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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710515092.0 (22)申请日 2017.06.29 (71)申请人 福建省农业科学院植物保护研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔 垱福建省农业科学院 (72)发明人 王荣波陈庆河李本金刘裴清 翁启勇 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006。
2、.01) (54)发明名称 一种荔枝霜疫霉PCR引物及其分子检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种荔枝霜疫霉PCR引物及其 分子检测方法， 专用于荔枝霜疫霉特异检测， 主 要采用一种荔枝霜疫霉菌的PCR引物 （PlRhF： C T C G A A A G G C T A A T C C G A A T G ； P l R h R ： ACGGCACTCTTCAGGCTCTT） 经过聚合酶链式反应扩 增后琼脂糖凝胶电泳检测， 可观察到大小为340 bp左右的单一形带。 所发明的PCR引物及其用法 可被用于生产实践中荔枝霜疫霉菌感染的植株 和采摘后荔枝果实中荔枝霜疫霉菌的快速、 灵 敏、 准确的。
3、检测， 同时可用于田间病害的早期诊 断和病菌的监测和鉴定， 为荔枝霜疫霉菌引起的 病害防治提供可靠的技术和理论依据。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 107058609 A 2017.08.18 CN 107058609 A 1.一种荔枝霜疫霉PCR引物， 其特征在于： 所述PCR引物如下： PlRhF： CTCGAAAGGCTAATCCGAATG； PlRhR： ACGGCACTCTTCAGGCTCTT。 2.一种荔枝霜疫霉的PCR检测方法， 其特征在于： 利用权利要求1所述PCR引物进行PCR 反应， 20 l反应体系中PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq。
4、 PCR Master Mix 10 l， 25ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足； PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 30s， 58 30s， 72 30s， 28个循环； 72 30s； 16 forever。 3.根据权利要求2所述的荔枝霜疫霉PCR检测方法， 其特征在于： 取5 l扩增产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测， 如出现大小约为340 bp单一条带判断为阳性， 没有出现则判断为阴 性。 4.如权利要求1所述的荔枝霜疫霉PCR引物在田间荔枝霜疫病的早期诊断和病菌的监 测和鉴定中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107058609 A 2 一种荔。
5、枝霜疫霉PCR引物及其分子检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种荔枝霜疫霉菌PCR引物及其快速检测方法， 专用于荔枝霜疫霉菌 高灵敏度快速分子检测， 同时可用于田间荔枝霜疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定， 属 于农作物病害检测、 鉴定及防治技术领域。 背景技术 0002 荔枝 （Litchi chinensis） 是我国南方的一种名特优水果， 栽培面积和年产量分别 占世界的84.5 %和70.5 %， 年总产值达到62.88亿元， 为我国在世界上最具竞争实力的一种 亚热带与热带水果。 荔枝霜疫病目前是荔枝生产一种最重要的病害， 其是由荔枝霜疫霉 （Peronophythora litch。
6、i） 侵染引起的。 它主要危害已近成熟的果实， 也为害花穗、 幼果、 果 柄、 结果小枝和叶片， 从而引起大量落花、 落果、 裂果及烂果， 同时也是造成荔枝采后腐烂变 质的重要因素。 天气潮湿年份烂果率高达50 %， 损失率高达30 %80 %， 严重影响荔枝产量 和鲜果品质， 造成严重的经济损失。 近几年该病有逐渐加重的趋势， 已成为限制荔枝安全生 产的重要障碍。 因此建立荔枝霜疫霉菌快速检测体系， 早期对发病植株及采摘果实进行疫 霉菌快速准确检测， 对预测病害发生情况， 及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和 流行、 减少经济损失， 尤其是荔枝采后储藏都具有重要的理论和实际意义。 000。
7、3 传统荔枝霜疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、 致病性测定、 生理生化特 性等， 程序繁琐， 所需时间较长， 鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰， 而且不能直 接从植物组织中检测出病原菌， 难以满足病害控制中快速、 灵敏、 稳定的检测要求， 很容易 错过病害防治的最佳时期， 而免疫血清学鉴定方法虽已建立， 但是特异性较差， 常常受到抗 血清质量的影响， 容易造成假阳性， 因此这些方法的应用均受到一定的限制。 因此， 建立一 套快速、 灵敏、 准确的荔枝霜疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要， 而且十分迫切。 0004 聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction， 。
