋白 0046 6 重组菌株 GS115LI 产物活性分析 0047 融合蛋白的抗病毒活性与抗菌活性测定结果见表 1。 0048 表 1 LL-37 与 IFN-2a 融合蛋白抗病毒与抗菌活性检测 0049 0050 从表 1 中可以看出， 重组菌 GS115LI1 与 GS115LI2。
20、 经诱导后的发酵液中均能检出 较高的抗病毒和抗菌活性， 这说明了融合蛋白保证了二者各自的活性功能。 0051 7 融合蛋白纯化结果 0052 融合蛋白的纯化结果见表 2。 0053 表 2 LL-37 与 IFN-2a 融合蛋白纯化过程中的纯度与回收率 0054 0055 从表中可以看出， 在 LL-37 与 IFN-2a 融合蛋白纯化过程中过程中， 总的回收率 为 46.2， 其中疏水层析的损失最大， 达到 20.2， 其次为盐析损失 19.0， 阴离子交换层析 损失 14.6。最终产品的纯度达到 97， 满足了医用产品的质量标准。利用 Lowry 法检 测分子筛脱盐后的溶液融合蛋白总量 ( 相当于牛血清白蛋白 ) 为 378.4mg， 换算成产品的 IFN-2a 活性为 2.6108IU/mg， 发酵液中产物的产量为 819.1mg/L。 说 明 书 CN 105330747 A 6 1/3 页 7 0001 序 列 表 CN 105330747 A 7 2/3 页 8 0002 0003 序 列 表 CN 105330747 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 105330747 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 105330747 A 10 。