技术领域
本发明属于寡糖制备技术领域，具体涉及一种均一性褐藻寡糖的制备方法。
背景技术
褐藻寡糖具有抗氧化、免疫调节等多种不同的生物学活性，且寡糖存在分子量小，容易被吸收利用的优势，因此在药物制剂、功能食品、化工等多个领域具有广阔的应用前景。褐藻寡糖本身没有细胞毒性，它通过提高机体免疫力而增强机体对肿瘤细胞的防御能力。研究表明，褐藻寡糖可以抑制人白血病细胞的生长，细胞核形态学上的变化表现为典型的细胞凋亡；褐藻寡糖具有抗氧化作用。研究表明，褐藻胶寡糖对O2-，·OH和ClO·等自由基均有较好的清除作用，而且清除活性受到褐藻寡糖的浓度及分子量的影响。研究发现褐藻寡糖显示出对ABTS，羟基和超氧自由基的清除活性。自由基清除活性主要源于在酶解过程中形成的共轭烯酸结构的存在。褐藻寡糖通过诱导细胞因子的产生，调节血糖和脂质。由于褐藻寡糖的多种生物学活性，因此迫切需要建立绿色高效的均一性褐藻寡糖制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种均一性褐藻寡糖的制备方法，从而制备出均一性褐藻寡糖，从而弥补现有技术的不足。
本发明的方法，是用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶酶和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的褐藻胶酶来降解褐藻胶；
所述的方法，是一种方式是将两种褐藻胶酶同时来降解褐藻胶；
所述的方法，其另一种方式是先用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶来降解褐藻胶，再用氨基酸序列为SEQ ID NO:2的褐藻胶酶来降解褐藻胶；
所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:2的褐藻胶酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
本发明的方法基于酶解法制备褐藻寡糖，具有清洁，环保的优势此外，由于酶具有特异性，其反应的副产物少；更为重要的是本发明采用的是复合物酶法，产物更单一(仅有两种组分)，有利于后续的均一性寡糖的制备。
附图说明
图1：重组酶的分离纯化图，其中Lane 1.AlyB-OU02；Lane2.AlyD-OU02；
图2：复合酶对褐藻胶的降解图，其中A:复合酶；B:依次加入AlyB-OU02与AlyD-OU02；图2-A:1：未加酶对照；2：只加AlyB-OU02；3：只加AlyD-OU02；4：加AlyB-OU02与AlyD-OU02复合酶；图2-B：1：加入AlyB-OU02反应2h后；2：加入AlyD-OU02反应2h；
具体实施方式
申请人在长期的研究中发现，通过将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的褐藻胶酶和氨基酸序列为SEQ ID NO:2的褐藻胶酶来降解褐藻胶；能有效的克服已有方法制备的寡糖不均一的问题，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：酶的重组表达
1、基因组DNA的提取：
将目标菌种OU02接种于LB液体培养基，在25℃、150rpm振荡培养箱中培养7小时左右，取1.5mL菌液，在4℃、12,000×g离心1min，弃去上清液，再加入菌液重复离心3次，收集菌体。然后使用基因组DNA试剂盒提取DNA。(基因组DNA试剂盒：TIANGEN BIOTECH)提取步骤如下：
1)在菌体中加入200μL缓冲液GA，振荡使菌体悬浮，加入4μLRNaseA(100mg/mL)溶液除RNA，涡旋振荡15s，室温静置5min。
2)向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
3)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变透亮，点动离心以去除管内壁的水珠。
4)加入220μL无水乙醇，涡旋振荡15s，此时应该会出现絮状沉淀，点动离心。
5)将上一步所得混合物均加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
6)加入500μl缓冲液GD(已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
7)加入700μl漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
8)加入500μl漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12,000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
