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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710536481.1 (22)申请日 2017.07.04 (71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研 究所 地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 (72)发明人 陈林刘天中程文涛张维 王俊峰 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 李颖周秀梅 (51)Int.Cl. C12N 1/04(2006.01) C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 一种雨生红球藻细胞。
2、的保存及复苏方法 (57)摘要 本发明属于藻类生物技术领域， 具体涉及一 种雨生红球藻细胞的保存及复苏方法。 将雨生红 球藻细胞浓缩液经010摄氏度冷驯化后， 在遮 光条件、 冰点以下冰冻保存。 本发明通过将浓缩 藻液经短时冷驯化后冰冻保存， 而实现雨生红球 藻细胞的高存活率的中长期保存方法； 同时对保 存细胞的复苏方法； 本发明方法的复苏存活率 高， 在保存75天复苏后细胞存活率达到95以 上， 复苏后生长迅速； 有效避免细菌和杂藻繁殖， 在长期保存阶段无明显的细菌和杂藻生长， 复苏 后细胞快速生长， 抑制细菌和杂藻增殖； 本发明 方法简单， 不需要借助专业设备； 本发明方法易 于大量藻种的。
3、保存， 很容易在生产实践中实施。 权利要求书1页 说明书4页 CN 107058110 A 2017.08.18 CN 107058110 A 1.一种雨生红球藻细胞的保存方法， 其特征在于： 将雨生红球藻细胞浓缩液经010摄 氏度冷驯化后， 在遮光条件、 冰点以下冰冻保存。 2.按权利要求1所述的雨生红球藻细胞的保存方法， 其特征在于： 雨生红球藻细胞培养 至厚壁孢子状态后收集， 浓缩至细胞密度为10-200g/L。 3.按权利要求1所述的雨生红球藻细胞的保存方法， 其特征在于： 将收集的雨生红球藻 厚壁孢子状态细胞浓缩液放置于010摄氏度下冷冻驯化15天。 4.按权利要求3所述的雨生红球藻。
4、细胞的保存方法， 其特征在于： 所述冷冻驯化温度为 15摄氏度。 5.按权利要求1所述的雨生红球藻细胞的保存方法， 其特征在于： 所述驯化后藻液于零 下20零下1摄氏度、 遮光条件下保存35个月。 6.一种权利要求1所述的保存方法保存的雨生红球藻细胞的复苏方法， 其特征在于： 所 述经冷驯化处理、 经冰冻后低温避光保存的雨生红球藻厚壁孢子细胞在535摄氏度下解 冻， 然后加入含氮培养基稀释， 再置于照光条件下培养， 即得到细胞的复苏。 7.按权利要求6所述的保存方法保存的雨生红球藻细胞的复苏方法， 其特征在于： 所述 含氮培养基中氮元素含量为0200mg/L。 8.按权利要求7所述的保存方法保。
5、存的雨生红球藻细胞， 其特征在于： 所述含氮培养基 中氮元素含量为50100mg/L。 9.按权利要求6所述的保存方法保存的雨生红球藻细胞的复苏方法， 其特征在于： 所述 稀释的细胞浓度为0.21.0g/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107058110 A 2 一种雨生红球藻细胞的保存及复苏方法 技术领域 0001 本发明属于藻类生物技术领域， 具体涉及一种雨生红球藻细胞的保存及复苏方 法。 背景技术 0002 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种生产天然虾青素的绿藻， 隶属于 绿藻门绿藻纲团藻目红球藻科。 其细胞在特定环境下生成大量的虾青素储藏于胞内，。
