技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及基因工程和基因分析，具体涉及一种利用报告基因选择性富集突变核酸片段的方法。
背景技术
肿瘤是一种病因尚未完全阐明的疾病，主要有基因突变所导致。因此，筛选肿瘤高危人群以及进行早期诊断和治疗尤为重要。近年来，随着免疫学，生物化学，分子生物学及相应技术的发展，肿瘤生物学标志物的研究也得到了深化和突破，尤其是肿瘤循环DNA的发现，为肿瘤早期诊断的无创性和敏感性带来了契机。并使循环DNA成为肿瘤早期诊断研究的新靶点。
自杀基因(suicide gene)，是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。自杀基因若能正常表达，其携带的基因表达的蛋白质便能杀死宿主细胞，若自杀基因那段序列不能正常编码即移码或含有终止密码子，便不能正常表达自杀基因，宿主细胞便能正常生长。利用热点突变如KRAS12位点突变，突变之后含有终止密码子，将这段序列克隆到自杀基因中，看他在自杀基因上的生长情况。若突变前，不含有终止密码子，便不能正常在宿主细胞上生长；突变后，含有终止密码子，能在宿主细胞上生长。自杀基因具有敏感性高，假阳性等优点，从而用于检测循环DNA。循环DNA是存在于外周血中的有利于细胞外的核酸。目前检测循环DNA的方法有Sanger一代测序和高通量测序及数字PCR等，Sanger一代测序敏感性不到百分之十，高通量测序及数字PCR等敏感性最大可达到千分之一，但可能存在假阳性且现有千分之一的敏感性仍不足以对肿瘤进行早期诊断。
发明内容
本发明所要解决的问题在于提供一种利用自杀报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法，通过选择性破坏抑制含有一种特定基因型片段相关载体的扩增而不会抑制另外基因型片断相关载体的扩增，达到将特定基因型片段进行富集的目的。
本发明的第一方面提供的技术方案：以自杀基因作为报告基因选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，以选择性抑制核酸样本中含等位基因的野生型基因片段的扩增，而不抑制核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的扩增。从而为测序提供一种已经对突变基因进行了富集的待测标本，以提高测序分析的敏感性。
本发明优选的技术方案中，以含有自杀基因的质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，优选以含自杀基因pDONER211质粒载体选择性富集核酸样本中的突变核酸片段。且自杀基因的序列为Seq ID No.1所示。
本发明优选的技术方案中，所述核酸样本中含等位基因的野生型基因片段不含有终止密码子，而突变型基因片段含有终止密码突变或含有可转化为终止密码子的突变，即突变型基因片段在克隆进自杀载体后始终表现出含有终止密码子的作用而使自杀基因丧失自杀作用。
本发明优选的技术方案中，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp；更优选地，所述野生型基因片段或突变型基因片段为20-100bp；进一步，所述野生型基因片段或突变型基因片段优选为10-50bp。
本发明优选的技术方案中，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段为点突变或移码突变。
优选地，核酸样本中含等位基因的野生型基因片段为10-200bp，且不含终止密码子；更优选地，所述野生型基因片段为20-100bp，且不含终止密码子；进一步所述野生型基因片段优选为10-50bp，且不含终止密码子。
本发明的第二方面提供自杀基因作为报告基因进行选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)评估核酸样本情况，
(2)提供含有自杀基因作为报告基因的质粒载体，
(3)将步骤(1)中的核酸样本连接到步骤(2)中的含有自杀基因作为报告基因的质粒载体中，
(4)将步骤(3)中的质粒载体转化H5a感受态细胞，在含有抗性筛选的琼脂培养基上培养富集，
(5)挑取筛选培养基上的菌落，测序验证。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(1)中核酸样本中含等位基因的野生型基因片段或突变型基因片段为10-200bp，且不含终止密码子时，评估适于本方法进行后续操作。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(2)中为含有自杀基因的质粒载体，所述步骤(3)中将核酸样本连接到含有自杀基因的质粒载体中；优选地为pDONER211质粒载体。
