基于高通量测序的35个STR等位基因的检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610601846.X (22)申请日 2016.07.27 (71)申请人 中国科学院北京基因组研究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院 104号楼中国科学院北京基因组研究 所 (72)发明人 严江伟杨猛杨雅冉陈婧 赵晶 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 基于高通量测序的35个STR等位基因的检测 试剂盒 (57)摘要 本发明属于基因检测领域， 具体涉及一种基 于高通量测序STR等位基因检测试剂盒。 该试剂 盒可。

2、同时扩增以下STR基因座， 具体为： D1S1656、 D2S1338、 D3S1358、 D4S2366、 D5S818、 D6S477、 D7S820、 D8S1179、 D9S925、 D10S1435、 D11S2368、 D12S391、 D13S325、 D14S608、 D15S659、 D16S539、 D17S1290、 D18S535、 D19S433、 D20S470、 D21S1270、 GATA198B05、 DXS101、 DXS6795、 DXS7133、 DXS981、 DXS10135、 DYS390、 DYS437、 DYS481、 DYS549、 DYS5。

3、76、 DYS643和PentaD。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 106222258 A 2016.12.14 CN 106222258 A 1.一种基于高通量测序的STR位点检测试剂盒， 该试剂盒可同时扩增以下STR基因座， 具体为： D1S1656、 D2S1338、 D3S1358、 D4S2366、 D5S818、 D6S477、 D7S820、 D8S1179、 D9S925、 D10S1435、 D11S2368、 D12S391、 D13S325、 D14S608、 D15S659、 D16S539、 D17S1290、 D18S535、 D19S433、 D20。

4、S470、 D21S1270、 GATA198B05、 DXS101、 DXS6795、 DXS7133、 DXS981、 DXS10135、 DYS390、 DYS437、 DYS481、 DYS549、 DYS576、 DYS643和PentaD。 2.根据权利要求1所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含扩增基因座的引物， 具体如下： 权利要求书 1/2 页 2 CN 106222258 A 2 3.根据权利要求1所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括1对能扩增 Amelogenin的引物， 分别为： 正向引物： ACAATGCCCTGGGCTCTGTAAAGA； 反向引。

5、物： GCCAACCATCAGAGCTTAAACTGG。 4.根据权利要求1-3任一项所述检测试剂盒 ， 其特征在于， 所述试剂盒还包含 FastStartDNAPolymerasePCRbuffer(Roche)， dNTP(Roche)， FastStartDNA Polymerase(Roche)和BSA。 5.根据权利要求1-3任一项所述检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， dNTP的浓度 为0.2mM； 每条引物的浓度为0.2mM， FastStartDNAPolymerase的浓度为1U， BSA的浓度为 0.16mg/ml。 6.一种权利要求1-3任一项所述试剂盒的检测方法。

6、， 所述检测方法仅用于个体鉴别； 具 体步骤如下： 1)取人源DNA样本， 加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增， 扩增程序如下： 95变性 5min； 94变性30s； 60退火1min； 70延伸1min； 60最后延伸60min； 共28个循环； 2)用磁珠纯化上述PCR产物， 洗脱； 3)建DNA文库并定量； 4)Miseq测序， 软件分析结果。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106222258 A 3 基于高通量测序的35个STR等位基因的检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于基因检测领域， 具体涉及一种基于高通量测序STR等位基因检测试剂 盒。 背景技术 0002 重复系列。

7、是真核基因组序列的重要组成部分， 目前作为遗传标记的序列都属于基 因组的重复区， 在众多的重复序列中,短串联重复(STR)是目前被广泛应用的遗传标记， 尤 其是在法医学领域。 STR是由2-6bp的核酸序列组成的串联重复单元组成， 其长度一般在几 十到几百的碱基之间。 STR在整个人类基因组中分布非常广泛， 平均10000个碱基就会出现 一个STR。 STR序列短， 易于扩增， 对于两个等位基因之间没有差异扩增存在， 因此适用于微 量和降解检材， 由于其在不同个体中的高度多态性， 能够有效识别不同的人类个体。 0003 传统的STR检验都是基于毛细管电泳测序技术， 目前已上市的试剂盒也是基于一。