6、 虾青 素含量最高达7。 雨生红球藻中虾青素主要是酯化形态虾青素， 分子结构为3S， 3S 构型， 因此被认为是最好的天然虾青素来源， 在保健食品、 着色剂、 个人护理产品和高端饲料领域 有广泛的应用， 成为近年来藻类资源化开发利用的热点。 0003 在雨生红球藻规模化生产过程中， 特别是室外生产阶段需要大量的高活力细胞作 为起始藻种。 当前， 主要通过多级培养获得大量起始藻种， 因而需要在规模生产之前花费很 多时间并占用许多培养体积生产起始藻种。 在实际生产实践中， 一方面， 由于起始种源， 特 别是绿色游孢子由于污染食藻生物或无法耐受环境高光而大量死亡导致培养失败率高， 产 生的起始种源供。
7、应不足从而限制下一阶段的生产； 另一方面， 由于季节、 气候的限制， 在我 国的部分地区不能进行连续生产， 因而下一年度的生产容易受到起始种源培养时间消耗的 延误， 特别是气候条件不利于起始藻种培养时尤其严重。 通过高活力细胞保存方法， 适时、 足量地提供能够迅速复壮并能快速增殖的高密度高活力起始藻种是保障成功、 稳定生产的 有效方法， 直接关系到虾青素生产的效益， 成为制约雨生红球藻虾青素开发的瓶颈问题之 一。 0004 目前， 微藻保存方法包括继代保存、 干燥保存、 浓缩液低温保存和超低温冻存等方 法。 继代保存法是使用最广泛的传统方法， 包括液体和固定化继代保存法， 具有操作简单优 点，。
8、 但是存在营养盐消耗快、 细胞容易老化等问题， 需要每隔一个月更换培养基， 频繁继代 的工作量大。 通过红膜转光， 可以减缓雨生红球藻营养细胞的老化而延长保存时间 (CN103695314A-一种雨生红球藻营养细胞的保存方法)， 但是在大量保存实践时无法避免 细菌和杂藻的污染。 浓缩液低温保存法适用于一些单细胞藻类， 实现3个月左右的高活力保 存， 但是容易出现细菌和杂藻污染(CN105838611A-一种小球藻浓缩液的保存方法； CN105713838A-一种假微型海链藻的高活力细胞保藏方法)。 干燥保存法仅适用于一些丝状 体藻类(CN105483006A-丝状蓝藻的保存方法； CN1036。
9、21395A-萱藻丝状体包埋脱水超低温 保存方法)， 且复苏后存活率低。 超低温冻存是新型的细胞保存方法， 具有保持种质遗传稳 定， 可实现长达数年的长期保藏。 比如， 雨生红球藻在液氮低温下， 通过甘油保护可实现长 时间保藏(CN105779292A-一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法)， 但是复苏 存活率仅66.13， 且需要复杂的操作技术和贵重的保存设备。 由于上述方法在细胞存活 率、 保存时间、 劳动强度以及设备需求等方面局限， 限制了保存的效率和规模， 从而给实际 生产带来很多的困难。 说明书 1/4 页 3 CN 107058110 A 3 发明内容 0005 本发明目的。
10、是提供一种雨生红球藻细胞的保存及复苏方法。 0006 为实现上述目的， 本发明采用技术方案为： 0007 一种雨生红球藻细胞的保存方法， 将雨生红球藻细胞浓缩液经010摄氏度冷驯 化后， 在遮光条件、 冰点以下冰冻保存。 0008 所述雨生红球藻细胞培养至厚壁孢子状态后收集， 浓缩至细胞密度为10-200g/L。 0009 所述将收集的雨生红球藻厚壁孢子状态细胞浓缩液放置于010摄氏度下冷冻驯 化15天。 0010 所述冷冻驯化温度为15摄氏度。 0011 所述驯化后藻液于零下20零下1摄氏度、 遮光条件下保存35个月。 0012 一种保存方法保存的雨生红球藻细胞的复苏方法， 所述经冷驯化处理。
11、、 经冰冻后 低温避光保存的雨生红球藻厚壁孢子细胞在535摄氏度下解冻， 然后加入含氮培养基稀 释， 再置于照光条件下培养， 即得到细胞的复苏。 0013 所述含氮培养基中氮元素含量为0200mg/L。 0014 所述含氮培养基中氮元素含量为50100mg/L。 0015 所述稀释的细胞浓度为0.21.0g/L。 0016 与现有技术相比， 本发明具有以下优点： 0017 本发明通过将浓缩藻液经短时冷驯化后冰冻保存， 而实现雨生红球藻细胞的高存 活率的中长期保存方法； 同时对保存细胞的复苏方法； 具体为： 0018 1.本发明方法的复苏存活率高， 在保存75天复苏后细胞存活率达到95以上， 复。
