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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610627435.8 (22)申请日 2016.08.03 (71)申请人 广州白云山医药集团股份有限公司 白云山化学制药厂 地址 510000 广东省广州市白云区同和同 宝路78号 (72)发明人 罗春李庆韩贵良何星垚 范玉珍 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 李佳佳 (51)Int.Cl. C12P 35/04(2006.01) C12N 11/00(2006.01) (54)发明名称 一种绿色酶法合成头孢克洛的方法 (57)摘。
2、要 本发明涉及一种绿色酶法合成头孢克洛的 方法， 所述方法包括如下步骤： S1： 将母核7-ACCA 加入到缓冲液中； S2： 于pH为58条件下加入D- 对羟基苯甘氨酸酯衍生物或其盐和/或D-对羟基 苯甘氨酸酰胺、 固定化头孢克洛合成酶， 于温度 为530、 pH为6.27.8条件下反应13小时， 反应一段时间后， 加入晶种析晶， 反应结束后分 离出反应液和固定化头孢克洛合成酶得头孢克 洛粗品； S3： 将步骤S2所得粗品经过酸解溶清、 过 滤、 重结晶后即得头孢克洛； 本发明采用酶催化 合成法， 与传统的化学合成法相比， 操作简便、 成 本低、 缩短了合成周期， 提高了生产效率、 总体收 。
3、率高， 可控性强， 符合工业化生产的需求。 权利要求书1页 说明书5页 CN 106222230 A 2016.12.14 CN 106222230 A 1.一种绿色酶法合成头孢克洛的方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： S1： 将母核7-ACCA加入到缓冲液中； S2： 于pH为58条件下加入D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物或其盐和/或D-对羟基苯甘氨 酸酰胺、 固定化头孢克洛合成酶， 于温度为530、 pH为6.27.8条件下反应13小时， 反 应一段时间后， 加入晶种析晶， 反应结束后分离出反应液和固定化头孢克洛合成酶得头孢 克洛粗品； S3： 将步骤S2所得粗品经过酸解溶清、 过滤、。
4、 重结晶后即得头孢克洛； 其中， 所述固定化头孢克洛合成酶为固定化青霉素G酰化酶II、 青霉素酰化酶IPA-IIP、 青霉素酰化酶SIPA-III、 青霉素酰化酶SIPA-IV或青霉素酰化酶SIPA-V中的一种或几种。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲 液， 所述缓冲液的pH为5.08.0。 3.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述固定化头孢克洛合成酶为固定化青霉素 G酰化酶II。 4.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述固定化头孢克洛合成酶在反应体系中的 浓度为555u/mL。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于。
5、， 步骤S2中反应直至7-ACCA的残留浓度为0 0.8mg/mL时反应结束。 6.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述步骤S3中， 所述酸解的pH为0.31.5。 7.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述重结晶的反应温度为040、 反应pH为 4.55.5。 8.根据权利要求7所述方法， 其特征在于， 所述重结晶的反应温度为2035、 反应pH 为5.0。 9.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤S2中， 加入晶种的时间为反应开始后0 30min。 10.权利要求19任一所述方法制备得到的头孢克洛。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106222230 A 2 一种绿。