8、PCR） 是一种利用DNA聚合酶在体 外大量扩增靶序列的技术， 该技术是病原检测最常规的方法之一， 广泛应用于病原鉴定、 变 异检测等分子生物学研究。 PCR检测技术灵敏度高、 特异性强， 已成为病原菌检测重要的技 术之一， 主要包括常规PCR、 巢式PCR （Nest-PCR） 和实时荧光定量PCR等。 目前， 病原菌分子检 测主要以ITS核酸序列作为靶标， 但是ITS序列在不同物种间很保守， 尤其在相近物种间差 异更小， 因此特异性不高是其缺陷。 因此， 寻找物种所特异的核酸序列用于病原菌的分子检 测是非常有必要的。 此核酸序列可应用于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测， 对 于确定病。
9、害防治最佳时期具有重要的作用， 为防治策略的制定提供技术支持。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、 检 测方法特异性差， 灵敏度低的问题， 提供一种荔枝霜疫霉菌高度特异的PCR检测引物以及建 立了基于琼脂糖凝胶电泳判定的PCR检测。 0006 实现本发明的目的包括下列步骤： 说明书 1/5 页 3 CN 107058609 A 3 1 PCR引物的设计 通过比较基因组学的方法， 在荔枝霜疫霉的基因组上选择有卵菌特异性的基因PlRh （Gene ID： Pl_101565） 作为检测靶标， 采用Primer Premier 6软件设计一种PC。
10、R检测引物， 引物序列为： PlRhF： CTCGAAAGGCTAATCCGAATG； PlRhR： ACGGCACTCTTCAGGCTCTT 。 0007 2 荔枝霜疫霉菌PCR检测体系的建立 PCR检测： 20 l反应体系中PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq PCR Master Mix 10 l， 25 ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足； PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 30s， 58 30s， 72 30s， 28个循环； 72 30s； 16 forever。 0008 所述的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法。 所述琼脂糖凝胶电泳法： 取5 l。
11、 PCR扩增 产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如果出现大小约为340bp的单一条带判断为阳性， 没有出现 扩增条带判断为阴性。 0009 该方法可用于带菌的植株和荔枝果实的高灵敏度快速检测。 建立荔枝霜疫霉菌快 速、 简便、 特异性强、 灵敏度高的监测技术体系， 对于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前以及 荔枝采后储藏的早期监测， 确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。 0010 本发明的关键性技术是荔枝霜疫霉菌的高效特异扩增的引物序列。 为了验证荔枝 霜疫霉菌的特异引物序列， 本发明以我国福建、 云南、 广西、 广东和海南等省的20株荔枝霜 疫霉菌和14种其它卵菌以及6种病原真菌为供试材料， 采。
12、用CTAB法提取组织中荔枝霜疫霉 菌的DNA。 具体方法如下： 取50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中， 加入900 l 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液 （提取液的配方为： 2% CTAB； 100 mmol/L Tris-HCl （三羟甲基氨基甲烷盐酸盐） ， PH 8.0； 20 mmol/L EDTA （乙二胺四乙酸二钠） ， pH 8.0； 1.4 mol/L NaCl） 和90 l 10% SDS （十二烷基苯磺酸钠） 后混匀， 于5560水浴1.5 h， 每10 min振荡混匀一次， 水浴1.5 h后离心 （12,000rpm） 15 min， 取上清液加。
13、入与上清液等体积的 酚/氯仿/异戊醇 （酚、 氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1） ， 离心(12,000 rpm)5 min， 取上清 液 （水相） ， 加入与上清液等体积的氯仿抽提一次 （12,000 rpm） 离心5 min， 吸上清(350 l） ， 加0.1体积(35 l)的3 mol/L NaAC溶液和2体积 （700 l） 的冰无水乙醇， -20下沉淀30 min后12,000 rpm离心5 min， 轻轻地倒去上清液， 加入700 l冰70%乙醇进行洗涤 （稍离心， 倾掉上清） ， 在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1TE （10 mmol/L Tris-HCl， 0.1 m。