9)12,000g离心2min，倒掉废液。室温静置数分钟，晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000×g离心2min，收到的液体即为提取的细菌基因组DNA，将管内溶液重复洗脱吸附膜，可提高回收率，将提取的细菌基因组DNA于-20℃保存。
2、从产高活性褐藻胶裂解酶的微生物的基因组中，克隆褐藻胶裂解酶基因AlyB-OU02和AlyD-OU02，设计引物如下：
AlyB-OU02-BamHI-F:CGGGATCCGACTTCCCTAACAACAAAGAAACG
AlyB-OU02-XhoI-R:CCGCTCGAGCTACTTTTTGTATTGATCGTGCG
AlyD-OU02-BamHI-F:CGGGATCCAATAACGGTGTGTCTTATCCAG
AlyD-OU02-XhoI-R:CGCTCGAGCTACTTGCCGTTCAGCTTAAGTG
3、进行目的基因AlyB-OU02和AlyD-OU02的PCR扩增：
以菌株的总基因组DNA为模版，PCR反应体系如下：5×PrimeSTAR Buffer 10μL，2.5mMdNTP Mixture 4μL，10μM正反向引物各1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μL，DNA模版1μL，灭菌超纯水补足50μL。
PCR条件如下：预变性94℃3min；变性94℃30s；退火50℃30s；延伸72℃2min，5个循环；变性94℃30s；退火58℃30s；延伸72℃2min，30个循环；延伸72℃10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳验证，电压90V，25min，AlyB-OU02和AlyD-OU02分别在1500bp、975bp左右出现目的条带，并用购自OMEGA BIO-TEK的Gel Extraction Kit切胶回收PCR产物。胶回收步骤如下：
1)用干净的刀片切下含有目的条带的胶，尽量切除多余的胶。
2)将切下的胶放入灭菌的1.5mL离心管中，并称重。按胶浓度1g/mL，加入等体积的溶胶液(XP2)，即0.3g的胶加0.3mL溶胶液。
3)50-60℃孵育7min直到胶完全溶解，每2-3min振荡离心管加速溶胶。
4)把HiBind DNA MiNi吸附柱放入2mL收集管中。
5)第3步得到的DNA/琼脂糖溶液，取不超过700μl加入吸附柱。
6)室温10,000×g离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
7)重复5-6步骤，直到所有的溶胶液转入吸附柱。
8)加入300μl XP2，室温最大转速(≥13,000×g)离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
9)加入700μL SPW漂洗液(加入无水乙醇)，室温最大转速(≥13,000×g)离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
10)重复步骤9。
11)空吸附柱，室温最大转速(≥13,000×g)离心2min，干燥吸附柱基质。
12)把吸附柱放入1.5mL灭菌的离心管中，取15-30μL洗脱缓冲液悬空滴加到吸附柱膜的中心。
13)室温静置2min，最大转速(≥13,000×g)离心1min，重复洗脱提高DNA回收率。
14)将回收的PCR产物再次进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，保存于-20℃。
4、酶切质粒与模板：
将表达质粒pGEX6P-1与PCR回收产物用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ分别进行双酶切，酶切体系为：DNA模板20μL，10×K Buffer 6μL，BamHⅠ、EcoRⅠ各3μL，灭菌超纯水补足60μL，30℃酶切5h。并用购自OMEGA BIO-TEK的Cycle-Pure Kit回收酶切产物。纯化步骤如下：
1)在酶切反应体系中加入4-5倍体积的CP缓冲液，涡旋振荡使溶液充分混匀，简短离心以收集管盖和管壁上的水珠。
2)把HiBind DNA MiNi吸附柱放入2mL收集管中。
3)把第一步的溶液加入吸附柱，室温最大转速(≥13,000×g)离心1min，取收集管中的液体加入吸附柱中，重复吸附，提高产物回收率，室温最大转速(≥13,000×g)离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
4)加入700μL DNA漂洗液(加入无水乙醇)，室温最大转速(≥13,000×g)离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
5)重复步骤4。
6)空吸附柱，室温最大转速(≥13,000×g)离心2min，干燥吸附柱基质。