8、 代的测序技术建立。 但利用一代测序技术进行STR测序存在其自身的局限性。 一代测序是通 过电泳后的PCR产物进行测序， 所得的序列通常只是覆盖了目标序列的1X或2X， 通过电泳的 条带和标准的标记序列进行比较确定分型的结果， 但无法解决STR内部的变异情况， 比如有 些重复单元发生了突变， 比如线粒体的异质性， 这些通过低倍的覆盖无法较准确的识别出 来。 另外， 一代测序无法对混合扩增的结果进行有效的区分， 这样无疑增加了人力是和时间 的成本， 降低了效率。 0004 由于目前新一代测序技术(NGS)已经广泛应用于基因组测序的各个领域， 基于新 一代测序技术的优势， 开发基于NGS的STR法。

9、医试剂盒将比传统的试剂盒更有优势。 发明内容 0005 本发明的一个目的是一种基于高通量测序的STR位点检测试剂盒， 该试剂盒可同 时扩增以下STR基因座， 具体为： D1S1656、 D2S1338、 D3S1358、 D4S2366、 D5S818、 D6S477、 D7S820、 D8S1179、 D9S925、 D10S1435、 D11S2368、 D12S391、 D13S325、 D14S608、 D15S659、 D16S539、 D17S1290、 D18S535、 D19S433、 D20S470、 D21S1270、 GATA198B05、 DXS101、 DXS6795。

10、、 DXS7133、 DXS981、 DXS10135、 DYS390、 DYS437、 DYS481、 DYS549、 DYS576、 DYS643和PentaD。 0006 在本发明的一个实施方案中， 所述试剂盒包含扩增基因座的引物， 具体如下： 0007 说明书 1/8 页 4 CN 106222258 A 4 0008 说明书 2/8 页 5 CN 106222258 A 5 0009 0010 在本发明的另一个实施方案中， 所述试剂盒包括1对能扩增Amelogenin的引物， 分 别为： 正向引物： ACAATGCCCTGGGCTCTGTAAAGA； 反向引物： GCCAACCATC。

11、AGAGCTTAAACTGG。 0011 在本发明的又一个实施方案中， 所述试剂盒还包含FastStartDNAPolymerase PCRbuffer(Roche)， dNTP(Roche)， FastStartDNAPolymerase(Roche)和BSA。 0012 本发明所述检测试剂盒可以检测多种人体DNA样本， 例如源于人血液、 唾液、 毛发 或精斑等DNA样本。 0013 在检测DNA样本时， 本发明试剂盒的具体扩增体系如下： 0014 组分终浓度 ddH2OTo20 l FastStartDNAPolymerasePCRbuffer(Roche)1 dNTP(Roche)0.2。

12、mM 引物混合物0.2 M FastStartDNAPolymerase(Roche)1U BSA(AMRESCO)0.16mg/ml DNA1ng 0015 本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的检测方法， 所述检测方法仅用于个体鉴 别； 具体步骤如下： 0016 1)取人源DNA样本， 加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增， 扩增程序如下： 95变 性5min； 94变性30s； 60退火1min； 70延伸1min； 60最后延伸60min； 共28个循环； 0017 2)用磁珠纯化上述PCR产物， 洗脱； 0018 3)建DNA文库并定量； 0019 4)Miseq测序， 软件分析结果。。

13、 0020 本发明提供一种利用新一代MiSeq测序技术对人类的30个STR位点进行高通量测 序的试剂盒， 包括扩增体系， 测序的读长的统计， 以及测序结果分析最终提供每个STR点的 分型结果。 目前本领域常用的多重荧光扩增检测技术， 其为在各色荧光中安置更多的基因 座， 设计引物时经常有意保留较长的侧翼序列， 导致扩增效率降低， 不利于降解检材分型。 利用二代测序技术进行STR分型， 各基因座片段长度完全可以重叠在小片段区域且互不干 说明书 3/8 页 6 CN 106222258 A 6 扰， 相当于将更多的常规STR基因座作为Mini-STR基因座使用， 对降解检材分型效果自然更 好。 附。

14、图说明 0021 图1： 实施例1检测DNA样本结果(1) 0022 图2： 实施例1检测DNA样本结果(2) 具体实施方式 0023 下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。 需要指出的是， 以下 说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明， 并非对这些技术方案的任何限制。 本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。 0024 实施例1 0025 本发明试剂盒组成： 0026 组分终浓度 ddH2OTo20 l FastStartDNAPolymerasePCRbuffer(Roche)1 dNTP(Roche)0.2mM 引物混合物0.2 M FastStartDNA。