14、mol/L EDTA， pH 8.0） 溶液进行溶解， 得到DNA溶液， 用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀 释至25 ng/ l待用。 0011 经对供试菌株和20株荔枝霜疫霉菌的特异性进行PCR验证。 0012 PCR反应体系20 l ： PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq PCR Master Mix 10 l， 25 ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足。 0013 除了来自我国福建、 云南、 广西、 广东和海南等省的20株荔枝霜疫霉菌在琼脂糖凝 胶电泳检测出现特异的单一条带， 检测了6种真菌菌株和14种其他卵菌琼脂糖凝胶电泳结 果没有出现扩增条带。 这说明该引物可。
15、被用于生产实践中发病组织及荔枝果实中荔枝霜疫 霉快速可靠的检测和鉴定。 0014 当在用于荔枝叶片或果实组织中存在荔枝霜疫霉菌的检测时， 采用NaOH快速裂解 说明书 2/5 页 4 CN 107058609 A 4 法提取病组织的DNA， 具体过程如下： (1)将荔枝病叶或病果洗净、 晾干， 剪取发病部位； (2) 按1 mg组织样品加入10 l （0.5mol/L NaOH， 0.5%PVP） 计量， 将组织充分磨碎成糊， 在12, 000g离心机中离心5min； (3)取上清20 l与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl （pH 8.0） 混合； (4)稀释10倍、 100倍、 。
16、1000倍液， 分别取1 l原液、 10倍、 100倍、 1000倍液作为PCR模板进行 扩增。 0015 按如下PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测： PCR反应体系20 l： 包含PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq PCR Master Mix 10 l， 25 ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足； PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 30s， 58 30s， 72 30s， 28个循环； 72 30s； 16 forever。 0016 取5 l扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 结果在340 bp左右出现单一条带， 即可判断所述的荔枝病。
17、组织或果实中存在荔枝霜疫霉菌； 否则所述的荔枝病组织或果实中 未存在荔枝霜疫霉菌。 0017 本发明有益效果： 本发明方法适用于发病组织或采摘后荔枝果实中荔枝霜疫霉菌 的快速可靠的检测和鉴定， 对于农业生产中荔枝霜疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用 价值。 本发明与现有技术相比， 具有以下的技术优势和积极效果： 1、 结果可靠： 本发明所设计出的PCR检测引物， 已经对源于中国福建、 云南、 广西、 广东 和海南等省的20株荔枝霜疫霉菌和带荔枝霜疫霉菌的植物组织进行了测试验证， 因此结果 可靠性具有充分的保证； 2、 特异性强： 本发明所检测的靶标基因序列是通过比较基因组学筛选出卵菌所特异的 。
18、基因-铵盐转运子基因Rh， 进一步根据疫霉菌Rh基因序列中不同区域设计出的2条PCR特异 性引物， 不同卵菌的区分区域序列相似度极低， 因此与引物不匹配均不能进行核酸扩增， 故 特异性高。 0018 3、 灵敏度较高： PCR对荔枝霜疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到100 pg/ L。 0019 4、 实用性好： 本发明所设计出的PCR引物， 可用于带荔枝霜疫霉菌的植物组织的高 灵敏度快速检测， 因此本方法的实用性强， 可满足对带菌组织和采摘后荔枝果实中荔枝霜 疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。 附图说明 0020 图1为本发明荔枝霜疫霉菌的特异PCR检测结果图。 图1表示琼脂糖凝胶。
19、电泳检测 结果， 其中： 泳道M为DL 2000 DNA marker， 泳道0为阴性对照， 泳道1、 2为阳性对照， 泳道3- 23为其他卵菌和真菌菌株 （见实施例1） 。 0021 图2为本发明荔枝霜疫霉菌的PCR灵敏性检测结果图。 图2表示琼脂糖凝胶电泳检 测结果， 其中： 泳道M为DL 2000 DNA marker， 泳道0为阴性对照， 泳道110模板浓度分别为 100 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 100 pg、 10 pg 、 1 pg、 100 fg、 10 fg 和 1fg （见实施例2） 。 0022 图3为本发明对发病叶片组织检测结果图。 图3表示琼脂糖凝。
20、胶电泳检测结果， 其 中： 泳道0为阴性对照； 泳道1为健康组织， 泳道2为阳性对照， 泳道3、 4、 5为不同程度发病叶 片组织； 泳道M为DL 2000 DNA marker （见实施例3） 。 说明书 3/5 页 5 CN 107058609 A 5 具体实施方式 0023 本发明的技术内容包括荔枝霜疫霉菌的PCR检测引物， PCR引物及其序列分别为： PlRhF： CTCGAAAGGCTAATCCGAATG； PlRhR： ACGGCACTCTTCAGGCTCTT。 0024 利用PCR引物检测荔枝霜疫霉通过琼脂糖凝胶电泳出现单一的大小约为340 bp的 条带。 0025 主要试剂： 。
