技术领域
本发明涉及一株旁盾壳霉属真菌(Paraconiothyriumhawaiiense)稻米发酵物中一种二萜类化合物的制备方法和用途，该化合物具有抑制肿瘤细胞生殖生长的作用。
背景技术
肿瘤严重威胁着人类的健康，最新的统计资料显示，全世界每年新发肿瘤患者人数已达1410万，死于恶性肿瘤的人数增加至820万；我国每10万人群中肿瘤患者约280人，因肿瘤死亡人数约180人，且肿瘤的发病率呈逐年上升和年轻化的趋势。癌症正在成为人类健康的第一大杀手。虽然经过各国科学家们多年的努力，出现了一些新的抗肿瘤药物，但是至今还未出现一种彻底治愈肿瘤的药物，且对危害人类健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的恶性肿瘤如宫颈癌、乳腺癌、肺癌、肝癌及胃癌等还缺乏有效治疗药物。此外，目前出现的抗肿瘤药物的高昂价格、临床治疗中产生的耐药性及给患者带来的毒副作用等都表明，人类迫切需要研究与开发新型、高效的抗癌药物。
在特殊生境或极端环境下形成的生物资源拥有特殊的基因及其表达产物，是人类的珍贵遗传资源宝库。如近年来发挥着巨大医疗作用的抗癌物质紫杉醇、治疗心血管病洛伐他汀、抗疟疾药物青蒿素等。特殊生境真菌和植物来源中功能性活性物质的开发利用，可产生丰富的自主知识产权成果，同时孕育着巨大的产业前景与经济效益。本发明涉及的从旁盾壳霉属真菌稻米发酵物中分离制备的一种新二萜类化合物的抗肿瘤活性及其用途至今未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然二萜类化合物、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的第一方面提供式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及化合物的抗肿瘤生物活性。
本发明的第二方面提供一种制备式I所述的化合物的方法，该方法使用分类命名为旁盾壳霉属(P.hawaiiense)、名称为EC1-38的菌株制备所述化合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法包括下列步骤：
a)将旁盾壳霉属(P.hawaiiense)菌株EC1-38进行固体发酵，得到发酵培养物；
b)将步骤a)中获得的发酵培养物用合适的有机溶剂提取合适的次数，合并提取液，将所述提取液分离有机溶剂后，得到粗提物；
c)将步骤b)中获得的粗提物进行层析分离，得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离，得到所述化合物。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述的制备方法，步骤a)中，发酵使用的培养基是稻米培养基；
优选的发酵温度为20～30℃，进一步优选22～28℃，更优选25℃；
优选的发酵时间为15～25天，进一步优选18～22天，更优选20天。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述的制备方法，步骤b)中所述的提取方式为浸泡提取；
优选地，所述的提取方式是将步骤a)得到的发酵培养物在所述的有机溶液中浸泡一定的时间(优选的浸泡时间为0.5～2天，更优选的浸泡时间为1天)；
优选地，提取的次数为1～5次，进一步优选的提取次数为2～4次，更优选的提取次数为3次；
优选地，所述的有机溶剂为甲醇、丙酮或乙酸乙酯，进一步优选的有机溶剂为丙酮或乙酸乙酯，更优选的有机溶剂为乙酸乙酯；
优选地，步骤b)中分离有机溶剂的方式为蒸馏，更优选的分离方式为减压蒸馏。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述的制备方法，其中，所述的层析分离为硅胶柱层析分离和/或凝胶色谱分离，其中所述的硅胶柱层析分离优选为减压硅胶柱层析分离；
优选地，将步骤b)中获得的粗提物依次进行硅胶柱层析和凝胶色谱分离；
优选地，硅胶柱层析分离步骤中，流动相为石油醚和乙酸乙酯的混合物；进一步优选地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为90～40∶10～60；更优选地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为70～60∶30～40；更优选地，石油醚与乙酸乙酯的体积比为65∶35；
优选地，凝胶色谱分离步骤中，流动相为甲醇溶液。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述的制备方法，其中，高效液相色谱分离步骤中，流动相为乙腈水溶液；
优选地，乙腈与水的体积比为53∶47。
上述制备方法中，制备式I所示的化合物中所用的生产菌株是旁盾壳霉属(P.hawaiiense)EC1-38，该菌株分离自云南大理苍山被隔担菌侵染的盾蚧，分类命名为旁盾壳霉属(P.hawaiiense)，菌株名称为EC1-38。
本发明的第三方面提供一种药物组合物，其含有本发明第一方面提供的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的药学可接受的载体。
所述的药物组合物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述的药物组合物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
本发明的第四方面提供本发明第一方面涉及的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、或本发明第三方面涉及的药物组合物在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的用途，或在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述的真核生物为哺乳动物；