15、Polymerase(Roche)1U BSA(AMRESCO)0.16mg/ml 0027 引物混合物组成如下： 0028 说明书 4/8 页 7 CN 106222258 A 7 0029 0030 检测方法： 说明书 5/8 页 8 CN 106222258 A 8 0031 1)取人源DNA样本1ng/ l， 加入到所述试剂盒中进行PCR混合扩增， 扩增程序如下： 95变性5min； 94变性30s； 60退火1min； 70延伸1min； 60最后延伸60min； 共28个循 环； 0032 2)用0.9SPRI磁珠纯化上述PCR产物， 20 l洗脱。 Qubit定量浓度。 0033。

16、 3)用KAPAHyperPrepKit试剂盒建库， 建库起始模板定量5ng。 0034 4)用KAPALibraryQuantificationKit文库定量。 0035 5)用MiSeq测序， 150SE10Mreads。 0036 6)Miseq测序数据统计， 采用Miseq2x150bp的pair-end双末端测序， 测序后的原 始读长序列分为正向读长和反向的读长， 通过FLASH软件将正反向的读长序列进行合并， 合 并的参数是100的相似性， 两端至少重叠10bp。 0037 数据结果如下： 原始结果一共有453,829对测序的读长， 能够合并的读长为241, 334对。 0038 。

17、7)利用STRait_razor软件对上述STR基因座的分型进行统计， 首先修改软件的配 置文件， 配置文件中包含对上述STR基因座的分型统计。 0039 所有的STR分型结果如图1和2所示； 此分型结果和所取样本本身的分型结果相同， 证明通过Miseq测序可以得到预期的结果。 0040 8)对于Amel， 通过BLAST将reads比对达到模板序列， 长度覆盖和比对的相似度都 设定与95。 0041 实施例2 0042 将实施例1制备的试剂盒对上述样本进行平行测试50次， 以考察实施例1试剂盒混 合扩增体系的稳定性以及效果。 测试表明， 在50次测试中， 混合扩增体系引物均对其目的 STR位。

18、点进行了有效扩增， 等位基因无缺失。 说明本发明涉及引物稳定有效。 0043 实施例3 0044 取10个人源唾液样本置于37条件下两周， 按照chelex-100法提取基因组DNA， 采 用实施例1试剂盒及扩增方法进行扩增并进行测序及等位基因分型。 并取同一人源血液样 本(取样后直接检测)按上述方法进行扩增， 将等位基因分型结果进行比对， 结果表明采用 本发明试剂盒可以对降解样本进行成功扩增及等位基因分型检测， 降解唾液样本与新鲜血 液样本的等位基因分型检测结果一致。 0045 另外， 本发明采用对比试剂盒进行上述检测， 结果表明与新鲜血液的等位基因分 型结果相比， 模拟降解唾液样本中的D1。

19、S1656、 D2S1338、 D8S1179、 D9S925、 GATA198B05、 DXS6795、 DXS10135、 DYS481和DYS643等位基因片段在多次测试中缺失(n5)。 对比试剂盒除 引物序列与实施例1存在不同外， 其他均同实施例1， 对比试剂盒引物序列如下： 说明书 6/8 页 9 CN 106222258 A 9 0046 说明书 7/8 页 10 CN 106222258 A 10 0047 0048 实施例4 0049 对来自一个家庭的父母和子女分别进行STR分析， 检测试剂盒和检测方法参见实 施例1； 结果表明： 上述STR位点均符合孟德尔遗传定律， RCP值。

20、均大于99.9999。 还需要说 明的是， 所检测的样本分别为唾液、 头发和指甲， 均得到了一致的分析结果。 并且每个样本 经PCR扩增和软件分析后均无影子峰出现。 0050 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案， 其中一个或更多个技 术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合， 这些经组合而得到 的技术方案也在本申请保护范围内， 就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开 内容中具体记载一样。 说明书 8/8 页 11 CN 106222258 A 11 图1 说明书附图 1/2 页 12 CN 106222258 A 12 图2 说明书附图 2/2 页 13 CN 106222258 A 13 。