技术领域
本发明属于鸡分子标记制备技术领域。具体涉及一种应用荧光探针PCR 进行鸡片羽和丝羽的鉴定方法。
背景技术
目前，家禽的新品种培育方法主要是选择育种，利用选择育种的方法已 经培育出很多新品种，但是常规育种方法对数量性状的选择要在个体生长发 育到一定阶段才能表现出来，育种周期长，生产成本高的问题严重制约了家 禽育种业的快速发展。
家禽身上的羽毛性状主要为丝羽和片羽，由鸡3号染色体上的一个单核 苷酸多态性(SNP)位点决定的，该位点位于ss666793747/rs316090093上。 在该位点上，GG和GC基因型的羽毛状态表现为片羽状，而CC基因型的羽 毛状态为丝羽状。目前，对于羽毛性状选育还是通过常规选育，即需要培育 一段时间后羽毛性状才会表达出来，届时才能进行挑选或淘汰。因而迫切需 要建立一种快速的鸡丝羽和片羽的分子鉴定方法，在雏鸡就能检测出羽毛性 状的基因型，或对父母代进行检测然后进行淘汰，所产生的后代将是目的基 因型，从而为家禽育种缩短时间，降低生产成本。
荧光探针PCR方法实现了对性状的定性，而且具有灵敏度高、选择性好、 响应时间短，易于直接观察和不受生物的年龄、发育阶段、性别和养殖环境 条件的影响等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，荧光探针PCR在成 本和时间方面显示出更大的优势，如：高通量，低成本，高效率。
目前，尚未见有应用荧光探针PCR技术对鸡丝羽和片羽的分子鉴定方法 进行检测和诊断的相关报道。因而，研究开发一种敏感性高、低成本和易于 直接观察的应用荧光探针PCR技术对鸡丝羽和片羽的分子鉴定方法显得十分 迫切和必要。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的是为了克服家禽羽毛性状常规选育中育种时间长，生产成 本高的缺陷，提供一种应用荧光探针PCR进行鸡片羽和丝羽的鉴定方法。
本发明提供的技术方案为：
一种检测鸡羽状基因的荧光探针PCR引物组，所述的荧光探针PCR引物 组是由引物1、引物2、引物3和引物4组成，所述的引物1、所述引物2、 所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
作为优选，所述的引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔 比为1:1:1:1。
本发明还提供一种检测鸡羽状基因的荧光探针PCR的试剂Ⅰ，其是由所 述的引物组、探针A和探针B组成。
作为优选，所述的探针A的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，且所述的 探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料C。
作为优选，所述的报告荧光染料A为FAM，所述的FAM荧光信号标记 G型，所述荧光信号标记G型为绿光。
作为优选，所述的探针B的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，且所述的 探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料C。
作为优选，所述的报告荧光染料B为HEX，所述的HEX荧光信号标记C 型，所述的荧光信号标记C型为蓝光。
作为优选，所述的淬灭荧光染料C为BHQ。
本发明还提供一种检测鸡羽状基因的荧光探针PCR的试剂Ⅱ，其是由所 述的试剂Ⅰ、PCR扩增缓冲液和水组成。
作为优选，所述的检测鸡羽状基因的荧光探针PCR的试剂Ⅱ中引物1、 引物2、引物3、引物4、探针A、探针B和淬灭荧光染料C的浓度均为10 μM。
本发明还提供了一种应用荧光探针PCR进行鸡片羽和丝羽的鉴定方法， 所述的鉴定方法是使用所述的的荧光探针PCR引物组或所述的荧光探针PCR 的试剂Ⅰ或所述的荧光探针PCR的试剂Ⅱ完成鉴定的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过PrimerExpress5.0软件设计了多套探针和引物，通过分析 其引物之间的二聚体，筛选出了1套探针和引物，并选出了其引物和探针的 浓度组合，建立了种应用荧光探针PCR进行鸡片羽和丝羽的鉴定方法。
2.本发明的方法检测时间短，仅需90min的时间即可完成鉴定，并且反 应结果可直接通过电脑观察。而常规PCR方法完成扩增后，还需胶回收、测 序分析等工作，至少需要4天的时间才得知鉴定结果。
3.本发明的方法检测灵敏度高且特异性强。当三种基因型同时进行检测 时，所建立的方法鉴定结果与表型相一致。
附图说明
图1为检测GG基因型结果。
图2为检测CC基因型结果。
