一株产-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102533607 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102533607 A *CN102533607A* (21)申请号 201210012038.1 (22)申请日 2012.01.16 CCTCC NO ： M2011464 2011.12.12 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/38(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品科学与技术国家 重点实验室 (72)发明人 江波 。

2、张涛 陈真真 沐万孟 缪铭 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一株产 - 半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产 低聚半乳糖的方法 (57) 摘要 一株产 - 半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产 低聚半乳糖的方法， 属于食品生物技术领域。本 发明涉及一株从土壤中筛选而来的阿耶波多芽孢 杆菌 （Bacillusaryabhattai） SK22.003， 保藏编 号为 CCTCC NO ： M2011464。以此阿耶波多芽孢杆 菌为发酵菌株， 以乳糖为碳源、 酵母膏和蛋白胨为 氮源及无机盐组成发酵培养基， 发酵生产 - 半 乳糖苷酶， 发酵后。

3、经检测， 在发酵液中酶活达到 1-25U/mL。 将- 半乳糖苷酶添加到5%-60% 乳糖 溶液中催化合成低聚半乳糖， 转化 4-36h， 产率达 35% 以上。本发明方法生产的低聚半乳糖产品安 全可靠， 是一种很有市场潜力的功能性食品配料。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 4 页 1/2 页 2 1. 一株产 - 半乳糖苷酶的菌株， 其分类命名为阿耶波多芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai） SK 22.003， 已保藏于中国典型培养物保藏。

4、中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011464。 2. 用权利要求 1 所述的 CCTCC NO ： M 2011464 菌株发酵生产 - 半乳糖苷酶的方法， 其特征在于步骤为 ： （1） 种子培养 种子培养基 ： 乳糖 1-20g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-10g/L， pH7.0， 去离子水配制 ； 种子培养条件 ： CCTCC NO ： M 2011464 菌株于 30-37、 100-250rpm 的振荡速度下在种 子培养基中培养 10-20h 活化该菌株 ； （2） 发酵培养 发酵培养基 ： 乳糖 1-30g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1。

5、-20g/L， 氯化钙 0.11 g/L， 硫酸 锰0.001 g/L， 硫酸镁0.3 g/L， 磷酸二氢钾0.05 g/L， 硫酸铁0.03 g/L， pH7.0， 去离子水配 制 ； 发酵条件 ： 接种量 1%-10%， 在 30-37、 搅拌速度 100-700rpm、 空气流量 0.1-1.0vvm 的 条件下在发酵培养基中发酵 10-30h 生产 - 半乳糖苷酶 ； （3） 发酵后处理 发酵液经冷冻离心后收集湿菌体， 用 pH7.0 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液制成菌悬液， 然 后菌体细胞破壁提取出 - 半乳糖苷酶 ； 冷冻离心后， 收集的上清液即为粗酶液， 经检测酶 活达到 。

6、1-25 U/mL ； 或 - 半乳糖苷酶粗酶液进一步超滤浓缩， 或用硫酸铵沉淀蛋白质， 离心和冷冻干燥 得到 - 半乳糖苷酶的粗酶粉。 3. 用权利要求 2 所述方法制备的 - 半乳糖苷酶转化乳糖生产低聚半乳糖的方法， 其 特征是 ： 向底物乳糖溶液中添加 - 半乳糖苷酶进行催化转化， 转化反应条件为 ： 乳糖溶液的 乳糖质量浓度为 5%-60%， 酶对底物用量为 1-30U/g 乳糖干基计， pH5.0-8.0， 转化反应温度 为 40-55， 转化反应时间 4-36h， 产率达 35% 以上， 得到含有低聚半乳糖的酶反应液， 进一 步加工处理制备低聚半乳糖糖浆或低聚半乳糖粉末。 4. 根。

7、据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于低聚半乳糖糖浆的制备方法， 步骤为 ： （1） 脱色 在含有低聚半乳糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量 0.2%-2.0% 的活性炭， 在 50-80下温育 10-60min， 然后进行硅藻土过滤， 取脱色液 ； （2） 浓缩 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为 20%-80%， 即得低聚半乳糖糖浆。 5. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于低聚半乳糖粉末的制备方法， 步骤为 ： （1） 脱色 同制备低聚半乳糖糖浆所述的脱色步骤 ； （2） 浓缩 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为 20%-80% 的浓缩液 ； （3） 喷雾干燥 权。

8、 利 要 求 书 CN 102533607 A 2 2/2 页 3 将麦芽糊精与以固形物含量干基计的低聚半乳糖浓缩液按照重量比 1:1-1:5 的比例 混合， 控制进风温度 150-200、 出风温度 50-100， 喷雾干燥， 得到含麦芽糊精的低聚半 乳糖粉末。 权 利 要 求 书 CN 102533607 A 3 1/4 页 4 一株产 - 半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的 方法 技术领域 0001 本发明涉及能够生产-半乳糖苷酶的一种微生物菌株及其培养发酵生产-半 乳糖苷酶， 并将该酶用于生物制备低聚半乳糖的方法， 属于食品生物技术领域。更具体的 说， 本发明涉及来源于土壤的阿耶。

