技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌的培养方法。
背景技术
大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠 埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。它是寄生在人体大肠里对人体无害 的一种单细胞生物，结构简单，繁殖迅速，培养容易，它是生物学上重要的 实验材料。在婴儿刚出生的几小时内，大肠杆菌就经过吞咽在肠道内定居了。 正常情况下，大多数大肠杆菌是非常安分守己的，他们不但不会给我们的身 体健康带来任何危害，反而还能竞争性抵御致病菌的进攻，同时还能帮助合 成维生素，与人体是互利共生的关系。只有在机体免疫力降低、肠道长期缺 乏刺激等特殊情况下，大肠杆菌才移居到肠道以外的地方，例如胆囊、尿道、 膀胱、阑尾等地，造成相应部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大 肠杆菌通常被看作机会致病菌。
各种动物大肠杆菌灭活疫苗的制备中，首要环节就是大肠杆菌的培养。 为了获得理想的活菌浓度，业界对大肠杆菌培养工艺进行了大量研究。影响 大肠杆菌培养菌浓度的因素有很多，如培养基组成、培养时间、菌种接种量 以及细菌生长环境等一般情况下，生物药物的产率与大肠杆菌发酵密度密切 相关，大肠杆菌的收率直接关系到生物药物的产率。所以在菌体表达蛋白效 率相当的情况下，大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的生产成本。特 别是在同样的纯化技术条件下。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种大肠杆菌的培养方法。
一种大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：
1)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，36.8～37.5℃条件下培养24～ 30小时，在琼脂平板上划线接种，37.2～37.8℃条件下培养20～24小时， 得到一级培养种子。
具体的，步骤1)中，所述的第一培养基中的营养成分包括：葡萄糖、 蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、孟加拉红溶液、琼脂、蒸馏水、去氧胆 酸钠溶液、链霉素溶液和二水氯化钙。
2)将步骤1)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，34.5～35.2℃ 条件下培养12～16小时，得到二级培养种子。
具体的，步骤2)中，所述的第二培养基中的营养成分包括：硫酸铵、 磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、酵母提取物、甘油、二水钼酸 钠、七水硫酸镁、五水硫酸铜、六水氯化钴和蒸馏水。
3)将步骤2)得到的二级培养种子接种到第三培养基中，37.5～38.0℃ 条件下培养16～18小时，得到三级培养种子，至于2～5℃条件下保存。
具体的，步骤3)中，所述的第三培养基中的营养成分包括：硫酸铵、 磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、酵母提取物、六水氯化铁、硼 酸、七水硫酸锌、生物素、硫酸锰、谷氨酸钠和蒸馏水。
优选的，步骤3)中，低温保存的时候滴加适量甘油。
4)将步骤3)得到的三级培养种子接种于菌液中，并导入至离心管中， 加入10～15％的琼脂，摇床过夜，再加入氯化钙溶液，混悬菌液，离心分 离，将上层清液去除，即得。
优选的，所述摇床的转速为120～160转/分钟。
优选的，所述氯化钙溶液的温度为3～6℃。
本发明所提供的大肠杆菌的培养方法能快速对大肠杆菌进行培养，同时 优化了微生物发酵培养条件，培养工艺简单，能够获得理想的高活菌浓度。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
实施例1
1)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，37.2℃条件下培养28小时， 在琼脂平板上划线接种，37.5℃条件下培养22小时，得到一级培养种子。 其中，第一培养基中的营养成分包括：葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水 硫酸镁、孟加拉红溶液、琼脂、蒸馏水、去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液和二 水氯化钙。
2)将步骤1)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，35.0℃条件下 培养15小时，得到二级培养种子。其中，第二培养基中的营养成分包括： 硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、酵母提取物、甘油、 二水钼酸钠、七水硫酸镁、五水硫酸铜、六水氯化钴和蒸馏水。
3)将步骤2)得到的二级培养种子接种到第三培养基中，37.8℃条件下 培养16小时，得到三级培养种子，至于4℃条件下保存。其中，第三培养基 中的营养成分包括：硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、 酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、生物素、硫酸锰、谷氨酸钠 和蒸馏水。
4)将步骤3)得到的三级培养种子接种于菌液中，并导入至离心管中， 加入12％的琼脂，摇床过夜，再加入4℃的氯化钙溶液，混悬菌液，离心分 离，将上层清液去除，即得。其中，摇床的转速为150转/分钟。
所得活菌浓度为4.8×109CFU/ml。
实施例2
1)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，36.8℃条件下培养30小时， 在琼脂平板上划线接种，37.2℃条件下培养24小时，得到一级培养种子。 其中，第一培养基中的营养成分包括：葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水 硫酸镁、孟加拉红溶液、琼脂、蒸馏水、去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液和二 水氯化钙。
2)将步骤1)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，34.5℃条件下 培养16小时，得到二级培养种子。其中，第二培养基中的营养成分包括： 硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、酵母提取物、甘油、 二水钼酸钠、七水硫酸镁、五水硫酸铜、六水氯化钴和蒸馏水。
3)将步骤2)得到的二级培养种子接种到第三培养基中，37.5℃条件下 培养18小时，得到三级培养种子，至于2℃条件下保存。其中，第三培养基 中的营养成分包括：硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、 酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、生物素、硫酸锰、谷氨酸钠 和蒸馏水。
4)将步骤3)得到的三级培养种子接种于菌液中，并导入至离心管中， 加入15％的琼脂，摇床过夜，再加入3℃的氯化钙溶液，混悬菌液，离心分 离，将上层清液去除，即得。其中，摇床的转速为160转/分钟。
所得活菌浓度为4.9×109CFU/ml。
实施例3
1)将大肠杆菌菌种接种于第一培养基中，37.5℃条件下培养24小时， 在琼脂平板上划线接种，37.8℃条件下培养20小时，得到一级培养种子。 其中，第一培养基中的营养成分包括：葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水 硫酸镁、孟加拉红溶液、琼脂、蒸馏水、去氧胆酸钠溶液、链霉素溶液和二 水氯化钙。
2)将步骤1)得到的一级培养种子接种到第二培养基中，35.2℃条件 下培养12小时，得到二级培养种子。其中，第二培养基中的营养成分包括： 硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、酵母提取物、甘油、 二水钼酸钠、七水硫酸镁、五水硫酸铜、六水氯化钴和蒸馏水。
3)将步骤2)得到的二级培养种子接种到第三培养基中，38.0℃条件 下培养16小时，得到三级培养种子，至于5℃条件下保存。其中，第三培养 基中的营养成分包括：硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、硫酸镁、 酵母提取物、六水氯化铁、硼酸、七水硫酸锌、生物素、硫酸锰、谷氨酸钠 和蒸馏水。
4)将步骤3)得到的三级培养种子接种于菌液中，并导入至离心管中， 加入10％的琼脂，摇床过夜，再加入6℃的氯化钙溶液，混悬菌液，离心分 离，将上层清液去除，即得。其中，摇床的转速为120转/分钟。
所得活菌浓度为5.2×109CFU/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。