21、2Taq PCR Master Mix、 DNA marker购自日本TaKaRa公司； 其余试剂 均购自生工生物 （上海） 技术有限公司。 引物由Invitrogen （上海） 技术有限公司合成。 0026 实施例1： PCR引物对荔枝霜疫霉菌的特异性扩增 1 荔枝霜疫霉菌的PCR特异检测 PCR反应体系20 l： 包含PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq PCR Master Mix 10 l， 25ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足。 PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 30s， 58 30s， 72 30s， 28个循环； 72 30s； 16 f。
22、orever。 0027 取5 l扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如果出现大小约为340 bp的单一条 带判断为阳性， 没有出现扩增条带判断为阴性。 0028 2 检测结果 检测的特异性： 除了来自我国福建、 云南、 广西、 广东和海南等省的20株荔枝霜疫霉菌 琼脂糖凝胶电泳出现大小约为340 bp的单一条带外， 检测了14种其它卵菌以及6种病原真 菌琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带 （部分结果见图1） ， 说明此引物具有很强的特异性。 0029 实施例2： PCR引物对荔枝霜疫霉菌的灵敏性检测 1 荔枝霜疫霉菌的PCR灵敏性检测 采用10倍浓度系列稀释法将提取的荔枝霜疫霉菌DNA稀释成10。
23、0 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 100 pg、 10 pg 、 1 pg、 100 fg、 10 fg和1fg共10个不同浓度梯度。 0030 PCR反应体系20 l： 包含PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq PCR Master Mix 10 l， 25ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足。 PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 30s， 58 30s， 72 30s， 28个循环； 72 30s； 16 forever。 0031 取5 l扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如果大小约为340 bp的单一条带判 断为阳性， 没有出现扩增。
24、条带判断为阴性。 0032 2 检测结果： 荔枝霜疫霉菌PCR灵敏性检测， 琼脂糖凝胶电泳出现大小约为340 bp 的单一条带， 检测灵敏度可达100 pg （见图2） 。 0033 实施例3： 发病叶片组织中荔枝霜疫霉菌的检测。 0034 1 样品采集： 荔枝叶片组织样品采自福建农林大学校园。 0035 2 DNA提取及检测 发病荔枝叶片组织采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌DNA。 0036 按下述方法进行PCR检测： PCR反应体系20 l： 包含PlRhF与PlRhR各0.2 M， 2Taq PCR Master Mix 10 l， 25ng DNA模板， 不足部分用无菌双蒸水补足。
25、。 0037 PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 30s， 58 30s， 72 30s， 28个循环； 说明书 4/5 页 6 CN 107058609 A 6 72 30s； 16 forever。 0038 取5 l扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测， 如果大小约为340 bp的单一条带判 断为阳性， 没有出现扩增条带判断为阴性。 0039 3 检测结果 如图3所示， 发病叶片组织中感染荔枝霜疫霉菌， 其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳出现 大小约为340 bp的单一条带， 而健康叶片组织扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳未出现条带。 0040 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 5/5 页 7 CN 107058609 A 7 SEQUENCE LISTING 福建省农业科学院植物保护研究所 一种荔枝霜疫霉PCR引物及其分子检测方法 2 2 PatentIn version 3.3 1 21 DNA 人工序列 1 ctcgaaaggc taatccgaat g 21 2 20 DNA 人工序列 2 acggcactct tcaggctctt 20 序列表 1/1 页 8 CN 107058609 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 9 CN 107058609 A 9 。