图3为检测GC基因型结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施 方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用 于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可 以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限 定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所以用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径 得到。
下述实施例中所使用一些材料和试剂如下：
LightCycler96荧光定量PCR仪(Roche)；
血液基因组柱式提取试剂盒(0.1-1ml)、2×EsTaqMasterMix和GoldStar TaqManMixture(WithROX)购自北京康为世纪生物科技有限公司；
pGM-Tvector、T4DNA连接酶购自北京全式金生物技术有限公司；
E.coliDH5α、质粒中量抽提试剂盒购自天地杨生物科技有限公司；
Amp、IPTG、X-gal等常规化学试剂购自广西南宁市生化药品仪器有限公 司；
GG基因型、CC基因型和GC基因型样品均从东兰乌鸡中得到，公众可 从广西壮族自治区畜牧研究所获得。
实施例1：引物与Taqman探针的设计与合成
根据Ganbank中鸡3号染色体与鸡羽毛性状有关的DNA序列，采取Primer Express5.0软件，设计一对特异性引物和两条Taqman探针(表1)。
表1引物和Taqman探针序列(5’-3’)
实施例2：荧光探针PCR检测
2.1核酸的提取
参照血液基因组柱式提取试剂盒说明书提取GG基因型、CC基因型和 GC基因型的DNA。
2.2标准基因型的制备
以自行设计的引物进行PCR扩增，上游引物为5’ -GACTCTCAACGCGGGAAC-3’，下游引物为5’ -CTGGGGGCAGCCATCTT-3’。
采用25μL的反应体系：2×EsTaqMasterMix15μL，正反向引物各0.5 μL，DNA模板2μL，补水至25μL。
PCR条件为：第一步：95℃5min，第二步：95℃30s，第三步：62℃30 s，第四步：72℃30s，第五步：72℃5min；其中第二步至第四步循环30 次。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的基因后与pGM-Tvector 连接，得到重组质粒。
连接体系为：pGM-Tvector1μL，PCR目的基因产物5μL，10×T4ligase buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，双蒸水2μL，16℃连接12h过夜。
用10μL连接液转化100μL感受态E.coliDH5α，将装有感受态细胞的 EP管在冰浴中静止30min，接着移至42℃水浴中热激90S，随后快速将EP 管转移至冰浴2min，最后加900μLLB培养基混匀后37℃摇床震荡培养45min (150r/min)。取100μL感受态细胞涂布在含Amp(100μg/mL)、IPTG(0.5 mmol/L)、X-gal(0.004％)的LB(0.5％酵母膏、1％胰蛋白胨、1％氯化钠)平板 上37℃培养16小时后挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提 质粒进行PCR测序验证。各筛选1个基因型样本。
2.3荧光探针PCR检测方法的确立
分别将上述得到的三种基因型的DNA作为模板，将表1中的引物和探针 在浓度为10μmol/L时，进行荧光探针PCR，选择引物和探针的浓度。
扩增反应总体积为50μL：GoldStarTaqManMixture(WithROX)25μL， 正反向引物各1.5μL，探针引物各0.5μL，DNA模板4μL，补水至50μL， 均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。在每个循 环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：
2.4试验结果(见图1-3)
结果表明，当引物和探针浓度在10μM时，扩增效果最好。FAM荧光信 号标记G型(绿线)，HEX荧光信号标记C型(蓝线)。
从图1中的荧光曲线可见，GG纯合型只有理想的一条扩增曲线升起来， 另一条非特异的被压制的相对较好；从图2中的荧光曲线可见，CC纯合型只 有理想的一条扩增曲线升起来，另一条非特异的被压制的相对较好；从图3 中的荧光曲线可见，GC杂合型两条扩增曲线均在同一位置升起来。
结果表明，本发明建立的荧光探针PCR方法可对鸡羽毛性状片羽和丝羽 进行快速鉴定。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。