7)把吸附柱放入灭菌的1.5mL离心管中，取30-50μL洗脱缓冲液悬空滴加到吸附柱膜的中心。
8)室温静置2min，室温最大转速(≥13,000×g)离心1min，重复洗脱提高DNA回收率。
14)将回收的酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，保存于-20℃。
5、目的基因与表达载体连接：
酶切后的质粒(pGEX6P-1)与目的基因片段(AlyB-OU02、AlyD-OU02)在T4DNA连接酶作用下过夜连接，连接体系为：T4DNA连接酶1μL，10×Buffer 1μL，目的基因片段与质粒按质量比10:1，灭菌超纯水补足10μL，16℃连接过夜。
6、转化：
将感受态细胞BL21(DE3)从-80℃冰箱中取出，迅速放入冰中。待细胞完全融化后，在无菌条件下将连接产物缓慢加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。迅速放置42℃水浴热激75s。快速将离心管放入冰中，冰浴2min。无菌条件下向混合液中加入500μL LB液体培养基，37℃振荡培养1h，使菌体复苏。无菌条件下，取200μL菌液均匀地涂布于含Amp+抗性的LB固体培养基上，待液体完全吸收后倒置放入恒温培养箱，37℃培养至培养基表面有菌落生成。
7、菌液PCR鉴定阳性克隆
随机挑取单克隆菌落，测序分析，并于-80℃保存菌液。其中褐藻胶酶AlyB-OU02，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1,编码核苷酸序列为SEE ID NO:3。酶AlyD-OU02，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2,编码核苷酸序列为SEE ID NO:4。具体序列信息如下：
其中AlyB-OU02的氨基酸序列如下：
DFPNNKETGEALLTPVDATASSHDGNGPDRLIDQDLTTRWSSAGDGEWAMLDYGSVQEFDAVQASFSKGNERQSKFDIQVSVDGETWTTVLENQLSSGKAIGLERFQFEPAVKARYVRYVGHGNTKNGWNSVTGLAAVNCSINACPASQIITSDVVAAEAVLIAEMKAAEKARKAARKDLRSGNFGVAAVYPCETSVKCDTRSALPVPTGLPATPVAGNAPSENFDMTHWYLSQPFDHDKNGKPDDVSEWNLANGYQHPEIFYTADDGGLVFKSYVKGVRTSKNTKYARTELREMMRRGDQSISTKGVNKNNWVFSSAPEADLEAAAGIDGVLEATLKIDHATTTGNANEVGRFIIGQIHDQNDEPIRLYYRKLPNQPTGAVYFAHESQDATKEDFYPLVGDMTAEVGEDGIALGEVFSYRIDVKGNTMTVTLMREGKDDVVQVVDMSNSGYDVGGKYMYFKAGVYNQNISGDLDDYSQATFYQLDVSHDQYKK；
其编码基因的核苷酸序列如下：
GACTTCCCTAACAACAAAGAAACGGGTGAAGCACTTCTTACTCCGGTTGATGCTACCGCTAGCAGCCACGATGGAAATGGCCCAGATCGCCTCATTGACCAAGACCTAACAACACGTTGGTCGTCAGCGGGTGACGGTGAGTGGGCAATGCTAGATTATGGTTCAGTACAAGAGTTTGACGCTGTTCAAGCATCCTTCAGTAAAGGTAATGAGCGCCAATCTAAATTTGATATTCAAGTGAGTGTCGATGGTGAAACCTGGACGACGGTACTTGAGAACCAACTCAGTTCTGGTAAAGCTATCGGCCTAGAGCGTTTCCAATTTGAGCCTGCGGTGAAAGCACGTTACGTAAGATATGTTGGTCACGGCAACACCAAAAACGGTTGGAACAGTGTGACTGGGTTAGCAGCGGTTAACTGTAGCATCAACGCTTGTCCAGCGAGTCAAATCATCACTTCAGACGTGGTGGCTGCAGAAGCGGTGCTTATTGCTGAAATGAAAGCAGCGGAAAAAGCGCGTAAAGCAGCACGCAAAGATCTACGCTCAGGTAACTTCGGCGTAGCAGCAGTTTACCCTTGTGAGACTTCAGTTAAATGTGACACTCGCAGCGCGCTACCTGTTCCGACAGGCCTACCAGCGACACCCGTTGCCGGTAATGCACCGAGCGAAAACTTCGACATGACTCACTGGTACCTGTCTCAACCATTCGACCATGACAAAAACGGTAAGCCAGATGATGTATCCGAGTGGAACCTTGCAAACGGGTATCAACACCCAGAAATCTTCTATACCGCGGACGACGGTGGTCTAGTGTTCAAGTCTTACGTGAAAGGTGTACGTACATCTAAAAACACTAAGTACGCGCGTACCGAGCTTCGTGAGATGATGCGTCGTGGTGACCAGTCTATCAGTACGAAAGGTGTTAATAAGAACAACTGGGTATTCTCAAGCGCACCTGAAGCTGATTTAGAAGCTGCGGCTGGTATCGATGGCGTTCTAGAAGCAACATTGAAAATCGATCATGCGACAACAACGGGTAATGCGAATGAAGTAGGTCGCTTTATCATTGGTCAGATTCACGATCAAAACGATGAGCCGATTCGTTTGTACTACCGTAAACTGCCAAACCAACCAACGGGCGCAGTTTACTTTGCACACGAAAGCCAAGACGCGACCAAAGAGGACTTCTATCCTCTAGTGGGAGACATGACGGCTGAAGTAGGTGAAGATGGTATCGCACTTGGTGAAGTGTTCAGCTACCGTATTGACGTTAAAGGCAACACGATGACGGTAACGCTAATGCGTGAAGGCAAAGACGATGTTGTACAAGTGGTTGATATGAGCAACAGCGGCTATGACGTTGGCGGCAAGTACATGTATTTCAAAGCGGGTGTTTACAACCAAAATATCAGCGGCGACCTAGACGATTACTCACAAGCTACTTTCTACCAGCTAGACGTATCGCACGATCAATACAAAAAGTAG；
AlyD-OU02酶的氨基酸序列如下：
PVPADKFDMRNWKITIPSDINEDGRVDEIEGVAMMSYSHSDFFHLDKDGNLVFEVQNQAITTKNSKNARSELRQMPRGADFSIDTADKGNQWALSSHPAASEYSAVGGTLEATLKVNHVSINAKYPQRYPAHSVVVGQIHAKKHDALIKAKTGYGHGNEPLKIFYKKFPDQEMGSVFWNYERNLEKKDPNRADIAYPVWGNTWENPAEPGEAGIALGEEFSYKVEVKGTMMYLTFETARHDTVKYEVDLSKGIDELDSPTGYAEDDFYYKAGAYGQCSVSDSHPVWGPGCAGTGDFAVDKKNGDYNSVTFSALKLNGK；
编码基因的核苷酸序列如下：
CCAGTTCCCGCTGATAAGTTTGATATGCGAAATTGGAAAATAACGATCCCTTCAGATATTAATGAAGATGGACGTGTTGACGAAATCGAAGGGGTGGCAATGATGAGCTACTCACACAGCGATTTCTTCCACCTTGATAAAGACGGTAATCTCGTCTTTGAAGTACAAAACCAAGCGATTACCACGAAGAACTCGAAAAACGCACGCTCTGAGTTACGCCAGATGCCACGAGGTGCTGATTTCTCAATCGATACGGCGGACAAAGGAAACCAGTGGGCACTATCGAGCCACCCAGCAGCGAGTGAATACAGTGCGGTTGGTGGAACGCTAGAAGCGACGCTAAAGGTGAATCACGTTTCGATTAACGCTAAGTACCCACAAAGATACCCAGCTCACTCGGTAGTTGTTGGCCAGATACACGCGAAGAAACACGATGCTTTGATCAAAGCAAAAACAGGTTACGGCCACGGTAACGAACCACTAAAAATCTTCTATAAGAAATTTCCTGATCAAGAGATGGGTTCAGTCTTTTGGAACTATGAACGCAACTTAGAGAAGAAAGATCCTAACCGTGCTGATATTGCTTACCCAGTTTGGGGCAATACTTGGGAAAACCCAGCAGAGCCTGGTGAAGCGGGAATTGCTCTAGGTGAAGAGTTCAGCTACAAAGTGGAAGTGAAGGGTACAATGATGTATCTAACATTTGAAACGGCTCGCCACGATACCGTTAAGTATGAAGTCGACTTGAGCAAGGGCATCGATGAACTTGATTCGCCAACAGGCTATGCGGAAGATGACTTTTACTATAAAGCGGGTGCGTACGGTCAATGCAGTGTAAGCGACTCTCACCCAGTGTGGGGCCCGGGTTGTGCGGGTACTGGCGATTTCGCTGTCGATAAAAAGAACGGCGATTACAATAGTGTGACTTTCTCAGCACTTAAGCTGAACGGCAAGTAG。
二、重组酶的制备
1)pGEX-6P-1菌体，60ml PBS重悬菌体并超声破碎(30min)，20,000g离心20min。
2)上清与2ml平衡后的GST beads(GE)在4℃结合2h，重力作用下流出；
3)400ml PBS缓冲液冲洗未结合蛋白；
