技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类丙烯酰胺类化合物。该类化合物可用于制备具有抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)作用的药物。本发明还涉及该类化合物的制备方法以及含有它们的药物组合。
背景技术
乙型肝炎是由乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的、呈慢性携带状态的传染病。慢性乙型肝炎的预后不良，可发展为肝硬化和原发性肝癌，严重危害人类的健康。目前临床应用的抗HBV药物主要有HBV DNA聚合酶/逆转录酶抑制剂核苷类似物和免疫调节剂干扰素。
核苷类似物是以核苷为基本构架，通过碱基或戊糖环的结构变化而衍生出的一系列药物，如拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)、替比夫定(telbivudine)、替诺福韦(tenofovir)等。核苷类似物通过抑制HBV DNA聚合酶/逆转录酶来抑制HBV的复制，但HBV DNA聚合酶/逆转录酶受抑制后只会影响cccDNA循环，不能抑制cccDNA从头合成，不能彻底清除cccDNA，因而停药后易复发，这也是核苷类似物抗HBV所面临的瓶颈问题。此外，HBV复制过程包括逆转录的中间环节，而逆转录酶并不具有校正修复的功能，因此HBV在复制过程中容易发生变异从而导致耐药。由于核苷类似物通过抑制HBV DNA聚合酶/逆转录酶来抑制HBV复制，因此，在该类药物的作用下更容易诱发HBV DNA聚合酶段的基因突变，形成耐药变异株，引起病情反复甚至加重。
免疫调节剂主要以干扰素-α(INF-α)和聚乙二醇干扰素-α(pegylated interferon-α)为主。它们通过激发细胞内腺苷酸激酶抑制HBV蛋白质的合成，从而抑制HBV的复制，同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力起到免疫调节作用。但是，干扰素存在持续应答率较低、副作用多等缺陷。
综上所述，临床上虽有多种抗HBV药物，但由于乙型肝炎病因的复杂性、药物不能彻底清除病毒导致的“反跳”、病毒的耐药性以及药物的毒副作用等因素，现有药物仍然不能满足治疗的需要。
近年来，国内外的药学工作者从天然产物筛选、新结构类型化合物的设计合成等方面开展非核苷类抗HBV药物的研究工作，发现了一些有前景的化合物，其中不乏一些新颖的结构，这些化合物在抑制HBV DNA复制时具有不同于现有药物的作用机制。
发明内容
本发明的目的是提供一类丙烯酰胺类化合物，药理实验证明，该类化合物具有良好的抗HBV活性，对拉米夫定及恩替卡韦耐药的HepG2A64细胞(突变位点：rtLl80M+rtM204V+rtTl84L)也有较强的抑制作用。
本发明的另一目的是提供一种上述化合物的制备方法。
本发明的第三目的是提供一种上述化合物在药物方面的用途。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
本发明涉及结构如通式I所示的化合物，异构体，包括任何立体异构体或其消旋体或其顺反异构体或其混合物，或其药学上可接受的盐，
其中：
R1代表任意取代的苯基，其取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氨基烷氧基或C1-C6酯基；
R2代表氢或卤素；
R3代表氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基或C1-C6酯基；
R4代表任意取代的C1-C6烷氨基，其取代基选自苯基、羟基苯基、卤代苯基、C1-C6烷基苯基、C1-C6烷基、C1-C6羟基烷基或苯取代的C1-C6烷基。
在一种优选方案中，R1中的取代基选自氟、溴、氯、羟基、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4烷氨基烷氧基。
在另一种优选方案中，R1中的取代基选自氟、溴、氯、羟基、硝基、氰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或二甲氨基乙氧基。
在一种优选方案中，R2代表氢、氯或溴。
在一种优选方案中，R3代表氢、氟、氯、溴、碘、硝基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C1-C4烷氧基。
在另一种优选方案中，R3代表氢、氟、氯、溴、碘、硝基、甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基或乙氧基。
在一种优选方案中，R4代表任意取代的C1-C4烷氨基。
在另一种优选方案中，R4中的取代基选自苯基、羟基苯基、卤代苯基、C1-C4烷基苯基、C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基或苯取代的C1-C4烷基。
在另一种优选方案中，R4代表(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基、(1-羟基-3-甲基)-丁-2-胺基、(1-羟基-3-甲基)-戊烷-2-胺基。
进一步地，通式I所述化合物优选自下列化合物：
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-苯基丙烯-2-基}苯甲酰胺(I1)；
