一种静注人免疫球蛋白（PH4）的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510787215.7 (22)申请日 2015.11.17 C07K 16/06(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (71)申请人 上海洲跃生物科技有限公司 地址 201306 上海市浦东新区新城路2号24 幢 N3925 室 (72)发明人 李春洲 (54) 发明名称 一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 包括如下步骤 ：（1） 组分II+III沉淀。

2、 的悬浮 ；（2） 低温抽提 ；（3） 压滤 ；（4） 超滤透析脱 醇 ；（5） 阴离子交换柱层析 ；（6） 超滤浓缩及调节 ； （7） 低 PH 孵化 ；（8） 纳米膜除病毒过滤 ；（9） 除菌 过滤并分装。本发明采用含乙醇的抽提液， 使 IgG 在低温下选择性溶出， 再经一步阴离子交换柱层 析完成对 IgG 的纯化 ； 制备过程中无添加高浓度 乙醇的操作， 减少了乙醇对蛋白的变性损伤作用 ； 超滤过程中， 采取了蛋白保护措施减少了蛋白的 剪切损伤 ； 本发明工艺流程简洁， 工序少， 大大缩 短了生产周期 ； 制品的多聚体、 IgA、 PKA 及 ACA 含 量均比传统工艺大幅下降， 得率超。

3、过 2000 瓶 / 吨 血浆， 远高于传统工艺。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 105315366 A 2016.02.10 CN 105315366 A 1/2 页 2 1.一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： （1） 组分 II+III 沉淀的悬浮 按一定的稀释比， 将组分II+III沉淀投入到预先配制的溶解缓冲液中均匀搅拌1-3小 时， 使沉淀充分悬浮分散 ； （2） 低温抽提 将步骤 （1） 得到的悬浮液与预先配制的含乙醇的低温抽提液混合， 搅。

4、拌 3-5 小时， 使目 标蛋白充分抽提， 得到均匀的悬浮液 ； （3） 压滤 将步骤 （2） 得到的悬浮液在 -20下压滤， 收集滤液 , 及时在滤液中加入山梨醇 3-5% （w/w） ， 充分搅拌使其溶解 ； （4） 超滤透析脱醇 用截留分子量 10K-30K 的超滤膜浓缩步骤 （3） 得到的滤液， 然后用 4-6 倍体积的透析 液 1 恒体积透析脱去乙醇， 得到粗纯的 IgG 溶液 ； （5） 阴离子交换柱层析 步骤 （4） 得到的 IgG 溶液上阴离子交换柱， 控制上样液的线流速不高于 100cm/h， 柱子 预先用平衡缓冲液平衡 ； 上柱过程中， 收集流穿液， 上柱结束后， 用平衡缓。

5、冲液冲洗柱子， 冲 洗液并入流穿液中 ； （6） 超滤浓缩及调节 用截留分子量 10K-30K 的超滤膜浓缩步骤 （5）得到的流穿液， 然后用透析液 2 恒体 积透析 4-6 倍， 然后浓缩至蛋白浓度 6-7%(w/v) 左右， 转移出超滤膜包并用透析液 2 后洗 膜包， 再用透析液 2 调蛋白浓度至 5.30-5.50%(w/v)， 用 0.5M 盐酸溶液调蛋白溶液 PH 至 3.95-4.15 ； （7） 低 PH 孵化 用 0.22 微米的除菌滤芯过滤后置于室温孵化 21 天 ； （8） 纳米膜除病毒过滤 用 20 纳米的滤芯过滤步骤 （7） 孵化结束的蛋白溶液以去除病毒 ； （9） 除。

6、菌过滤并分装。 2.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 所述的稀释比为 1 ： 8-12， 即一份重量的组分 II+III 沉淀加入到 8-12 份的溶解缓冲液 中。 3.根据权利要求 1 所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤 （1） 所述的溶解缓冲液为 20-40mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液 ； 溶解缓冲液的 PH 值为 4.00-5.00 ； 溶解缓冲液的温度为 0-2。 4.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 所述的。

7、抽提液， 其重量是步骤 （1） 所得悬浮液总重的 0.8-1.2 倍。 5.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 所述的抽提液为 20-40mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液 ； 其中乙醇浓度为 11-14%(v/v) ； 抽提液的 PH 值为 5.00-6.00 ； 抽提液的温度为 -2 0。 6.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 权 利 要 求 书 CN 105315366 A 2 2/2 页 3 （4） 所述的透析液 1 为 10-20mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶。