4)加入2ml的PBS缓冲液，并按质量比50:1加入PreScission酶，4℃静置酶切(每15min轻吹混匀一次)。
5)酶切2h后流出，流出进行SDS-PAGE检测(图1)：
实施例2：基于复合酶的高均一性褐藻寡糖的制备
方法1)复合酶法：用重组表达的AlyB-OU02和AlyD-OU02褐藻胶裂解酶进行褐藻胶降解，底物为0.2％褐藻胶(m/v)200μL，酶AlyB-OU02(1.58μM)和AlyD-OU02(约13.9μM)各20μL。
设置三组反应，即：AlyB-OU02、AlyD-OU02分别单独降解褐藻胶以及AlyB-OU02和AlyD-OU02相互配合共同降解褐藻胶。总反应体系为220μL，缓冲液为50mMTris-HCl 200mMNaCl pH7.5，室温(约30℃)静置反应90min，反应结束后12000rpm离心3min，取上清通过TLC法对降解产物进行分析。
方法2)先后加入法：用重组表达的AlyB-OU02和AlyD-OU02褐藻胶裂解酶进行褐藻胶降解，底物为0.2％褐藻胶(m/v)200μL，酶AlyB-OU02(1.58μM)和AlyD-OU02(约13.9μM)各20μL。设置一组反应，即先用AlyB-OU02降解褐藻胶，缓冲液为50mMTris-HCl 200mMNaCl pH7.5，室温(约30℃)静置反应90min，之后加入AlyD-OU02继续反应90min。反应结束后，12000rpm离心3min，取上清通过TLC法对降解产物进行分析。
分别取2μL降解后的溶液和对照组溶液点样于硅胶板上(Silica gel 60F 254，Merck)。吹干后将硅胶板置于展开剂中开始层析，展开剂按以下比例配置：正丁醇/甲酸/水(v/v)＝4:6:1。层析结束后，取出硅胶板并吹干，在硅胶板上喷洒显色剂(苯胺-二苯胺显色剂)，吹干，再将硅胶板置于高温条件下显色，直至出现明显的斑点。(图2)。如图2-A泳道2及图2-B泳道1所示，仅用酶AlyB-OU02降解褐藻胶，产物主要有4个组份。AlyB-OU02降解后的样品进行质谱检测，确定样品的分子量。仪器型号为Q Exactive Focus。经过质谱鉴定，AlyB-OU02降解后的样品(图2-A，泳道1)主要为：DP1:175Da；DP2:351Da；DP3:527Da；DP4:703Da。
在利用复合酶AlyD-OU02或者在AlyB-OU02降解后，通过后续补加AlyD-OU02，产物如图2-A泳道4及图2-B泳道2所示，结果表明复合酶解可以有效降解其中两个组分(后续质谱鉴定为DP3和DP4),降解后产物主要为DP1与DP2。结果说明AlyD-OU02的加入提高了产物的均一性。
酶解产物的回收的步骤如下：
反应结束后，将反应体系置于100℃，水浴10min，灭活酶终止反应。4℃，12 000g离心20min，收集上清，冷冻干燥获得寡糖。称重计算得到的寡糖的回收率在85％左右。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国海洋大学
<120> 一种均一性褐藻寡糖的制备方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 494
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Asp Phe Pro Asn Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ala Leu Leu Thr Pro Val
1 5 10 15
Asp Ala Thr Ala Ser Ser His Asp Gly Asn Gly Pro Asp Arg Leu Ile
20 25 30
Asp Gln Asp Leu Thr Thr Arg Trp Ser Ser Ala Gly Asp Gly Glu Trp
35 40 45
Ala Met Leu Asp Tyr Gly Ser Val Gln Glu Phe Asp Ala Val Gln Ala
50 55 60
Ser Phe Ser Lys Gly Asn Glu Arg Gln Ser Lys Phe Asp Ile Gln Val
65 70 75 80
Ser Val Asp Gly Glu Thr Trp Thr Thr Val Leu Glu Asn Gln Leu Ser
85 90 95
Ser Gly Lys Ala Ile Gly Leu Glu Arg Phe Gln Phe Glu Pro Ala Val
100 105 110
Lys Ala Arg Tyr Val Arg Tyr Val Gly His Gly Asn Thr Lys Asn Gly
115 120 125
Trp Asn Ser Val Thr Gly Leu Ala Ala Val Asn Cys Ser Ile Asn Ala