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-1-(4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I2)；
(S,Z)-2-氟-N-{3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-苯基丙烯-2-基}苯甲酰胺(I3)；
(S,Z)-N-{1-(4-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I4)；
(S,Z)-N-{1-(2-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I5)；
(S,Z)-N-{1-(4-氰基苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I6)；
(S,Z)-N-{1-(2-氯苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I7)；
(S,Z)-N-{3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-间甲苯基-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I8)；
(S,E)-N-{1-溴-1-(2-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I9)；
(S,E)-N-{1-溴-1-(4-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I10)；
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-苯基-1-丙烯-2-基}-2-氟苯甲酰胺(I11)；
(S,E)-N-{1-溴-1-(4-氰基苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I12)；
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-间甲苯基-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I13)；
(S,E)-N-{1-溴-1-[4-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I14)。
本发明公开了一种通式I所述化合物的制备方法，其中，
a)当R2为氢时，其合成路线如下：
该路线的具体制备方法包括如下步骤：将苯甲酰氯或其衍生物与甘氨酸反应制得苯甲酰甘氨酸衍生物(II)，II与苯甲醛衍生物或芳杂环基甲醛衍生物在乙酸酐(Ac2O)和乙酸钠(AcONa)存在下生成4-亚甲基-2-苯基恶唑-5(4H)-酮衍生物(III)，在溶剂氯仿中III与胺类化合物反应生成通式I化合物；具体的合成路线如下：
b)当R2为氯时，其合成路线如下：
该路线的具体制备方法包括如下步骤：将苯甲酰氯或其衍生物与甘氨酸反应制得苯甲酰甘氨酸衍生物(II)，II与苯甲醛衍生物或芳杂环基甲醛衍生物在乙酸酐(Ac2O)和乙酸钠(AcONa)中反应生成4-亚甲基-2-苯基恶唑-5(4H)-酮衍生物(III)，在有机溶剂中III与胺类化合物反应0-72小时，采用的反应温度为-5℃至回流，生成中间体(IV)，IV与磺酰氯反应生成目标产物(I)，采用的反应温度为-5℃至25℃；具体合成路线如下：
c)当R2为溴时，其合成路线如下：
该路线的具体制备方法包括如下步骤：将苯甲酰氯或其衍生物与甘氨酸反应制得苯甲酰甘氨酸衍生物(II)，II与苯甲醛衍生物或芳杂环基甲醛衍生物在乙酸酐(Ac2O)和乙酸钠(AcONa)中反应生成4-亚甲基-2-苯基恶唑-5(4H)-酮衍生物(III)，在有机溶剂中III与胺类化合物反应0-72小时，采用的反应温度为-5℃至回流，生成中间体(IV)，IV与溴单质在含有碳酸钙的有机溶剂中反应生成目标产物(I)，采用的反应温度为-5℃至25℃；合成路线如下：
由III制备通式I化合物或由III制备IV的步骤中，所采用的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙二醇、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈、四氢呋喃、吡啶、1,2-二氯乙烷、甲苯或二氧六环中的一种或多种，优先采用氯仿、二氯甲烷、乙二醇；采用的反应温度为0℃至回流。
由IV制备通式I化合物的特征在于，采用的溶剂选自氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈、四氢呋喃、吡啶、1,2-二氯乙烷、甲苯或二氧六环中的一种或多种，优先采用氯仿、二氯甲烷；采用的反应温度为-5℃至25℃。
这些中间体或目标化合物均可按照常规分离技术加以纯化，并且根据需要将其转化为与可药用酸的加成盐。
本发明还提供了一种药物组合物，它以上述的化合物、异构体、或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的辅料。在该组合物中，活性成分除了上述化合物、异构体、或其药学上可接受的盐以外，还可以包括其他抗HBV药物或核苷类抗HBV药物，例如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦联合应用，另外还可以与干扰素联合应用等等。