8、液 ； 透析液 1 的 PH5.20-6.00 ； 透析 液 1 的温度 1-5 ； 透析液 1 中含山梨醇 3-5%(w/w)。 7.根据权利要求 1 所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步 骤 （5） 所述的阴离子交换柱所用填料为 Capto Q、 Capto DEAE、 Q Sepharose FF 及 DEAE Sepharose FF 中的任意一种。 8.根据权利要求 1 所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4）的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （5）所述的平衡缓冲液为 10-20mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶液， 平衡缓冲液的 PH 为 5.2。

9、0-6.00。 9.根据权利要求1所述的一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （6） 所述的透析液 2 为 5%(w/w) 山梨醇水溶液， 透析液 2 的温度为 2-8。 权 利 要 求 书 CN 105315366 A 3 1/5 页 4 一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法 技术领域 0001 本发明属生物制药领域， 涉及一种血制品的制备方法， 具体是涉及一种静注人免 疫球蛋白 （PH4） 的制备方法。 背景技术 0002 人免疫球蛋白 （immunoglobulin） 是一种具有抗体活性的蛋白质 , 主要存在于血 浆中， 也见于其它体液、 组织和一。

10、些分泌液中。免疫球蛋白可以分为 IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE 五类 , 人体血清免疫球蛋白的主要成分是 IgG ， 占总免疫球蛋白的 70-75%， 分子量约 15 万， 含糖 2 3%。IgG 分子由 4 条肽链组成。其中分子量为 2.5 万 （23kD） 的肽链， 称轻链 （L 链） ， 分子量为 5 万的肽链 （50 60kD） ， 称重链 （H 链） 。轻链与重链之间通过二硫键 （ SS） 相连接。 0003 人体血清免疫球蛋白 IgG 是初级免疫应答中最持久、 最重要的抗体， 它仅以单体 形式存在。 大多是抗菌性、 抗毒性和抗病毒抗体属于IgG， 它在抗感染中起到主。

11、导作用， 它能 够促进单核巨噬细胞的吞噬作用 （调理作用） ， 中和细菌毒素的毒性 （中和毒素） 和病毒抗原 结合使病毒失去感染宿主细胞的能力 （中和病毒） 。IgG 是唯一能通过胎盘的 Ig， 在自然被 动免疫中起重要作用。此外， IgG 还具有调理吞噬和结合 SPA 等作用。 0004 人免疫球蛋白分肌注人免疫球蛋白和静注人免疫球蛋白， 肌注人免疫球蛋白主要 用于预防麻疹和传染性肝炎， 临床上广泛使用其它一些特殊的肌注人免疫球蛋白如抗乙肝 人免疫球蛋白、 抗狂犬病人免疫球蛋白、 抗破伤风人免疫球蛋白等， 若与抗生素合并使用， 可提高对某些严重细菌和病毒感染的疗效。 0005 静注人免疫球蛋。

12、白即IVIG是至少从1000个以上健康供血者所献血浆混合后提取 而来的， 含有各种抗病毒、 细菌抗原特异性抗体， 具有调节中和作用， 经静脉注射后可迅速 提高使受者血液中IgG水平。 故IVIG起效快,疗效好， 副作用少， 成为临床上人免疫球蛋白 使用最频繁、 使用量最大的的品种. IVIG最初多用于治疗多种原发性免疫球蛋白缺陷症和 各种继发性免疫缺乏症如免疫介导的血小板减少、 川崎病等， 目前， 已经将 IVIG 的临床应 用拓展到 50 多种疾病如再生障碍性贫血贫血、 新生儿溶血病、 输血后紫癜、 特发性血小板 减少性紫癜、 癫痫、 重症肌无力、 多发性硬化症、 多发性骨髓瘤、 多发性肌炎。

13、、 多发性神经病， 脏器肿大， 艾滋病等， 在危重症的抢救中起着越来越重要的作用。 0006 由于国内血浆采集量有限， 国内 IVIG 的市场供应量远远满足不了临床需求， 各血 制品公司都在设法改进工艺以期用有限的血浆获得更多的 IVIG 产品。目前国内传统的生 产工艺大都采用低温乙醇法或改良的低温乙醇工艺。如专利 CN 104479011A, 将 I+II+III 溶解后， 先经两步低温乙醇 （15%， V/V） 沉淀， 压滤除去大部分杂蛋白， 然后将上清液 （组分 II） 在中性条件下加乙醇 (20%,V/V) 沉淀出来， 将沉淀复溶， 经过超滤、 透析、 浓缩 , 再加乙 醇 (2%,V。