优选地，所述的肿瘤细胞为癌细胞；进一步优选地，所述的癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞或膀胱癌细胞；更优选地，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7，所述结肠癌细胞为结肠癌细胞HCT116，所述宫颈癌细胞为宫颈癌细胞HeLa，所述膀胱癌细胞为膀胱癌细胞T24。
优选地，所述的肿瘤为癌；进一步优选地，所述癌为肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌。
本发明所提供的式I所示的化合物是从微生物固体发酵提取物中首次分离得到的并命名的新化合物，同时是首次报道其抗肿瘤活性。
本发明通过构建细胞筛选模型以鉴定该化合物是否具有抑制肿瘤发生发展的作用。构建的细胞筛选模型有肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)等，采用体外细胞增殖实验MTT法筛选该化合物能够抑制何种肿瘤细胞的生殖生长，经试验发现该化合物能够较好的抑制上述肿瘤细胞的生殖生长过程，并且对该化合物呈现剂量效应即随着化合物浓度的增高对肿瘤细胞的生殖生长的抑制效果越好。
附图说明
图1为式I所示化合物的核磁共振1H-NMR谱图；
图2为式I所示化合物的核磁共振13C-NMR谱图；
图3为式I所示化合物的核磁共振HMQC谱图；
图4为式I所示化合物的核磁共振HMBC谱图；
图5为式I所示化合物圆二色谱图；
图6为式I所示化合物单晶结构投影图；
图7为肿瘤细胞对式I所示化合物的剂量效应图，肿瘤细胞包括肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)；
图8为式I所示化合物对肿瘤细胞[肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)]的IC50值；
图9为阳性对照药物顺铂(DDP)对肿瘤细胞[肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)]的IC50值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中所用的菌株P.hawaiiense分类命名为旁盾壳霉属(P.hawaiiense)，菌株名称为EC1-38。
实施例1、式I所示化合物的制备
a.菌株P.hawaiiense的固体发酵
菌株P.hawaiiense的活化。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，纯净水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养10天。
菌株P.hawaiiense的固体发酵。稻米培养基的制备(将1Kg稻米和1500mL纯净水等分加入12个500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，冷却待用)；从试管斜面上挑取菌丝体于装有无菌水的试管中配成菌悬液，将制备好的菌悬液(孢子浓度为1×106个/mL)5mL接种于稻米培养基上，在25℃无菌培养间发酵培养20天，获得发酵培养物。
b.粗提物的提取
将步骤a得到的发酵培养物用玻璃棒(0.8cm×30cm)捣碎，将2.4L乙酸乙酯加入500mL三角瓶中(共12瓶，每瓶200mL)，静置浸泡1天，用直径为12.5cm的中速定性滤纸(购自杭州特种纸业有限公司)室温常压过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液I，将残渣记作残渣I；
将2.4L乙酸乙酯加入到残渣I中(共12瓶，每瓶200mL)，静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液II，将残渣记作残渣II；
将2.4L乙酸乙酯加入到残渣II中(共12瓶，每瓶200mL)，静置浸泡1天，过滤得到有机相和残渣，将有机相记作粗提液III，将残渣记作残渣III；
合并粗提液I、粗提液II和粗提液III，记作粗提液。
将粗提液减压蒸馏至干燥，得到9.5g的粗提物。
c.粗提物的分离纯化
将上述粗提物装入减压层析硅胶柱[减压硅胶柱(40cm×8.5cm)，购自北京玻璃仪器公司；所用的硅胶为薄层层析硅胶H，购自青岛海洋化工有限公司。柱子中装130g硅胶]，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析，所用流动相为：石油醚∶乙酸乙酯(v/v)＝100∶0，99∶1，97∶3，95∶5，92∶8，90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，65∶35，60∶40，55∶45，50∶50，45∶55，40∶60，35∶65，30∶70，25∶75，20∶80，10∶90，0∶100；乙酸乙酯∶甲醇(v/v)＝100∶1，100∶2，100∶3，100∶4，100∶5，100∶10，0∶100；共计29个梯度，每个梯度的洗脱体积均为400mL，将每个梯度的洗脱液减压蒸馏，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成29个组分，在活性跟踪[测试29个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50％视为有抑制活性]指导下，发现在石油醚∶乙酸乙酯＝65∶35(v/v)作为流动相洗脱得到的组分(命名为组分1)有抑制活性，收集活性组分1(900mg)。
将活性组分1通过凝胶色谱分离，凝胶色谱柱规格为60cm×2.5cm(购自新维尔玻璃仪器公司)，所用的凝胶填料为葡聚糖凝胶SephadexLH-20(购自GEHealthcareBio-SciencesAB公司)，柱子中装60g凝胶，流动相是甲醇溶液，将组分1平均分为25个亚组分，然后在活性跟踪[测试25个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)的抑制活性，具体的测试方法如实施例3所述，抑制率大于50％视为有抑制活性]指导下，发现第16个亚组分(命名为亚组分1-16)有抑制活性，收集活性亚组分1-16(100mg)。