130 135 140
Cys Pro Ala Ser Gln Ile Ile Thr Ser Asp Val Val Ala Ala Glu Ala
145 150 155 160
Val Leu Ile Ala Glu Met Lys Ala Ala Glu Lys Ala Arg Lys Ala Ala
165 170 175
Arg Lys Asp Leu Arg Ser Gly Asn Phe Gly Val Ala Ala Val Tyr Pro
180 185 190
Cys Glu Thr Ser Val Lys Cys Asp Thr Arg Ser Ala Leu Pro Val Pro
195 200 205
Thr Gly Leu Pro Ala Thr Pro Val Ala Gly Asn Ala Pro Ser Glu Asn
210 215 220
Phe Asp Met Thr His Trp Tyr Leu Ser Gln Pro Phe Asp His Asp Lys
225 230 235 240
Asn Gly Lys Pro Asp Asp Val Ser Glu Trp Asn Leu Ala Asn Gly Tyr
245 250 255
Gln His Pro Glu Ile Phe Tyr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Leu Val Phe
260 265 270
Lys Ser Tyr Val Lys Gly Val Arg Thr Ser Lys Asn Thr Lys Tyr Ala
275 280 285
Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Met Arg Arg Gly Asp Gln Ser Ile Ser
290 295 300
Thr Lys Gly Val Asn Lys Asn Asn Trp Val Phe Ser Ser Ala Pro Glu
305 310 315 320
Ala Asp Leu Glu Ala Ala Ala Gly Ile Asp Gly Val Leu Glu Ala Thr
325 330 335
Leu Lys Ile Asp His Ala Thr Thr Thr Gly Asn Ala Asn Glu Val Gly
340 345 350
Arg Phe Ile Ile Gly Gln Ile His Asp Gln Asn Asp Glu Pro Ile Arg
355 360 365
Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Asn Gln Pro Thr Gly Ala Val Tyr Phe
370 375 380
Ala His Glu Ser Gln Asp Ala Thr Lys Glu Asp Phe Tyr Pro Leu Val
385 390 395 400
Gly Asp Met Thr Ala Glu Val Gly Glu Asp Gly Ile Ala Leu Gly Glu
405 410 415
Val Phe Ser Tyr Arg Ile Asp Val Lys Gly Asn Thr Met Thr Val Thr
420 425 430
Leu Met Arg Glu Gly Lys Asp Asp Val Val Gln Val Val Asp Met Ser
435 440 445
Asn Ser Gly Tyr Asp Val Gly Gly Lys Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly
450 455 460
Val Tyr Asn Gln Asn Ile Ser Gly Asp Leu Asp Asp Tyr Ser Gln Ala
465 470 475 480
Thr Phe Tyr Gln Leu Asp Val Ser His Asp Gln Tyr Lys Lys
485 490
<210> 2
<211> 318
<212> PRT
<213> 2
<400> 2
Pro Val Pro Ala Asp Lys Phe Asp Met Arg Asn Trp Lys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Pro Ser Asp Ile Asn Glu Asp Gly Arg Val Asp Glu Ile Glu Gly Val
20 25 30
Ala Met Met Ser Tyr Ser His Ser Asp Phe Phe His Leu Asp Lys Asp
35 40 45
Gly Asn Leu Val Phe Glu Val Gln Asn Gln Ala Ile Thr Thr Lys Asn