12、 苏后生长迅速； 0019 2.有效避免细菌和杂藻繁殖， 在长期保存阶段无明显的细菌和杂藻生长， 复苏后 细胞快速生长， 抑制细菌和杂藻增殖； 0020 3.本发明方法简单， 不需要借助专业设备； 0021 4.本发明方法易于大量藻种的保存， 很容易在生产实践中实施。 具体实施方式 0022 下面结合部分实施例对本发明的技术方案进行详细描述。 所描述的实施例仅仅是 本发明的一部分， 而非全部的实施例。 0023 实施例1 0024 雨生红球藻NIES-144藻株(市购)， 分别在： 1)在全氮BBM培养基(市购)中以50 E/ m2/s光照下培养藻株5天得到的绿色游孢子； 0025 2)在无氮。
13、BBM培养基中以300 E/m2/s光照下培养藻株10天得到的厚壁孢子； 0026 将上述获得的绿色游孢子和厚壁孢子静置沉降浓缩， 而后分别置于冰箱保鲜室5 摄氏度中冷驯化24小时； 而后转移至冷藏室-20摄氏度冻结成冰并继续冻存60天； 冻存之后 取出置于室温下融化。 0027 之后以含4mmol/L硝酸钠的BBM培养基分别稀释上述融化的浓缩藻液至细胞密度 为0.449g/L， 稀释后置于200 E/m2/s光照， 并通入1CO2的空气培养。 光照培养48小时后， 利 说明书 2/4 页 4 CN 107058110 A 4 用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例， 统计得出。
14、绿色游孢子和厚 壁孢子的存活率分别为51.3和97.5； 而后再以上述条件继续培养8天， 绿色游孢子和厚 壁孢子的细胞密度分别达到0.668和2.768g/L， 计算得出绿色游孢子和厚壁孢子的比生长 速率分别为0.05和0.227。 0028 对比例1 0029 雨生红球藻NIES-144藻株， 分别在： 1)在全氮BBM培养基中以50 E/m2/s光照下培 养藻株5天得到绿色游孢子； 0030 2)在无氮BBM培养基中以300 E/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子； 0031 上述获得的绿色游孢子和厚壁孢子分别置于冰箱冷藏室-20摄氏度冻结成冰并继 续冻存60天； 而后取出置于室温下。
15、融化。 0032 之后以含4mmol/L硝酸钠的BBM培养基分别稀释上述融化的浓缩藻液至细胞密度 为0.471g/L， 稀释后置于200 E/m2/s光照， 并通入1CO2的空气培养。 照光培养48小时后， 利 用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例， 统计得出绿色游孢子和厚 壁孢子的存活率分别为0.2和4.6； 而后再以上述条件继续培养8天， 绿色游孢子和厚壁 孢子的细胞密度分别达到0.512和0.891g/L， 计算得出绿色游孢子和厚壁孢子的比生长速 率分别为0.01和0.079。 0033 对比例2 0034 雨生红球藻NIES-144藻株， 分别在： 1)在全氮BBM培。
16、养基中以50 E/m2/s光照下培 养藻株5天得到绿色游孢子； 0035 2)在无氮BBM培养基中以300 E/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子； 0036 上述获得的绿色游孢子和厚壁孢子分别置于室温下保存60天； 之后以含4mmol/L 硝酸钠的BBM培养基分别稀释上述室温保存的浓缩藻液至细胞密度为0.510g/L， 稀释后置 于200 E/m2/s光照， 并通入1CO2的空气培养。 照光培养48小时后， 利用荧光显微镜观察并 统计可激发出红色叶绿素荧光细胞的比例， 统计得出绿色游孢子和厚壁孢子的存活率分别 为57.3和75.2； 而后再以上述条件继续培养8天， 绿色游孢子和厚壁孢子。