将活性亚组分1-16通过HPLC纯化而得到20mg式I所示化合物，其中HPLC的条件是：采用Agilent1260型半制备高压液相色谱仪，AgilentC18反相半制备色谱柱(5μm、9.4x250mm)，流速2.0mL/min，用乙腈和水作为流动相，制备条件：乙腈/水(50/50，v/v)等度洗脱10分钟后，50％至58％乙腈/水线性梯度洗脱35分钟，得到式I所示化合物，其保留时间tR＝33.20分钟。
综上，9.5g粗提物经过分离纯化而得到20mg式I所示化合物，收率为0.21％。
实施例2、式I所示化合物的结构表征
将实施例1制备的式I所示化合物进行高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)、核磁共振谱(NMR)、圆二色谱(CD)和旋光谱(ORD)分析，其中高分辨质谱由中国科学院微生物研究所质谱测试中心提供测试(测试仪器型号为AgilentAccurate-Mass-Q-TOFLC/MS6520)，红外光谱有北京大学化学学院提供测试(测试仪器型号为NicoletMagna-IR750)，核磁共振谱由中国医学科学院药物研究所国家药物及代谢产物分析研究中心提供测试(测试仪器型号为VarianMercury-400)，圆二色谱由中国医学科学院药物研究所提供测试(测试仪器型号为JASCOJ-815)，旋光谱由中国科学院微生物研究所提供测试(测试仪器型号为AutopolIV)。
经过上述测试分析，实施例1制备的式I所示化合物的理化数据为：无色针状；分子式：C20H26O4；分子量：330；高分辨质谱HRESIMS：m/z331.1904[M+H]+(计算的C20H26O4，331.1909)；氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据见表1：
表1.式I所示化合物的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据
a在400MHz以Acetone-d6为溶剂测试。
b在100MHz以Acetone-d6为溶剂测试。
通过将上述式I所示化合物的核磁共振氢谱、碳谱、质谱、旋光谱和圆二色谱(图5)，结合附图3和4中该化合物的二维核磁共振谱HMQC和HMBC谱以及附图6中单晶结构，确证化合物的化学式如式I所示：
综上所述，从真菌P.hawaiiense中提取并分离了式I所示的天然化合物，经过进一步的纯化，结合高分辨质谱、核磁共振技术和单晶数据分析鉴定该化合物的结构特征。
实施例3、式I所示化合物对肿瘤细胞生殖生长的影响
构建细胞筛选模型：肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)(上述细胞均由中国科学院微生物研究所姜学军课题组提供)。
采用MTT法(MTT比色法)检验实施例1制备的式I所示化合物对以上5种肿瘤细胞生殖生长的影响。为了验证几种肿瘤细胞对该化合物的剂量效应，将实施例1制备的式I所示化合物和阳性对照药顺铂分别用DMSO(二甲基亚砜，Dimethylsulfoxide，DMSO)作溶剂配制成浓度分别为123.76μM、61.88μM、30.94μM、15.47M、7.74μM、3.87μM、1.93μM及0.97μM的待测溶液，每种处理浓度设置三个重复。
具体实验方法如下：
1、将肿瘤细胞悬液接种至96孔板中，接种100μL(浓度1.0×105个/mL)，DMEM培养基(购自Invitrogen公司，使用前按说明书加适当体积的水配制成液体培养基灭菌待用)100μL。
2、将肿瘤细胞在37℃，5％CO2的培养箱内培养24小时，然后倾去各孔培养液，用PBS洗涤1次，实验组加入上述配制的不同浓度的式I所示化合物的待测溶液，每个浓度接种3孔，每孔加入200μL；阳性对照组加入不同浓度的顺铂溶液，每个浓度接种3孔，每孔加入200μL；阴性对照组加入200μL的液体DMEM培养液；将其置于37℃，5％CO2的培养箱内培养4小时。
3、培养结束后，用新鲜的DMEM液体培养基等体积替换式I所示化合物溶液、阳性对照药溶液以及阴性对照组的培养液，再在37℃，5％CO2的培养箱内培养48小时。
4、每孔加入50μL(浓度0.5mg/mL)的MTT(噻唑蓝)溶液处理所述的肿瘤细胞，再将其置于37℃，5％CO2的培养箱内培养3小时。
5、离心(1500r/min，5min)除去培养基和MTT溶液，每孔加入200μL的DMSO溶液，37℃下静置1小时。
6、应用酶标仪(SUNRISE-basicTECAN)测定经上述步骤培养后的混合物在570nm波长的条件下的光密度OD值，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。测定光密度OD值时，设空白组，空白组只含200μL的DMSO溶液。
本实验中的阴性对照组OD值，阳性对照组OD值和实验组OD值均为扣除掉空白组OD的值。
式I所示化合物对5种肿瘤细胞抑制作用的结果见附图7。
根据得到的式I所示化合物在各个处理浓度下的抑制率曲线图(如附图7所示)推导得到天然式I所示化合物对5个肿瘤细胞IC50值。
其中IC50表示导致50％细胞增殖抑制的药物浓度。
式I所示化合物对测试的5种肿瘤细胞的IC50值见附图8。
依据上述方法，得到阳性对照药物顺铂(DDP)对测试的5种肿瘤细胞的IC50值见附图9。
综上所述，本发明的式I所示化合物对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(HCT116)、宫颈癌细胞(HeLa)和膀胱癌细胞(T24)有明显的抑制活性。因此，本发明对研究与开发新的抗肿瘤(肺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌和膀胱癌)药物提供了候选化合物，也为开发利用微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。