6、色酶法合成头孢克洛的方法 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种绿色酶法合成头孢克洛的方法。 背景技术 0002 头孢克洛 （Cefaclor） 是第二代口服头孢菌素衍生物， 是Lilly 公司在1975年报道 的新药， 1979年获FDA批准， 1982年在美国上市， 1985年即取代头孢氨苄为当年世界首位畅 销抗生素， 1993年其专利期满。 1994年2月国内将头孢克洛以商品名 “新达罗” 推向中国市 场。 头孢克洛对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很强的杀灭作用。 对肺炎球菌、 溶 血性链球菌、 淋病奈瑟菌及厌氧菌等有良好活性。 临床主要用于呼吸道感染, 如咽炎。
7、、 肺 炎、 尿路感染， 如肾盂肾炎、 膀胱炎以及软组织感染。 多年来头孢克洛一直稳居口服头孢类 抗生素全球销售额之最。 0003 目前， 已报道的合成头孢克洛的方法主要是采用化学合成法， 基本都是以7-氨基- 3-氯-3-头孢烯-4-酸 （7-ACCA） 作为关键中间体进行合成的。 文献和专利报道的合成方法主 要有以下两种： 一种是以7-ACCA的对硝基苄酯为起始物料， 与N-叔丁氧羰基-D- -苯甘氨酸 反应， 与对甲苯磺酸成盐后经过水解脱保护得到头孢克洛?DMF络合物， 络合物经过脱掉DMF 后才得到头孢克洛 （Journal of Medicinal Chemistry,1975,18。
8、,403） 。 第二种方法是以美 国专利US3925327为代表， 7-ACCA在BSA保护下， 与苯甘氨酸邓钾盐和氯甲酸甲酯形成混合 酸酐得到头孢克洛水合物。 这两种方法反应步骤较长， 故起始物和中间体的反应活性部位 均需要先加以保护， 收率都不高， 要用到大量的有机溶剂， 产生的废液很多， 环保压力大。 同 时还需要用到超低温的冷冻机组或者液氮来满足低温反应要求， 能耗极大， 对溶剂和起始 物料的水分要求极高， 反应条件苛刻， 苛刻的工艺条件导致生产风险比较大。 0004 因此， 仍需寻求一种收率高、 反应时间短、 绿色环保的合成头孢克洛的方法。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现。
9、有技术的不足， 提供一种绿色酶法合成头孢克洛的方 法， 本发明提供的方法得到的产品收率和纯度较高， 对底物的选择性更强。 0006 本发明的另一目的在于提供上述方法合成得到的头孢克洛。 0007 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 一种绿色酶法合成头孢克洛的方法， 所述方法包括如下步骤： S1： 将母核7-ACCA加入到缓冲液中； S2： 于pH为58条件下加入D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物或其盐和/或D-对羟基苯甘氨 酸酰胺、 固定化头孢克洛合成酶， 于温度为530、 pH为6.27.8条件下反应13小时， 反 应一段时间后， 加入晶种析晶， 反应结束后分离出反应液和固定化头孢克洛合成酶。
10、得头孢 克洛粗品； S3： 将步骤S2所得粗品经过酸解溶清、 过滤、 重结晶后即得头孢克洛； 其中， 所述固定化头孢克洛合成酶为固定化青霉素G酰化酶II、 青霉素酰化酶IPA-IIP、 说明书 1/5 页 3 CN 106222230 A 3 青霉素酰化酶SIPA-III、 青霉素酰化酶SIPA-IV或青霉素酰化酶SIPA-V中的一种或几种。 0008 在本发明中， 所述D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物包括但不限于D-苯甘氨酸甲酯及其 盐酸盐、 硫酸盐、 甲磺酸盐； D-苯甘氨酸乙酯及其盐酸盐、 硫酸盐、 甲磺酸盐； D-对羟基苯甘 氨酸异丙酯及其盐酸盐、 硫酸盐、 甲磺酸盐； D-苯甘氨酸乙二醇酯。
11、及其盐酸盐、 硫酸盐、 甲磺 酸盐； 或其中任意两种或两种以上的混合物。 0009 现有技术中在合成头孢克洛时， 均选用将母核7-ACCA溶解在水中， 而这使得体系 的pH在反应过程中波动很大， 需要不断加入酸液或碱液来调节体系的pH， 而这必将造成部 分7-ACCA分解， 对头孢克洛的合成有影响， 进而影响到产物的收率和纯度； 发明人发现， 当 将母核7-ACCA加入缓冲液中后， 体系的pH较为稳定， 波动范围很小， 从而确保了头孢克洛稳 定的合成。 0010 优选地， 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液， 所述缓冲液的pH为5.0 8.0； 更为优选地， 所述缓冲液的pH为7。
12、.5。 0011 优选地， 所述固定化头孢克洛合成酶为固定化青霉素G酰化酶II。 与普通的头孢克 洛合成酶相比， 该酶的用量更少， 催化效率更高， 能循环使用250300批次， 比普通酶的循 环次数高出50100批次。 0012 优选地， 所述固定化头孢克洛合成酶在反应体系中的浓度为555u/mL。 0013 优选地， 步骤S2中反应直至7-ACCA的残留浓度为00.8mg/mL时反应结束。 0014 优选地， 所述步骤S3中， 所述酸解溶清的pH为0.31.5， 所述溶清混合液用的酸为 0.512mol/L的盐酸、 硫酸、 甲酸、 乙酸或三氟乙酸； 更为优选的， 所述酸解溶清的pH为0.5 。