14、/V) 沉淀一次， 压滤收集上清液， 再次超滤透析、 浓缩加入保护剂后无菌分装。专利 CN 103554253A 以组分 II+III 为起始原料， 溶解后加乙醇 （18%， V/V） 沉淀， 压滤收集上清 液， 然后透析脱醇、 脱盐， 经过两步柱层析， 收集流穿液， 再次超滤、 透析、 浓缩， 除菌过滤后 说 明 书 CN 105315366 A 4 2/5 页 5 孵化， 后除病毒过滤再无菌分装得成品。 0007 不难看出 ， 目前的低温乙醇法工艺大都需要多次乙醇沉淀， 频繁地在蛋白溶液中 添加乙醇， 不可避免地造成蛋白局部变性受损， 而蛋白的频繁凝结与溶解， 亦对蛋白的分子 结构造成损伤。

15、。 另外， 现有的低温乙醇沉淀工艺均采用先将全部蛋白充分溶解， 再加乙醇选 择性地沉淀目标蛋白或杂蛋白， 不可避免地造成蛋白共沉淀现象， 从而使得产品的纯度不 是很高 ； 有的工艺虽然也用到柱层析纯化， 但多采用两步柱层析， 使得流程复杂， 得率下降。 0008 本发明以组分 II+III 为起始原料， 以一步低温抽提技术外加一步柱层析完成对 IgG 的纯化， 流程简洁， 工序少， 大大缩短了生产周期 ； 制品的纯度高， 而多聚体、 IgA、 PKA 及 ACA 均低于传统工艺， 得率则远高于传统工艺。 发明内容 0009 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺先进， 操作便利， 产品质量稳定。

16、， 得率 高、 可工业化生产的静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法。 0010 1， 一种静注人免疫球蛋白 （PH4） 的制备方法， 包括如下步骤 ： （1） 组分 II+III 沉淀的悬浮 按一定的稀释比， 将组分II+III沉淀投入到预先配制的溶解缓冲液中均匀搅拌1-3小 时， 使沉淀充分悬浮分散 ； （2） 低温抽提 将步骤 （1） 得到的悬浮液与预先配制的含乙醇的低温抽提液混合， 搅拌 3-5 小时， 使目 标蛋白充分抽提， 得到均匀的悬浮液 ； （3） 压滤 将步骤 （2） 得到的悬浮液在-3-1下压滤， 收集滤液,及时在滤液中加入山梨醇3-5% （w/w） ， 充分搅拌使其溶解。

17、 ； （4） 超滤透析脱醇 用截留分子量 10K-30K 的超滤膜浓缩步骤 （3） 得到的滤液， 然后用 4-6 倍体积的透析 液 1 恒体积透析脱去乙醇， 得到粗纯的 IgG 溶液 ； （5） 阴离子交换柱层析 步骤 （4） 得到的 IgG 溶液上阴离子交换柱， 控制上样液的线流速不高于 100cm/h， 柱子 预先用平衡缓冲液平衡 ； 收集流穿液， 上柱结束后， 用平衡缓冲液冲洗柱子， 冲洗液并入流 穿液中 ； （6） 超滤浓缩及调节 用截留分子量 10K-30K 的超滤膜浓缩步骤 （5）得到的流穿液， 然后用透析液 2 恒体 积透析 4-6 倍， 然后浓缩至蛋白浓度 6-7%(w/v) 。

18、左右， 转移出超滤膜包并用透析液 2 后洗 膜包， 再用透析液 2 调蛋白浓度至 5.30-5.50%(w/v)， 用 0.5M 盐酸溶液调蛋白溶液 PH 至 3.95-4.15 ； （7） 低 PH 孵化 用 0.22 微米的除菌滤芯过滤后置于室温孵化 21 天 ； （8） 纳米膜除病毒过滤 用 20 纳米的滤芯过滤步骤 （7） 孵化结束的蛋白溶液以去除病毒 ； 说 明 书 CN 105315366 A 5 3/5 页 6 （9） 除菌过滤并分装。 0011 2， 步骤 （1） 所述的稀释比为 1 ： 8-12， 即一份重量的组分 II+III 沉淀加入到 8-12 份重量的溶解缓冲液中 ；。

19、 所述的溶解缓冲液为 20-40mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液 ； 溶解 缓冲液的 PH 值为 4.00-5.00， 溶解缓冲液的温度为 0-1。 0012 3， 步骤 （2） 所述的抽提液， 其重量是步骤 （1） 所得悬浮液总重的 0.8-1.2 倍 ； 所述的抽提液为20-40mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液 ； 其中含乙醇11-14%(v/v) ； 抽提 液的 PH 值为 5.00-6.00， 抽提液的温度为 -5 -4。 0013 4， 步骤 （4）所述的透析液 1 为 10-20mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶液， 透析液 1 的 PH5.20-6.00， 透析液 1 的温。