除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：
“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。含1－4个碳原子的烷基称为低级烷基。当低级烷基没有取代基时，称其为未取代的低级烷基。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基。
“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
“羟基”表示-OH基团。
“氰基”表示-CN基团。
“硝基”表示-NO2基团。
“氰基”表示-CN基团。
“卤代烷基”表示卤素取代的烷基，优选如上所定义的卤素取代的低级烷基，它被一个或多个相同或不同的卤原子取代，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“烷氨基”表示-NH-(烷基)、-N(烷基)2，其中这里的烷基可以为取代或非取代的烷基。代表性实例包括但不限于甲氨基、乙氨基、二甲氨基等。
“烷氨基烷氧基”表示烷氧基上的至少一个氢为烷氨基取代的基团，例如二甲氨基甲氧基、二甲氨基乙氧基、甲氨基乙氧基等。
“酯基”表示-C(O)O-烷基基团。
“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：
(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、天冬氨酸、硬脂酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等。
(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺、奎宁等。
“药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。
“任意取代的”是指“取代或非取代的”。
丙烯酰胺类化合物是根据多靶点药物分子设计理念设计合成的具有较好的抗HBV活性的一类化合物。研究发现，该类化合物不仅具有较好的抗HBV活性，能有效抑制HBVDNA的复制，对拉米夫定及恩替卡韦耐药的HepG2A64细胞(突变位点：rtLl80M+rtM204V+rtTl84L)也有较强的抑制作用。前期作用机制研究表明，该类化合物抗HBV的作用机制新颖，不同于现有的核苷类药物，对HBV DNA聚合酶或HBV逆转录酶无抑制作用。本发明所提供丙烯酰胺类化合物、其异构体、或其药学上可接受的盐可应用在制备抗HBV药物中，具有优异的潜在应用前景。
附图说明
图1是化合物I2、ETV、3TC对HepG2A64HBV DNA的抑制作用。
图中自右边起自上而下依次为3TC、ETV和I2。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-苯基丙烯-2-基}苯甲酰胺(I1)
甘氨酸(0.75g,0.01mol)溶于氢氧化钠(1.2g,0.03mol)溶液中，冰水浴冷却至0℃，滴加苯甲酰氯(2.34mL,0.02mol)，搅拌反应半小时后，反应液恢复至室温后，加入盐酸溶液至有大量白色固体析出，调剂PH至2左右，过滤析出固体，固体用水多次洗涤后烘干成白色粉末固体苯甲酰甘氨酸(1.492g,83％)。苯甲酰甘氨酸(0.537g,3mmol)、无水乙酸钠(0.246g,3mmol)、苯甲醛(0.306mL,3mmol)三种混合物中，加入乙酸酐(1.5mL)，在100℃的油浴温度下冷凝回流反应3h，冷却后用二氯甲烷萃取，有机层用饱和食盐水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除溶剂后得黄色固体(Z)-4-亚苄基-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(0.68g,91％)。(Z)-4-亚苄基-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(0.249g,1mmol)先用三氯甲烷10mL溶解后，在冰水浴下冷却至0℃，滴加10mL用三氯甲烷溶解的L-苯丙氨醇(0.151g,1mmol)，反应4h后，加入相同量的无水碳酸钙(0.1g,1mmol)，滴加适量溴液，同样在冰水浴冷却下反应半小时，加入五水合硫代硫酸钠适量至有白色浑浊产生，最后用二氯甲烷进行萃取，有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除溶剂后得黄色固体(0.136g,29％)。
m.p.89℃-90℃；
ESI-MS:m/z 479[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.34-2.56(m,2H,CH2),2.92-3.14(m,2H,CH2),3.95-4.02(m,1H,CH),7.04-7.05(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),7.11-7.19(m,4H,Ar-H),7.20-7.25(m,2H,Ar-H),7.47-7.54(m,3H,Ar-H),7.56-7.61(m,2H,Ar-H),7.71-7.76(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.97-8.00(d,2H,J＝7.2Hz,Ar-H),9.89-9.94(s,1H,NH).