50 55 60
Ser Lys Asn Ala Arg Ser Glu Leu Arg Gln Met Pro Arg Gly Ala Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ile Asp Thr Ala Asp Lys Gly Asn Gln Trp Ala Leu Ser Ser
85 90 95
His Pro Ala Ala Ser Glu Tyr Ser Ala Val Gly Gly Thr Leu Glu Ala
100 105 110
Thr Leu Lys Val Asn His Val Ser Ile Asn Ala Lys Tyr Pro Gln Arg
115 120 125
Tyr Pro Ala His Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala Lys Lys His
130 135 140
Asp Ala Leu Ile Lys Ala Lys Thr Gly Tyr Gly His Gly Asn Glu Pro
145 150 155 160
Leu Lys Ile Phe Tyr Lys Lys Phe Pro Asp Gln Glu Met Gly Ser Val
165 170 175
Phe Trp Asn Tyr Glu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Asp Pro Asn Arg Ala
180 185 190
Asp Ile Ala Tyr Pro Val Trp Gly Asn Thr Trp Glu Asn Pro Ala Glu
195 200 205
Pro Gly Glu Ala Gly Ile Ala Leu Gly Glu Glu Phe Ser Tyr Lys Val
210 215 220
Glu Val Lys Gly Thr Met Met Tyr Leu Thr Phe Glu Thr Ala Arg His
225 230 235 240
Asp Thr Val Lys Tyr Glu Val Asp Leu Ser Lys Gly Ile Asp Glu Leu
245 250 255
Asp Ser Pro Thr Gly Tyr Ala Glu Asp Asp Phe Tyr Tyr Lys Ala Gly
260 265 270
Ala Tyr Gly Gln Cys Ser Val Ser Asp Ser His Pro Val Trp Gly Pro
275 280 285
Gly Cys Ala Gly Thr Gly Asp Phe Ala Val Asp Lys Lys Asn Gly Asp
290 295 300
Tyr Asn Ser Val Thr Phe Ser Ala Leu Lys Leu Asn Gly Lys
305 310 315
<210> 3
<211> 1485
<212> DNA
<213> 3
<400> 3
gacttcccta acaacaaaga aacgggtgaa gcacttctta ctccggttga tgctaccgct 60
agcagccacg atggaaatgg cccagatcgc ctcattgacc aagacctaac aacacgttgg 120
tcgtcagcgg gtgacggtga gtgggcaatg ctagattatg gttcagtaca agagtttgac 180
gctgttcaag catccttcag taaaggtaat gagcgccaat ctaaatttga tattcaagtg 240
agtgtcgatg gtgaaacctg gacgacggta cttgagaacc aactcagttc tggtaaagct 300
atcggcctag agcgtttcca atttgagcct gcggtgaaag cacgttacgt aagatatgtt 360
ggtcacggca acaccaaaaa cggttggaac agtgtgactg ggttagcagc ggttaactgt 420
agcatcaacg cttgtccagc gagtcaaatc atcacttcag acgtggtggc tgcagaagcg 480
gtgcttattg ctgaaatgaa agcagcggaa aaagcgcgta aagcagcacg caaagatcta 540
cgctcaggta acttcggcgt agcagcagtt tacccttgtg agacttcagt taaatgtgac 600
actcgcagcg cgctacctgt tccgacaggc ctaccagcga cacccgttgc cggtaatgca 660