本发明优选的技术方案中，核酸样本构建的两侧酶切位点可以包括但不限为：AARI，HindIII或KpnI酶切位点。优选地,步骤(3)中将核酸样本连接到pDONER211质粒载体的多克隆位点中。
本发明优选的技术方案中，自杀基因作为报告基因进行选择性富集核酸样本中的突变核酸片段，其特征在于，其包括如下步骤：
(A)评估核酸样本情况，
(B)提供含有自杀基因的质粒，
(C)以含有自杀基因的质粒为载体，将PCR扩增的待测标本片段克隆到含有自杀基因的的载体中，
(D)将步骤(C)中的质粒载体转化H5a感受态细胞，在含有Kana霉素抗性筛选的琼脂培养基上培养富集，
(E)挑取筛选培养基上的菌落，PCR或者测序验证。
优选地，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的突变为点突变；若突变前，不含有终止密码子，便不能正常在宿主细胞上生长；突变后，含有终止密码子，能在宿主细胞上生长；优选为KRAS12位点突变，其突变之后含有终止密码子，将这段序列克隆到自杀基因中，看他在自杀基因上的生长情况。
优选地，所述核酸样本中含等位基因的突变型基因片段的突变为移码突变；具体而言当突变核酸片段为3的整数倍3n时，由于片段的碱基数目的是3的整数倍，不产生移码，含有该型质粒的菌落无法在培养基上生长；当突变核酸的片段不是3的整数倍，如为3n+1或者含有终止密码子，含有该型质粒的菌落就可以在培养基上生长。
大肠杆菌DB3.1细胞含有gyrA462基因，对λ嗜菌体的ccdB基因产物的毒性具有抵抗作用，特别适用于转化和扩增包含ccdB基因的质粒载体。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107cfu/μgDNA.，－70℃保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。质量稳定，使用方便，质优价廉。
DB3.13菌株的基因型为：F-gyrA462endA1Δ(sr1-recA)mcrBmrrhsdS20(rB-,mB-)supE44ara-14galK2lacY1proA2rpsL20(SmR)xyl-5λ-leumtl1抗生素耐药性：DB3.13感受态细胞具有链霉素抗性。操作步骤(以下操作均按无菌条件的标准进行)：提示DB3.1感受态细胞应保存在－70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
本发明中，自杀基因被选作为报告基因，因为它同时满足了上述用于检测基因突变的报告基因的两个要求,对突变有极高耐受性，假阳性极少。如果插入片段的碱基数目的是三的整数倍，不产生移码，该型质粒就不能在普通的感受态细胞上生长。如果插入的片段不是三的整数倍或者含有终止密码子，该型质粒就可以在普通的大肠杆菌感受态细胞生长。通过长菌数目的比例，从而判断出是野生还是突变，最后应用于kras热点突变的12位突变点，突变之前，没有终止密码子。突变后，产生终止密码子，从而可以在普通的大肠杆菌上面生长。最后按不同比例混合野生和突变的oligo,在野生与突变比例为10000:1的情况下，连接载体进行转化，挑选2个生长的菌去测序，最后测序全部是突变。该方法提供了一种新型的检测基因突变的方法。敏感性可达到万分之一。
本发明中自杀基因被选作为报告基因，它同时满足了两个要求。对突变有极高耐受性，假阳性极少。试验证明自杀基因在100bp以下(插入片段51Bp,81bp)可以表现出理想模式，无假阳性产生。它可以作为用于检测肿瘤原癌基因突变的报告基因。
通过选择性破坏抑制含有一种特定基因型片段相关载体的扩增而不会抑制另外基因型片断相关载体的扩增，达到将特定基因型片段进行富集的目的。本发明通过对标本中不同核酸基因型的富集构成，改变待测标本中不同基因型基因片段的比例，可用于基因突变分析。
本发明采用了一个新的方法来鉴定突变：运用寡核苷酸串来检测目的基因的突变性。寡核苷酸串防止了突变的无意义性，并且使得插入基因片段的延伸和切断具有了灵活性。在试验中，发明人采用了自杀基因作为报告基因，它被证明同时具有两个优点：可高度耐受突变，几乎没有假阳性。同时因为富集的待测标本是用于测序分析，本发明为提高测序分析的敏感性具有实用价值。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为pDONER211的质粒图谱。
图2为重叠延伸加入AARI酶切位点和HindIII位点说明图。
图3为在DH5a培养基上，移码和不移码的oligo片段菌落生长图，其中，图3A为3n菌落生长图；图3B为3n+1菌落生长图；3n+1比3n长的多，3n并不是完全不长菌，说明自杀基因的效率并不是100％的。
图4在DB 3.1培养基上，移码和不移码的oligo片段菌落生长图，其中，图4A为3n菌落生长图，图4B为3n+1菌落生长图。
图5为插入报告基因的碱基为3n+1的测序图。
图6为插入报告基因的碱基为3n的测序图。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