实施例2
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-1-(4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I2)
按实施例1的类似方法，使用苯甲酰甘氨酸(2.02g,11.3mmol)、对羟基苯甲醛(1.38g,11.3mmol)反应得到(Z)-4-(4-羟基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(2.358g,78.7％)；(Z)-4-(4-羟基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(3.684g,13.9mmol)、L-苯丙氨醇(2.1g,13.9mmol)反应20h后滴加适量溴液反应得到黄色标题化合物(3.6g,18％)。
m.p.220℃-224℃；
ESI-MS:m/z 495[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.80-2.96(m,2H,CH2),3.41-3.52(m,2H,CH2),4.11-4.26(m,1H,CH),6.81-6.86(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.10-7.16(m,1H,Ar-H),7.19-7.30(m,4H,Ar-H),7.53-7.59(m,3H,Ar-H),7.93-7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),8.04-8.09(m,1H,Ar-H),8.13-8.17(m,2H,Ar-H),8.59-8.60(s,1H,NH),9.93-10.04(s,1H,OH),10.51-10.55(s,1H,NH).
实施例3
(S,Z)-2-氟-N-{3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-苯基丙烯-2-基}苯甲酰胺(I3)
甘氨酸(3.75g,0.05mol)溶于氢氧化钠(6g,0.15mol)溶液中，冰水浴冷却至0℃，滴加邻氟苯甲酰氯(6mL,0.05mol)，搅拌反应1小时后，反应液恢复至室温后，加入盐酸溶液至有大量白色固体析出，调剂PH至2左右，过滤析出固体，固体用水多次洗涤后烘干成白色粉末固体邻氟苯甲酰甘氨酸(2.64g,27％)。邻氟苯甲酰甘氨酸(1.93g,0.01mol)、无水乙酸钠(0.82g,0.01mol)、苯甲醛(1.02mL,0.01mol)三种混合物中，加入乙酸酐1mL，在100℃的油浴下冷凝回流反应4h，用二氯甲烷萃取，有机层用饱和食盐水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除溶剂后得绿色固体(Z)-4-亚苄基-2-(2-氟苯基)-恶唑-5(4H)-酮(2.43g,89％)。(Z)-4-亚苄基-2-(2-氟苯基)-恶唑-5(4H)-酮(2.4g,9mmol)先用5mL三氯甲烷溶解后，在冰水浴下冷却至0℃，滴加10mL用三氯甲烷溶解的L-苯丙氨醇(1.359g,9mmol)，反应8h后，二氯甲烷进行萃取，有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压去除溶剂后得黄色固体(1.504g,40％)。
m.p.104℃-106℃；
ESI-MS:m/z 419[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.70-2.91(m,2H,CH2),3.25-3.47(m,2H,CH2),3.94-4.05(m,1H,CH),4.73-4.79(t,1H,OH),6.98-7.03(s,1H,CH),7.13-7.18(dd,1H,J＝8Hz,Ar-H),7.21-7.25(d,4H,J＝4Hz,Ar-H),7.27-7.40(m,5H,Ar-H),7.53-7.59(m,2H,Ar-H),7.61-7.68(m,1H,Ar-H),7.71-7.79(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),9.74-9.79(s,1H,NH).