20、度 1-5， 透析液 1 中含山梨醇 3-5%(w/w)。 0014 5， 步骤 （5） 所述的阴离子交换柱所用填料为 Capto Q、 Capto DEAE、 Q Sepharose FF 及 DEAE Sepharose FF 中的任意一种 ； 所述的平衡缓冲液为 10-20mmol/L 的醋酸 - 醋酸 钠溶液， 平衡缓冲液的 PH 为 5.20-6.00。 0015 6， 步骤 （6） 所述的透析液2为5%(w/w)山梨醇的水溶液， 透析液2的温度为2-8。 0016 本发明的优越性 （1） ， 采用低浓度乙醇抽提液低温下使组分 II+III 中的目标蛋白选择性溶出， 而其它 杂蛋白则。

21、处于凝结状态 ; 经过一步抽提即达到较高的 IgG 纯度。 0017 （2） ， 采用的乙醇抽提液是预先配制并冷却至低温的， 省却了在蛋白溶液中加乙醇 的操作， 从而避免了乙醇对蛋白的变性损伤。 0018 （3） 采用一步低温抽提技术， 避免了传统工艺多次加乙醇进行沉淀的操作， 节省了 大量的时间。 0019 （4） ， 超滤透析操作中， 蛋白溶液与透析液中均添加蛋白保护剂， 避免了超滤操作 对蛋白的剪切损伤。 0020 （5） ， 本发明工艺采用低温抽提技术结合离子交换柱层析技术完成对 IgG 的纯化， 工序少， 能耗低， 纯度与得率均明显提高。 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发。

22、明作进一步的说明， 实施例只是为了使本领域的技术人员 更好地理解本发明， 不可理解为对本发明权力保护范围的限定， 相反， 对于本领域的普通科 研人员而言， 凡利用本发明进行的任何非实质性的改动或调整， 均应落入本发明的保护范 围之内。 0022 实施例一， 1， 组分 II+III 沉淀的悬浮 ： 称取组分 II+III 沉淀 10kg， 投入 80kg 溶解缓冲液 （20mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， PH4.10-4.20,01） 中， 均匀搅拌 3 小时， 使沉淀充分 悬浮 ； 2， 低温抽提 ： 将以上悬浮液与 90kg 含乙醇 12%（v/v） 的抽提液 （20mmol/L。

23、 的醋酸 - 醋 酸钠缓冲液， PH5.90-6.00， -5 -4） 混合， 搅拌 5 小时， 使目标蛋白从沉淀中充分抽提， 得 到均匀悬浮液 ； 3， 压滤 ： 在 -3 -1下压滤以上悬浮液， 并后洗沉淀， 共收集滤液 173kg, 加入山梨醇 8.7kg， 充分搅拌使其溶解 ； 说 明 书 CN 105315366 A 6 4/5 页 7 4， 透析脱醇 ： 用30k超滤膜浓缩以上滤液， 控制进口压力不高于20PSI， 浓缩至约16kg， 然后用 64kg 的透析液 1（20mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶液， PH5.50-5.60， 山梨醇 5%(w/w)， 1-2） 恒体积透析。

24、脱去乙醇， 然后转移并用约 64 kg 的透析液后洗超滤膜， 收集 80.7kg ； 5， 阴离子交换柱层析 ： 以 90-100cm/h 的上柱线速度上 Capto Q 柱， 柱子预先用平衡缓 冲液 (20mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶液， PH5.60-5.70） 平衡， 收集流穿液 ； 上柱结束后， 用平 衡缓冲液冲洗柱子， 将冲洗液并入流穿液 ； 6， 透析浓缩并调节 ： 用 30k 超滤膜浓缩以上流穿液至约 15kg， 然后用 5% 山梨醇水溶 液 60kg 进行透析， 再次浓缩后转移并后洗超滤膜， 收集 18.5kg ； 测蛋白浓度 6.94%(w/v) ， 用 5%(w/w)。

25、 山梨醇水溶液调蛋白浓度至 5.35%(w/v)， 用 0.5M 稀盐酸调蛋白溶液 PH 至 3.95-4.05; 称重 24.0kg ； 7， 低 PH 孵化 ： 用 0.22 微米的除菌滤芯除菌过滤后置于室温孵化 21 天 ； 8， 纳米膜除病毒过滤 ： 用 20nm 滤芯除病毒过滤 ； 9， 除菌过滤后分装得到成品。 0023 实施例二， 1， 组分II+III沉淀悬浮 ： 称取组分II+III沉淀10kg， 投入120kg溶解缓冲液 （40mmol/ L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， PH4.90-5.00,01） 中， 均匀搅拌 1 小时， 使沉淀充分悬浮 ； 2， 低温抽提 ： 将以。