一.仪器、材料
引物合成及测序委托苏州金唯智公司完成。pDONER211质粒购自Invitrogen公司，其质粒图谱如图1所示，其上具有卡那霉素抗性基因。PCR扩增仪(ABI公司，System 9700)，电泳仪(Bio-Rad生物公司)，PCR扩增试剂盒，AARI购于(购于New England Biolabs公司)，HindIII和KpnI相关限制性内切酶(购于Thermo Scientific公司)，DNA核酸片段回收试剂盒(购于天根生化)。T4DNA连接酶(购于Thermo Scientific公司)，其余均为国产试剂及耗材。
二.建立方法
实施例1
提供pDONER211质粒，并以pDONER211质粒为模板引入AARI的酶切位点
1.以pDONER211质粒为模板，PCR重叠延伸片段引入AARI的酶切位点，
1.1用pDONER211质粒作为模板，利用引物XI+(Seq ID No.2)和引物XI-(Seq ID No.3)进行PCR扩增，每20μL PCR反应体系包括：2.0μL的10X Pfu Buffer with MgSO4,0.3μL的Pfu Polymerase(2.5U/μL),0.5μL的dNTP Mix(10mM each)，两条特异性引物分别为0.5μL，模板0.5μL，余量为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，共30个循环；最后72℃5min。
得到的产物目的片段编号为片段1和片段2。
1.2用PDONER211作为模板，利用引物HI+(Seq ID No.4)和HI-(Seq ID No.5)进行PCR扩增，每20μL PCR反应体系包括：2.0μL的10X Pfu Buffer with MgSO4,0.3μL的Pfu Polymerase(2.5U/μL),0.5μL的dNTP Mix(10mM each)，两条特异性引物分别为0.5μL，模板0.5μL，余量为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，共30个循环；最后72℃5min。
得到的产物目的片段编号为片段3和片段4。
1.3将上述1.1得到产物目的片段1和片段2，将上述1.2得到产物目的片段3和片段4，在37摄氏度环境下放置30-60分钟。
1.4以上述步骤1.3孵育的产物作为新的模板，用Primer XI+和Primer HI-做PCR扩增，每20μL PCR反应体系包括：1.0μL的10X Pfu Buffer with MgSO4,0.3μL的Pfu Polymerase(2.5U/μL),0.5μL的dNTP Mix(10mM each)，XI+引物为0.5μL，XI-引物为0.5μL，目的片段1、2、3、4合计为10.0μL，水为7.2。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，共30个循环；最后72℃5min。
所获得的目标产物记作1-4，即为携带ARRI酶切位点核酸片段，酶切后，则可以用来插入携带自杀基因的Plasmid。
2.将前述含有AARI酶切位点的片段，连接到pDONER211质粒中
2.1用BamHI和PstI酶切pDONER211质粒和步骤1.4得到的PCR产物，酶切体系反应条件为37℃孵育60分钟。然后用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切片段，
2.2将上述两个酶切产物进行连接反应，连接体系如下：T4buffer 0.5μL，PCR产物3.0μL，PDONER211质粒1.0μL，T4酶1μL，最后补充水到10μL。反应条件为：22°环境下孵育1小时，产物即为带有Kana霉素抗性基因和自杀基因以及AAR1酶切位点的PlasmidPDONR211的连接混合液。
AARI酶切位点的优势：保证无缝酶切，不残留酶切位点。
2.3取上述的连接混合液，转化H5a感受态细胞，然后涂布Kana筛选培养基，具体方法为：取50μl的DH5a感受态细胞在冰上融化10分钟，并且加入上一步骤的连接体系，随后放置冰块上三十分钟，42℃水浴热击42秒，快速置于冰上15分钟，随后加入800μlLB培养基，(无抗生素)，180转，37℃振荡培养40分钟。离心后分离弃上清液(500微升)，剩下的300微升吹打均匀，涂在含有Kana霉素的琼脂培养基上，放置在37℃的恒温培养箱内培养一夜，第二天观察菌落是否有形成。
还可以随机挑取上述菌落进行PCR或者测序检测，进行进一步的确认。
实施例二
在实施1中制备得到的含有AARI酶切位点的pDONER211质粒中插入寡核苷酸串(移码突变)
如果插入片段的碱基数目的是三的整数倍，则不产生移码，含有该型质粒的菌落无法在培养基上生长；如果插入的片段不是三的整数倍3n+1或者含有终止密码子，含有该型质粒的菌落就可以在在培养基上生长。