9、波多芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai） SK 22.003， 保藏 编号为 CCTCC NO ： M 2011464， 它能够产生 - 半乳糖苷酶， 并利用该 - 半乳糖苷酶催化 乳糖合成低聚半乳糖 （Galactooligosaccharides） 。 背景技术 0002 近年来， 功能食品成为广大消费者关注的热点， 更是广大食品从业者研发的焦点。 糖尿病、 肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化， 使得低热量、 具有更多功能营养特性 的功能性甜味剂成为关注的热点。 0003 低聚半乳糖是由半乳糖基和葡萄糖基构成的聚合度为 2 8 的低聚糖， 具有低 分子量水溶性膳食纤维。

10、的特点， 黏度低， 水溶性好， 不结合矿物质， 口感清爽， 热值较低， 甜 度为蔗糖的 20%-40% ； 对酸和热都很稳定， 在 180或 pH 3.0 条件下不分解。低聚半乳糖还 具有非致龋齿性、 非消化性、 促进肠道双岐杆菌增殖等生理功能。 0004 因此， 低聚半乳糖作为一种功能性食品添加剂广泛应用于乳制品、 糖果、 罐头等食 品。 0005 酶法合成是工业化生产低聚半乳糖的主要途径。 -半乳糖苷酶属于水解酶类， 同 时具有转移酶类性质。一方面， - 半乳糖苷酶可以催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖， 另 一方面， 还可以催化半乳糖基转移至乳糖等受体上的转移反应。 0006 酶法合成低聚半。

11、乳糖的产率受多种因素影响， 酶的来源直接影响酶法合成的低聚 半乳糖的结构和产率。 迄今为止， 已发现多种微生物可以产生此酶， 其中主要集中在米曲霉 (A. oryzae)、 黑曲霉 (A. niger) 和乳酸克鲁维酵母 (K. lactis)。 0007 本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产低聚半乳糖的方法进 行了研究， 最终我们筛选到一株能产生 - 半乳糖苷酶的新微生物， 证明了通过此酶与高 浓度的乳糖反应能得到高转化率的低聚半乳糖， 并通过浓缩干燥等手段得到低聚半乳糖的 糖浆或粉末。基于上述发现提出了本发明。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种新的微生物， 它能够生。

12、产高酶活的 - 半乳糖苷酶。 0009 本发明的另一个目的是提供一种该 - 半乳糖苷酶与高浓度乳糖溶液反应的方 法， 以得到高转化率的低聚半乳糖。 0010 本发明的再一个目的是提供一种低聚半乳糖提纯与精制的方法， 以得到高浓度的 低聚半乳糖糖浆或粉末。 0011 为了实现上述目的， 本发明提供一种来源于土壤的阿耶波多芽孢杆菌 （Bacillus 说 明 书 CN 102533607 A 4 2/4 页 5 aryabhattai） SK 22.003， 其为能够产生 - 半乳糖苷酶的菌株， 并利用该 - 半乳糖苷酶 转化乳糖生成低聚半乳糖。 0012 本发明的技术方案 ： 一株产 - 半乳糖。

13、苷酶的菌株， 其分类命名为阿耶波多芽孢 杆菌 （Bacillus aryabhattai） SK 22.003， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011464。 0013 用所述的微生物阿耶波多芽孢杆菌 CCTCC NO ： M 2011464， 发酵生产 - 半乳糖苷 酶的方法， 步骤为 ： （1） 种子培养 种子培养基 ： 乳糖 1-20g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-10g/L， pH7.0， 去离子水配制 ； 种子培养条件 ： CCTCC NO ： M 2011464 菌株于 30-37、 100-250rpm 的振荡速度下在种。

14、 子培养基中培养 10-20h 活化该菌株 ； （2） 发酵培养 发酵培养基 ： 乳糖 1-30g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-20g/L， 氯化钙 0.11g/L， 硫酸锰 0.001 g/L， 硫酸镁0.3 g/L， 磷酸二氢钾0.05 g/L， 硫酸铁0.03 g/L， pH7.0， 去离子水配制 ； 发酵条件 ： 接种量 1%-10%， 在 30-37、 搅拌速度 100-700rpm、 空气流量 0.1-1.0vvm 的 条件下在发酵培养基中发酵 10-30h 生产 - 半乳糖苷酶 ； （3） 发酵后处理 发酵液经冷冻离心后收集湿菌体， 用 pH7.0 的 0.1mo。

15、l/L 磷酸盐缓冲液制成菌悬液， 然 后菌体细胞破壁提取出 - 半乳糖苷酶 ； 冷冻离心后， 收集的上清液即为粗酶液， 经检测酶 活达到 1-25 U/mL ； 或 - 半乳糖苷酶粗酶液进一步超滤浓缩， 或用硫酸铵沉淀蛋白质， 离心和冷冻干燥 得到 - 半乳糖苷酶的粗酶粉。 0014 用制备的 - 半乳糖苷酶转化乳糖生产低聚半乳糖的方法， 向底物乳糖溶液中添 加 - 半乳糖苷酶进行催化转化， 转化反应条件为 ： 乳糖溶液的乳糖质量浓度为 5%-60%， 酶对底物用量为 1-30U/g 乳糖干基计， pH5.0-8.0， 转化反应温度为 40-55， 转化反应时间 4-36h， 产率可达 35%。