17、的细胞密度分 别达到1.730和1.323g/L， 计算得出绿色游孢子和厚壁孢子的比生长速率分别为0.15和 0.11。 0037 比较实施例1与两个对比例中细胞保存复苏后的细胞存活率和比生长速率， 细胞 形态差异对存活率和比生长速率以及细胞培养物中细菌浓度的影响如表1所示： 0038 表1 0039 0040 由上述数据可见经冷驯化处理后冰冻保存的雨生红球藻细胞， 在复苏之后的存活 率显著高于直接冰冻保存的， 生长速度和比生长速率均明显高于后者。 镜检观察发现不论 说明书 3/4 页 5 CN 107058110 A 5 是否经冷驯化处理， 冷冻保存细胞复苏后培养染菌概率都很低。 而在室温下。
18、保存的， 绿色游 孢子的细胞存活率与实施例1相当， 但是厚壁孢子的细胞存活率显著降低； 最重要的是室温 保存细胞出现细胞结块不易分散， 且有异臭味， 镜检可观察到大量的细菌， 复苏后生长速率 也显著降低。 0041 实施例2 0042 雨生红球藻SCCAP K-0084藻株(市购)， 在无氮BBM培养基中以300 E/m2/s光照下 培养藻株10天得到厚壁孢子， 静置沉降后得到细胞密度为60g/L的浓缩藻液， 浓缩藻液置于 冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化24小时； 之后分装于多个样品袋中， 分装后分别置于-5、 -20、 - 80摄氏度冰箱中冻结成冰， 并继续冻存60天。 之后取出置于室温下融化，。
19、 融化后以含4mmol/ L硝酸钠的BBM培养基稀释融化后浓缩藻液至细胞密度为0.5g/L， 置于200 E/m2/s光照， 并 通入1CO2的空气培养。 照光培养48小时后， 利用荧光显微镜观察并统计可激发出红色叶 绿素荧光细胞的比例， 统计得出在-5、 -20、 -80摄氏度的存活率分别为98、 96和16。 0043 实施例3 0044 在无氮BBM培养基中以300 E/m2/s光照下培养藻株10天得到厚壁孢子藻液， 静置 沉降后得到细胞密度为40g/L的浓缩藻液， 置于冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化24小时； 之后 分装于多个样品袋中， 转移至冷藏室-5摄氏度冻结成冰。 分别在冻存3、 3。
20、8和75天后取出一 袋冻存藻， 置于室温下融化； 之后以含4mmol/L硝酸钠的BBM培养基稀释上述融化后浓缩藻 液至细胞密度为0.5g/L， 置于200 E/m2/s光照， 并通入1CO2的空气培养。 定时采样， 监测 细胞生长情况。 以仅经过冷驯化处理而没有冰冻的细胞作为接种材料的实验为对照。 结果 表明冻存3、 38和75天后复苏的细胞存活率分别为100、 98和96； 以上述培养条件继续 培养8天的细胞密度分别为3.61、 2.86和2.64g/L。 0045 实施例4 0046 雨生红球藻在室外1000L柱式光反应器中,在无氮条件下培养10天得到厚壁孢子 藻液， 经重力沉降后得到细胞。
21、密度为40g/L的浓缩藻液， 置于冰箱保鲜室5摄氏度中冷驯化 24小时； 之后在-5摄氏度下冻结成冰并继续冻存75天。 之后置于室温下融化， 而后以含 4mmol/L硝酸钠的BBM培养基稀释上述融化后浓缩藻液至细胞密度为0.3g/L， 接种于1000L 柱式光反应器中置于室外自然光照射下培养， 培养过程中持续通入1CO2的空气培养。 每 两天采样， 监测细胞生长情况。 培养12天后的细胞密度为2.04g/L。 0047 对所公开的实施例的上述说明， 使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般 原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现， 未予以详细说明 和局部放大呈现的部分， 为现有技术， 在此不进行赘述。 因此， 本发明将不会被限制于本文 所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和特点相一致的最宽的范围。 说明书 4/4 页 6 CN 107058110 A 6 。