3.1设计并合成Oligo如下：
NNC3n+:AATGNNCNNCNNCNNCNNCNNCNNCNNC
NNC3n-:ACTGGNNGNNGNNGNNGNNGNNGNNGNN
其中，NNC控制了终止密码子不会出现。具体实例，NNC3n+(Seq ID No.6),NNC3n-
(Seq ID No.7)。
3.2pDONER211质粒使用AAR1进行单酶切，酶切体系为：10ⅹAAR1 Buffer80μL，50ⅹOligo16μL，DNA150μL，加水到体系为800μL。酶切完成后用TIANGEN回收，具体同前步骤。
3.3Oligo退火及连接：将寡核苷酸串Oligo的3n+和3n-退火，形成双链DNA，构建annealing体系，然后将产生的Annealing产物稀释十倍，再与载体PDONER211混合，连接体系如下：T4act Buffer 1μL，T4酶1μL，回收的PDNOER211 1μL，退火片段3n 1μL，加水到体系为10μL；16℃过夜连接。
3.4将上述的连接产物分别转化感受态细胞DH5a和DB3.1，涂在含有Kana霉素的琼脂培养基上，放置在37℃的恒温培养箱内培养过夜，第二天观察两种感受态细胞形成菌落的情况。次日直接挑菌测序。
3.5设计并合成Oligo如下：
NNC3n+1+：AATGNNCNNCNNCNNCNNCNNCNNCNNCN
NNC3n+1-:ACTGNGNNGNNGNNGNNGNNGNNGNNGNN
具体实例，可以为:NNC3n+1+(Seq ID No.8)和NNC3n+1-(Seq ID No.9)。
3.6pDONER211质粒使用AAR1进行单酶切，酶切体系为：10ⅹAAR1Buffer80μL，50ⅹOligo16μL，DNA150μL，加水到体系为800μL。酶切完成后用TIANGEN回收，具体同前步骤。
3.7Oligo退火及连接：将寡核苷酸串Oligo的3n+1+和3n+1-退火，形成双链DNA，构建annealing体系，然后将产生的Annealing产物稀释十倍，再与载体pDONER211混合，连接体系如下：T4act Buffer 1μL，T4酶1μL，回收的pDNOER211 1μL，退火片段3n 1μL，加水到体系为10μL；16℃过夜连接。
3.8将上述的连接产物分别转化感受态细胞DH5a和DB3.1，涂在含有Kana霉素的琼脂培养基上，放置在37℃的恒温培养箱内培养过夜，第二天观察两种感受态细胞形成菌落的情况。次日直接挑菌测序。
实施例三将KRAS12基因连接到实施例1制备得到的含有AARI酶切位点的pDONER211质粒中，进行选择性富集KRAS 12基因突变核酸片段
1.更换AARI酶切位点为kpnI和HindIII，
备注：HindIII:AAGCTT,KpnI:GGTACC
设计oligo,其中Oligo+(Seq ID No.10)和Oligo-(Seq ID No.11)。
a.AARI酶切新构建好的质粒
b.Anneal Oligo+,Oligo-
c.连接酶切好的载体和oligo,转化。
2.双酶切，加入基因组kras序列
设计如下片段OligokT50+(Seq ID No.12)，OligokT50-(Seq ID No.13)，Oligokw50+(Seq ID No.14)，OligokW50-(Seq ID No.15)。
HindIII,KpnI双酶切上述构建好的质粒。Anneal:OligokT50+,OligokT50-；Oligokw50+，OligokW50-。
然后连接双酶切的载体和oligo。
3.连接转化，及进行挑菌检测
KRAS野生突变10:1,100:1,1000:1,10000:1不同比例混合，然后挑菌摇菌提取DNA,送测序，看里面是否有突变的菌。即在万分之一的突变长菌培养皿中，挑的两个菌去测序，测序全部正确，符合预期。
三、结果分析
理论上来讲，携带了自杀基因的片段导入DH5a后，其表达的酶可催化产生细胞毒物质，从而杀死携带该基因的受体细胞即DH5a，所以菌落无法在培养基上生长。当基因片段移码(碱基数目变为3n+1)过后，这种酶无法再分泌，受体细胞也就能够存活，菌落正常生长。
1.在突变比例为万分之一比例的情况下，通过自杀基因选择性富集突变型的基因，抑制野生型的基因，最后在转化铺板的过程中，通过挑菌摇菌提取DNA，能够测序到突变的菌，提供了一种新型的检测突变型的方法。KRAS12位点突变，突变之后含有终止密码子，将这段序列克隆到自杀基因中，看他在自杀基因上的生长情况。若突变前，不含有终止密码子，便不能正常在宿主细胞上生长；突变后，含有终止密码子，能在宿主细胞上生长。
2.DH5a生长情况
在DH5a培养基上，移码和不移码的oligo片段以同样的Plasmid浓度(20n克)转化，长菌的比例为3n+1:3n＝2000:1。
3.DB3.1生长情况
在DB3.1培养基上，不管移码还是不移码的Plasmid，都长菌落，DB3.1是一种特异的感受态细胞。
4.PCR片段在DH5a上的生长