26、上悬浮液与 105kg 含 14%(v/v) 乙醇的抽提液 （40mmol/L 的醋酸 - 醋 酸钠缓冲液， PH5.40-5.50， -5 -4） 混合， 搅拌 3 小时， 使目标蛋白从沉淀中充分抽提， 得 到均匀悬浮液 ； 3， 压滤 ： 在 -3-1下压滤以上悬浮液， 并后洗沉淀， 共收集滤液 235kg, 加入山梨醇 7.1kg， 充分搅拌使其溶解 ； 4, 透析脱醇 ： 用 30k 超滤膜浓缩以上滤液， 控制进口压力不高于 20PSI， 浓缩至约 16kg， 然后用 96kg 的透析液 （30mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶液， PH5.90-6.00， 山梨醇 5%(w/ w)，。

27、 1-2）恒体积透析脱去乙醇， 然后转移并用约 80kg 的透析液后洗超滤膜， 共收集 97.1kg ； 5， 阴离子交换柱层析 ： 以 50-60cm/h 的上柱线速度上 Q Sepharose FF 柱， 柱子预先用 平衡缓冲液平衡， 平衡液为40mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液， PH5.90-6.00， 收集流穿液 ； 上柱 结束后， 用平衡缓冲液冲洗柱子， 将冲洗液并入流穿液 ； 6， 透析浓缩并调节 ： 用 10k 超滤膜浓缩以上流穿液至约 15kg， 然后用 5% 山梨醇水溶液 80kg 进行透析， 再次浓缩后转移并后洗超滤膜， 收集 17.1kg， 测蛋白浓度 6.81%(w/v。

28、) ， 用 含 5%(w/w) 山梨醇的水溶液稀释浓缩液， 调蛋白浓度至 5.35%(w/v)， 用 0.5M 稀盐酸调蛋白 溶液 PH 至 3.95-4.05; 称重 21.8kg ； 79， 同实施例一。 0024 实施例三， 1， 组分II+III沉淀悬浮 ： 称取组分II+III沉淀10kg， 投入100kg溶解缓冲液 （30mmol/ L 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液， PH4.50-4.60,01） 中， 均匀搅拌 2 小时， 使沉淀充分悬浮 ； 2， 低温抽提 ： 将以上悬浮液与 120kg 含 11%(v/v) 乙醇的抽提液 （30mmol/L 的醋酸 - 醋 酸钠缓冲液， PH5。

29、.70-5.80， -5 -4） 混合， 搅拌 4 小时， 使目标蛋白从沉淀中充分抽提， 得 到均匀悬浮液 ； 说 明 书 CN 105315366 A 7 5/5 页 8 3， 压滤 ： 在 -3 -1下压滤以上悬浮液， 并后洗沉淀， 共收集滤液 235kg, 加入山梨醇 9.4kg， 充分搅拌使其溶解 ； 4, 透析脱醇 ： 用 10k 超滤膜浓缩以上滤液， 控制进口压力不高于 20PSI， 浓缩至 约 16kg， 然后用 80kg 的透析液 （10mmol/L 的醋酸 - 醋酸钠溶液， PH5.30-5.40， 山梨醇 5%， 1-2）恒体积透析脱去乙醇， 然后转移并用约 80 kg 的。

30、透析液后洗超滤膜， 共收集 100.9kg ； 5， 阴离子交换柱层析 ： 用 70-80cm/h 的上柱线流速上 DEAE Sepharose FF 柱， 预先用 平衡缓冲液 （10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液， PH5.30-5.40） 平衡， 收集流穿液 ； 上柱结束后， 用平衡缓冲液冲洗柱子， 将冲洗液并入流穿液 ； 6， 透析浓缩并调节 ： 浓缩以上流穿液至约 16kg， 然后用 96kg 含 5% 山梨醇的水溶液进 行透析， 再次浓缩后转移并后洗超滤膜， 收集 19.2kg， 测蛋白浓度 6.97% (w/v)， 用 5%(w/w) 山梨醇水溶液调蛋白浓度至5.35%(w/v)， 用0.5M稀盐酸调蛋白溶液PH至3.95-4.05 ； 称重 25.0kg ； 79， 同实施例一。 0025 表 IVIG 试制品得率及质量指标一览表 * 国内血制品公司的得率一般为 1600-1900 瓶 / 吨血浆。 附图说明 图 1 是静注人免疫球蛋白 (PH4) 的制备工艺流程图。 说 明 书 CN 105315366 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 105315366 A 9 。