16、 以上， 得到含有低聚半乳糖的酶反应液， 进一步加工处理制备低聚半 乳糖糖浆或低聚半乳糖粉末。 0015 低聚半乳糖糖浆的制备方法， 步骤为 ： （1） 脱色 在含有低聚半乳糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量 0.2%-2.0% 的活性炭， 在 50-80下温育 10-60min， 然后进行硅藻土过滤， 取脱色液 ； （2） 浓缩 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为 20%-80%， 即得低聚半乳糖糖浆。 0016 低聚半乳糖粉末的制备方法， 步骤为 ： （1） 脱色 同制备低聚半乳糖糖浆所述的脱色步骤 ； （2） 浓缩 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为 20%-80% 的浓缩。

17、液 ； （3） 喷雾干燥 说 明 书 CN 102533607 A 5 3/4 页 6 将麦芽糊精与以固形物含量干基计的低聚半乳糖浓缩液按照重量比 1:1-1:5 的比例 混合， 控制进风温度 150-200、 出风温度为 50-100， 喷雾干燥， 得到含麦芽糊精的低聚 半乳糖粉末。 0017 本发明的有益效果 ： 本发明涉及一株从土壤中筛选而来的阿耶波多芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai） SK 22.003， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC M 2011464。以此菌为发酵菌株， 以乳糖为碳源、 酵母膏和蛋白胨为氮源及无机盐等 组成发酵培养基，。

18、 发酵生产 - 半乳糖苷酶， 发酵后经检测， 在发酵液中酶活达到 1-25 U/ mL。将 - 半乳糖苷酶添加到 5%-60% 乳糖溶液中催化合成低聚半乳糖， 转化 4-36 h， 产率 达 35% 以上。本发明方法生产的低聚半乳糖产品安全可靠， 是一种很有市场潜力的功能性 甜味剂。 0018 生物材料样品保藏 ： 一株用于微生物转化发酵生产 - 半乳糖苷酶的菌株， 其分 类命名为阿耶波多芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai） SK 22.003， 已保藏于中国典型培养 物保藏中心， 简称 CCTCC， 地址 ： 中国武汉武汉大学， 保藏编号为 CCTCC M 2011464，。

19、 保藏日 期 2011 年 12 月 12 日。 具体实施方式 0019 以下是阿耶波多芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai） SK 22.003 进行发酵生产 - 半乳糖苷酶及酶法转化生产低聚半乳糖的实施例， 但本发明并不限于所列出的几个实 例。 0020 实施例 1 - 半乳糖苷酶粗酶液的制备 将菌株 SK 22.003 经种子培养活化后， 在含乳糖 1-30g/L， 酵母膏 1-20g/L， 蛋白胨 1-20g/L， 氯化钙0.11 g/L， 硫酸锰0.001 g/L， 硫酸镁0.3 g/L， 磷酸二氢钾0.05 g/L， 硫酸 铁 0.03 g/L， pH7.0 的培养。

20、基中， 接种量 1%-10%， 在 37， 200rpm、 空气流量 0.1-1.0vvm 的 条件下培养24h， 之后冷冻离心得湿菌体， 再将菌体用pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液重悬 后超声破碎， 冷冻离心收集上清液即得 - 半乳糖苷酶粗酶液。 0021 实施例 2 酶法转化乳糖生成低聚半乳糖 向质量浓度40%乳糖溶液中添加-半乳糖苷酶催化转化， 转化条件为 ： 底物乳糖质量 浓度为 40%， 酶对底物用量为 1-30U/g 乳糖干基计， pH7.0， 转化反应温度为 45， 转化反应 时间 24h， 通过高效液相色谱测得酶反应液中含 35% 低聚半乳糖。 0022 实施例 3 低。

21、聚半乳糖糖浆的制备 （1） 脱色 在含有低聚半乳糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量 0.2%-2.0% 的活性炭， 在 80下温育 30min， 然后进行硅藻土过滤， 取脱色液 ； （2） 浓缩 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为 20%-80%， 即得低聚半乳糖糖浆。 0023 实施例 4 低聚半乳糖粉末的制备 （1） 脱色 同制备低聚半乳糖糖浆所述的脱色步骤 ； （2） 浓缩 说 明 书 CN 102533607 A 6 4/4 页 7 将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为 20%-80% 的浓缩液 ； （3） 喷雾干燥 将麦芽糊精与以固形物含量干基计的低聚半乳糖浓缩液按照重量比 1:1-1:5 的比例 混合， 控制进风温度 150-200、 出风温度为 50-100， 喷雾干燥， 得到含麦芽糊精的低聚 半乳糖粉末。 说 明 书 CN 102533607 A 7 。