实施例4
(S,Z)-N-{1-(4-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I4)
按实施例3的类似方法，使用甘氨酸(0.75g,0.01mol)、苯甲酰氯(2.34mL,0.02mol)反应得到苯甲酰甘氨酸；苯甲酰甘氨酸(0.537g,3mmol)、4-溴苯甲醛(0.555g,3mmol)反应得到(Z)-4-(4-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(4-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(0.66g,2mmol)、L-苯丙氨醇(0.3g,2mmol)反应得到黄色标题化合物(0.394g,41％)。
m.p.84℃-86℃；
ESI-MS:m/z 479[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):1.29-1.49(m,2H,CH2),1.86-2.05(m,2H,CH2),2.54-2.63(m,1H,CH),3.27-3.34(t,1H,OH),5,51-5.57(s,1H,CH),5.72-5.77(m,1H,Ar-H),5.80-5.84(d,4H,J＝4.4Hz,Ar-H),6.00-6.05(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),6.05-6.19(m,3H,Ar-H),6.43-6.49(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),6.51-6.58(d,2H,J＝7.2Hz,Ar-H),8.43-8.48(s,1H,NH).
实施例5
(S,Z)-N-{1-(2-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I5)
按实施例3的类似方法，使用甘氨酸(0.75g,0.01mol)、苯甲酰氯(2.34mL,0.02mol)反应得到苯甲酰甘氨酸；苯甲酰甘氨酸(0.537g,3mmol)、2-溴苯甲醛(0.35mL,3mmol)反应得到(Z)-4-(2-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(2-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(0.492g,1.5mmol)、L-苯丙氨醇(0.227g,1.5mmol)反应得到黄色标题化合物(0.309g,43％)。
m.p.97℃-100℃；
ESI-MS:m/z 479[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.69-2.89(m,2H,CH2),3.21-3.46(m,2H,CH2),3.93-4.02(m,1H,CH),4.68-4.74(t,1H,OH),5.71-5.72(s,1H,R＝CH),6.98-7.01(s,1H,Ar-H),7.10-7.16(m,2H,Ar-H),7.16-7.21(m,2H,Ar-H),7.22-7.24(s,2H,Ar-H),7.25-7.29(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.42-7.47(m,2H,Ar-H),7.62-7.66(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.83-7.89(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.92-7.97(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),9.80-9.86(s,1H,NH).
实施例6
(S,Z)-N-{1-(4-氰基苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I6)按实施例3的类似方法，使用甘氨酸(0.75g,0.01mol)、苯甲酰氯(2.34mL,0.02mol)反应得到苯甲酰甘氨酸；苯甲酰甘氨酸(1.79g,0.01mol)、4-氰基苯甲醛(1.31g,0.01mol)反应得到(Z)-4-(4-氰基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(4-氰基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(2.6g,9.5mmol)、L-苯丙氨醇(1.43g,9.5mmol)反应得到黄色标题化合物(1.576g,37％)。
m.p.93℃-95℃；
ESI-MS:m/z 426[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.70-2.90(m,2H,CH2),3.27-3.46(m,2H,CH2),3.94-4.04(m,1H,CH),4.69-4.74(t,1H,OH),6.94-6.97(s,1H,CH),7.12-7.19(m,1H,Ar-H),7.21-7.24(d,4H,J＝4.4Hz,Ar-H),7.45-7.52(t,2H,Ar-H),7.54-7.59(m,1H,Ar-H),7.61-7.65(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.75-7.80(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.90-7.96(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),9.94-10.00(s,1H,NH).
实施例7
(S,Z)-N-{1-(2-氯苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I7)
按实施例3的类似方法，使用甘氨酸(0.75g,0.01mol)、苯甲酰氯(2.34mL,0.02mol)反应得到苯甲酰甘氨酸；苯甲酰甘氨酸(1.253g,7mmol)、2-氯苯甲醛(0.79mL,7mmol)反应得到(Z)-4-(2-氯亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(2-氯亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(1.42g,5mmol)、L-苯丙氨醇(0.755g,5mmol)反应得到黄色标题化合物(0.825g,38％)。
m.p.106℃-108℃；
ESI-MS:m/z 435 436 437[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.68-2.90(m,2H,CH2),3.17-3.48(m,2H,CH2),3.89-4.05(m,1H,CH),4.65-4.76(t,1H,OH),7.04-7.08(s,1H,CH),7.11-7.18(m,1H,Ar-H),7.16-7.31(m,5H,Ar-H),7.42-7.50(t,2H,Ar-H),7.50-7.56(d,2H,J＝6.8Hz,Ar-H),7.84-7.93(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.93-8.02(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),9.77-9.92(s,1H,NH).