这一步是为了检测只是单纯移码，不受终止密码子的影响，Plasmid是否能转化生长，验结果是可以的。
将两种寡核苷酸串:3n+1和3n，插入pDONER211质粒中，如果插入片段的碱基数目的是三的整数倍，不产生移码，该型质粒就只能在DB3.1的感受态细胞生长；如果插入的片段不是三的整数倍或者含有终止密码子，该型质粒就可以在普通的大肠杆菌感受态细胞生长，
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州佳章生物技术有限公司
<120> 利用报告基因选择性富集突变核酸片段及其方法
<160> 15
<210> 1
<211> 255
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
atgcagttta aggtttacac ctataaaaga gagagccgtt atcgtctgtt tgtggatgta 60
cagagtgata ttattgacac gcccgggcga cggatggtga tccccctggc cagtgcacgt 120
ctgctgtcag ataaagtctc ccgtgaactt tacccggtgg tgcatatcgg ggatgaaagc 180
tggcgcatga tgaccaccga tatggccagt gtgccggtct ccgttatcgg ggaagaagtg 240
gctgatctca gccac 255
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
cgcgtggatc cggcttacta aaagccag 28
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
cgatgcaggt gaagcttcac ctgccgatca tttcaccagc ccctgttctc 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 合成
<400> 4
gtgaagcttc acctgcatcg cagtttaagg tttacaccta taaaagagag 50
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成
<400> 5
actggccata tcggtggtca tcatg 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成
<400> 6
aatgccctcc ctccccttct ccgtcttc 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成
<400> 7
actggaagac ggagaagggg agggaggg 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成
<400> 8
aatggacgcc cccctcgcct acaccgccc 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成
<400> 9
actggggcgg tgtaggcgag gggggcgtc 29
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成
<400> 10
aatgaagctt nncnnccggt acc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成
<400> 11
actgggtacc ggnngnnaag ctt 23
<210> 12
<211> 61
<212> DNA
<213> 合成
<400> 12
agcttacttg tggtagttgg agctgatggc gtaggcaaga gtgccttgac gatacaggta 60
c 61
<210> 13
<211> 53
<212> DNA
<213> 合成
<400> 13
ctgtatcgtc aaggcactct tgcctacgcc atcagctcca actaccacaa gta 53
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 合成
<400> 14
agcttacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga gtgccttgac gatacaggta 60
c 61
<210> 15
<211> 53
<212> DNA
<213> 合成
<400> 15
ctgtatcgtc aaggcactct tgcctacgcc accagctcca actaccacaa gta 53