ccgagcgaaa acttcgacat gactcactgg tacctgtctc aaccattcga ccatgacaaa 720
aacggtaagc cagatgatgt atccgagtgg aaccttgcaa acgggtatca acacccagaa 780
atcttctata ccgcggacga cggtggtcta gtgttcaagt cttacgtgaa aggtgtacgt 840
acatctaaaa acactaagta cgcgcgtacc gagcttcgtg agatgatgcg tcgtggtgac 900
cagtctatca gtacgaaagg tgttaataag aacaactggg tattctcaag cgcacctgaa 960
gctgatttag aagctgcggc tggtatcgat ggcgttctag aagcaacatt gaaaatcgat 1020
catgcgacaa caacgggtaa tgcgaatgaa gtaggtcgct ttatcattgg tcagattcac 1080
gatcaaaacg atgagccgat tcgtttgtac taccgtaaac tgccaaacca accaacgggc 1140
gcagtttact ttgcacacga aagccaagac gcgaccaaag aggacttcta tcctctagtg 1200
ggagacatga cggctgaagt aggtgaagat ggtatcgcac ttggtgaagt gttcagctac 1260
cgtattgacg ttaaaggcaa cacgatgacg gtaacgctaa tgcgtgaagg caaagacgat 1320
gttgtacaag tggttgatat gagcaacagc ggctatgacg ttggcggcaa gtacatgtat 1380
ttcaaagcgg gtgtttacaa ccaaaatatc agcggcgacc tagacgatta ctcacaagct 1440
actttctacc agctagacgt atcgcacgat caatacaaaa agtag 1485
<210> 4
<211> 957
<212> DNA
<213> 4
<400> 4
ccagttcccg ctgataagtt tgatatgcga aattggaaaa taacgatccc ttcagatatt 60
aatgaagatg gacgtgttga cgaaatcgaa ggggtggcaa tgatgagcta ctcacacagc 120
gatttcttcc accttgataa agacggtaat ctcgtctttg aagtacaaaa ccaagcgatt 180
accacgaaga actcgaaaaa cgcacgctct gagttacgcc agatgccacg aggtgctgat 240
ttctcaatcg atacggcgga caaaggaaac cagtgggcac tatcgagcca cccagcagcg 300
agtgaataca gtgcggttgg tggaacgcta gaagcgacgc taaaggtgaa tcacgtttcg 360
attaacgcta agtacccaca aagataccca gctcactcgg tagttgttgg ccagatacac 420
gcgaagaaac acgatgcttt gatcaaagca aaaacaggtt acggccacgg taacgaacca 480
ctaaaaatct tctataagaa atttcctgat caagagatgg gttcagtctt ttggaactat 540
gaacgcaact tagagaagaa agatcctaac cgtgctgata ttgcttaccc agtttggggc 600
aatacttggg aaaacccagc agagcctggt gaagcgggaa ttgctctagg tgaagagttc 660
agctacaaag tggaagtgaa gggtacaatg atgtatctaa catttgaaac ggctcgccac 720
gataccgtta agtatgaagt cgacttgagc aagggcatcg atgaacttga ttcgccaaca 780
ggctatgcgg aagatgactt ttactataaa gcgggtgcgt acggtcaatg cagtgtaagc 840
gactctcacc cagtgtgggg cccgggttgt gcgggtactg gcgatttcgc tgtcgataaa 900
aagaacggcg attacaatag tgtgactttc tcagcactta agctgaacgg caagtag 957