实施例8
(S,Z)-N-{3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-间甲苯基-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I8)
按实施例3的类似方法，使用甘氨酸(0.75g,0.01mol)、苯甲酰氯(2.34mL,0.02mol)反应得到苯甲酰甘氨酸；苯甲酰甘氨酸(1.253g,7mmol)、3-甲基苯甲醛(0.82mL,7mmol)反应得到(Z)-4-(3-甲基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(3-甲基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(1.052g,4mmol)、L-苯丙氨醇(0.604g,4mmol)反应得到白色标题化合物(0.679g,41％)。
m.p.69℃-71℃；
ESI-MS:m/z 415[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,400MHz,δppm):2.18-2.21(s,3H,CH3),2.71-2.87(m,2H,CH2),3.26-3.44(m,2H,CH2),3.94-4.04(m,1H,CH),4.68-4.73(t,1H,OH),6.99-7.04(s,1H,CH),7.05-7.09(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.11-7.18(m,1H,Ar-H),7,18-7,20(s,1H,Ar-H),7.21-7.23(d,4H,J＝4.4Hz,Ar-H),7.28-7.33(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.45-7.52(t,2H,Ar-H),7.53-7.57(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.74-7.79(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.92-7.98(d,2H,J＝7.2Hz,Ar-H),9.80-9.85(s,1H,NH).
实施例9
(S,E)-N-{1-溴-1-(2-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I9)
按实施例1的类似方法，使用苯甲酰甘氨酸(0.537g,3mmol)、2-溴苯甲醛(0.35mL,3mmol)反应得到(Z)-4-(2-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(2-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(1.76g,5.36mmol)、L-苯丙氨醇(0.81g,5.36mmol)反应13h后滴加适量溴液反应得到白色标题化合物(0.508g,17％)。
m.p.58℃-59℃；
ESI-MS:m/z 559[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,300MHz,δppm):2.31-2.64(m,2H,CH2),2.92-3.14(m,2H,CH2),3.62-3.71(m,1H,CH),4.48-4.61(m,1H,OH),7.01-7.03(s,1H,Ar-H),7.03-7.04(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),7.10-7.13(d,2H,J＝6.8Hz,Ar-H),7.13-7.17(m,2H,Ar-H),7.21-7.24(m,2H,Ar-H),7.25-7.28(m,1H,Ar-H),7.34-7.37(m,1H,Ar-H),7.50-7.54(d,2H,J＝6.4Hz,Ar-H),7.62-7.66(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.98-8.02(m,2H,Ar-H),9.87-10.00(s,1H,NH).
实施例10
(S,E)-N-{1-溴-1-(4-溴苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I10)
按实施例1的类似方法，使用苯甲酰甘氨酸(1.79g,0.01mol)、4-溴苯甲醛(1.85g,0.01mol)反应得到(Z)-4-(4-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(4-溴亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(2.95g,9mmol)、L-苯丙氨醇(1.359g,9mmol)反应20h后滴加适量溴液反应得到白色标题化合物(0.752g,15％)。
m.p.98℃-101℃；
ESI-MS:m/z 558[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,300MHz,δppm):2.38-2.60(m,2H,CH2),3.00-3.06(m,2H,CH2),3.71-3.77(m,1H,CH),5.27-5.32(m,1H,OH),7.14-7.16(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),7.17-7.21(m,4H,Ar-H),7.22-7.27(m,2H,Ar-H),7.50-7.53(m,2H,Ar-H),7.53-7.62(m,2H,Ar-H),7.83-7.88(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.96-7.99(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),9.86-9.92(s,1H,NH).
实施例11
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-苯基-1-丙烯-2-基}-2-氟苯甲酰胺(I11)
按实施例1的类似方法，使用甘氨酸(3.75g,0.05mol)、邻氟苯甲酰氯(6mL,0.05mol)反应得到邻氟苯甲酰甘氨酸；邻氟苯甲酰甘氨酸(5.6g,0.028mol)、苯甲醛(2.86mL,0.028mol)反应得到(Z)-4-亚苄基-2-(2-氟苯基)-恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-亚苄基-2-(2-氟苯基)-恶唑-5(4H)-酮(3.66g,0.0137mol)、L-苯丙氨醇(2.07g,0.0137mol)反应6h后滴加适量溴液反应得到白色标题化合物(1.089g,16％)。
m.p.123℃-125℃；
ESI-MS:m/z 497[M+H]+.
实施例12
(S,E)-N-{1-溴-1-(4-氰基苯基)-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I12)
按实施例1的类似方法，使用苯甲酰甘氨酸(1.79g,0.01mol)、4-氰基苯甲醛(1.31g,0.01mol)反应得到(Z)-4-(4-氰基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(4-氰基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(2.6g,9.5mmol)、L-苯丙氨醇(1.43g,9.5mmol)反应8h后滴加适量溴液反应得到白色标题化合物(0.717g,15％)。
m.p.96℃-99℃；
ESI-MS:m/z 504[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,300MHz,δppm):2.37-2.64(m,2H,CH2),2.99-3.22(m,2H,CH2),3.70-3.90(m,1H,CH),7.00-7.05(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.13-7.20(m,3H,Ar-H),7.37-7.41(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.48-7.53(t,2H,Ar-H),7.57-7.62(t,1H,Ar-H),7.65-7.68(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.97-7.99(m,2H,Ar-H),9.93-9.99(s,1H,NH).
实施例13
(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-间甲苯基-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I13)
按实施例1的类似方法，使用苯甲酰甘氨酸(1.253g,7mmol)、3-甲基苯甲醛(0.82mL,7mmol)反应得到(Z)-4-(3-甲基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(3-甲基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(2.06g,7.6mmol)、L-苯丙氨醇(1.15g,7.6mmol)反应20h后滴加适量溴液反应得到白色标题化合物(0.523g,14％)。
m.p.97℃-101℃；
ESI-MS:m/z 493[M+H]+；
1H-NMR(DMSO,300MHz,δppm):2.23-2.25(s,3H,CH3),2.36-2.55(m,2H,CH2),2.93-3.16(m,2H,CH2),3.66-3.75(m,1H,CH),7.02-7.05(d,1H,J＝6.4Hz,Ar-H),7.11-7.20(m,8H,Ar-H),7.47-7.53(t,2H,Ar-H),7.62-7.67(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.96-8.00(d,2H,J＝6.8Hz,Ar-H),9.86-9.92(s,1H,NH).
实施例14
(S,E)-N-{1-溴-1-[4-(2-二甲基氨基-乙氧基)-苯基]-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(I14)
按实施例1的类似方法，使用苯甲酰甘氨酸(2.02g,11.3mmol)、对羟基苯甲醛(1.38g,11.3mmol)反应得到(Z)-4-(4-羟基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮；(Z)-4-(4-羟基亚苄基)-2-苯基恶唑-5(4H)-酮(3.684g,13.9mmol)、L-苯丙氨醇(2.1g,13.9mmol)反应20h后滴加适量溴液反应得到(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-1-(4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺。(S,E)-N-{1-溴-3-[(1-羟基-3-苯基)-2-丙胺基]-1-(4-羟基苯基)-3-氧代-1-丙烯-2-基}苯甲酰胺(2.232g,4.5mmol)与2-二甲氨基乙基氯盐酸盐(0.78g,5.4mmol)反应得到白色标题化合物(0.331g,13％)。
m.p.181℃-183℃；
ESI-MS:m/z 644[M+2K]+.
以下是本发明的代表化合物的部分药理试验及结果：
1、MTT实验
MTT实验研究化合物的体外细胞毒性。实验方法如下：取处于指数生长期状态良好的HepG2 2.2.15细胞一瓶，制成每毫升含5×104～7×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔160μL，置恒温CO2培养箱中培养24小时。换液，加入不同浓度的受试化合物200μL(化合物用DMSO溶解后用培养液稀释)，继续培养72小时。将5mg/mLMTT 20μL加入96孔板中，培养箱中反应6小时。弃上清，沉淀用200μL DMSO溶解完全，用酶标仪检测各吸光度，观察化合物对2.2.15细胞生长抑制情况。选择抗HBV药物拉米夫定(3TC)作为阳性对照。实验结果如表1所示。
细胞抑制率＝(阴性对照组OD值－受试物组OD值)/阴性对照组OD值×100％。
表1 本发明代表化合物对HepG2 2.2.15细胞的毒性(TC50,μM)
结果表明，此类化合物细胞毒性较小，部分化合物的TC50大于200μM。
2、抗HBV DNA活性
根据化合物对2.2.15细胞毒性的结果，分别取各化合物的无毒浓度作为高剂量组，并设中、低剂量组，用含2％FBS的DMEM配制成药液，另设LAM 50μmol/L阳性对照组和病毒对照组，分别加入96孔细胞培养板中，0.2mL/孔，每浓度3孔。每3天换液一次，第6天收集细胞上清液，细胞用0.5％NP-40裂解。细胞裂解液用DNA Extraction Soln 1.0提取液提取细胞总DNA，RT-PCR法检测细胞中HBV DNA的载量。实验结果如表2所示。
其中：A＝log﹥50％药物浓度，B＝log﹤50％药物浓度，C＝A-B
表2 本发明代表化合物对HepG2 2.2.15细胞HBV DNA复制的抑制活性(IC50,μM)
表2表明此类化合物对HBV DNA复制具有一定的抑制活性，其中化合物I2、I10和I14的IC50均低于10μM，具有较好的抗HBV活性。
3、抗耐药HBV活性
以解放军302医院传染病研究所构建的拉米夫定、恩替卡韦联合耐药细胞HepG2A64(突变位点：rtLl80M+rtM204V+rtTl84L)为试验研究对象，通过测定化合物对HepG2A64细胞HBV DNA复制的影响作用，判定这三个耐药突变位点对目标化合物敏感性的变化情况，评价目标化合物抗耐药HBV活性。
根据化合物对HepG2A64细胞毒性的结果，分别取化合物0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L 5个浓度，用含2％FBS的DMEM配制成药液，另设恩替卡韦(ETV)和拉米夫定(3TC)阳性对照组和病毒对照组，分别加入96孔细胞培养板中，0.2mL/孔，每浓度3孔。每3天换液一次，第6天收集细胞上清液，细胞用0.5％NP-40裂解。细胞裂解液用DNA Extraction Soln 1.0提取液提取细胞总DNA，RT-PCR法检测细胞中HBV DNA的载量。实验结果如图1所示。
实验结果表明化合物I2能够有效抑制HepG2A64细胞HBV DNA表达量，IC50值为5.39μM(图1)。对比HepG2 2.2.15细胞的IC50值为3.46μM，上升倍数在l倍之内，可认为化合物I2未产生耐药。而阳性对照恩替卡韦(ETV)和拉米夫定(3TC)对病毒的抑制作用却并不理想，恩替卡韦作用于HepG2A64细胞的IC50值(9.67μM)与HepG2 2.2.15细胞的IC50值(0.0059μM)相比，上升了1681倍。拉米夫定的药物浓度在10μM时仍然不能够抑制75％病毒的复制，说明拉米夫定对HepG2A64细胞已经耐药，而这些突变位点对I2依然敏感。