13、1.0。 0015 优选地， 所述重结晶的反应温度为040、 反应pH为4.55.5； 更为优选地， 所述 重结晶的反应温度为2035、 反应pH为5.0。 0016 在本发明中， 重结晶所用的碱包括但不限于三甲胺、 三乙胺、 氨水、 环己氨、 二环己 氨、 苯胺、 苯甲胺、 吡啶、 哌啶、 二异丙基乙基胺、 三丁胺、 N， N-二甲基苯胺、 正丁胺、 氢氧化 钠、 氢氧化钾、 碳酸钾、 碳酸铯、 碳酸钠、 磷酸钾或氟化铯中的一种或者两种及以上的混合 物。 0017 优选地， 所述碱的浓度为0.56mol/L， 更为优选地， 所述碱的浓度为3mol/L。 0018 在本发明中， 调混合液pH值。
14、所用的酸为无机酸或有机酸包括但不限于盐酸、 硫酸、 甲酸、 乙酸、 三氟乙酸中的一种或者两种及以上的混合物； 所用的碱为无机碱或有机碱， 包 括但不限于三甲胺、 三乙胺、 氨水、 环己氨、 二环己氨、 苯胺、 苯甲胺、 吡啶、 哌啶、 二异丙基乙 基胺、 三丁胺、 N,N-二甲基苯胺、 正丁胺、 氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钾、 碳酸铯、 碳酸钠、 磷酸 钾或氟化铯溶液中的一种或者两个及其以上的混合物。 0019 优选地， 所述步骤S1中， 母核7- ACCA与D-对羟基苯甘氨酸酯衍生物或其盐和/或 D-对羟基苯甘氨酸酰胺的摩尔比为1： 1.01.15。 0020 优选地， 步骤S2中， 加入。
15、晶种的时间为反应开始后030min， 加入浓度优选为0 0.5 （w/w） ， 更为优选的， 加入浓度为0.2% （w/w） 。 0021 优选地， 步骤S2中， 反应时间为80150min。 0022 上述方法制备得到的头孢克洛。 0023 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 说明书 2/5 页 4 CN 106222230 A 4 本发明所涉及的酶催化合成头孢克洛的方法对底物的选择性强， 本发明所选用的固定 化头孢克洛合成酶对底物D-苯甘氨酸酯衍生物和D-苯甘氨酸酰胺均有很好的催化效果； 并 且所得产品收率和纯度较高， 本发明提供的方法合成得到的头孢克洛的含量 （HPLC） 不低于。
16、 98.5%， 该反应重量收率不低于135。 0024 本发明采用绿色酶法合成头孢克洛， 合成方法简单、 经济， 避免了化学合成法中上 保护基团、 脱保护基团过程， 避免了使用有毒化学试剂， 减轻了环保压力， 降低了生产成本， 所得产品纯度高， 适合工业化应用。 本发明提供的方法不仅具有绿色环保的优点， 同时技术 先进、 经济效果显著， 能克服现有的化学合成法成本高、 大量使用有毒试剂、 生产周期长的 不足， 能完全满足工业化生产的要求。 具体实施方式 0025 下面结合实施例对本发明做进一步的描述。 这些实施例仅是对本发明的典型描 述， 但本发明不限于此。 下述实施例中所用的试验方法如无特殊。
17、说明， 均为常规方法， 所使 用的原料， 试剂等， 如无特殊说明， 均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。 0026 实施例1 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200 mLpH为7.5的磷酸盐缓 冲液和26g 7-ACCA； （2） 在pH为5的条件下加入24g左旋苯甘氨酸甲酯和16g固定化青霉素酰化酶II， 反应过 程中用3N盐酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 向反 应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 当7-ACCA浓度小于0.15%(w/w)时停止反应， 用筛网分离酶与反应液。 00。
18、27 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品35.2g， 重量收率为135.3%， 纯度99.6%。 0028 实施例2 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200 mLpH为7.5的磷酸盐缓 冲液和26g 7-ACCA； （2） 在pH为6的条件下加入15g固定化青霉素酰化酶II， 用50ml水将24g左旋苯甘氨酸甲 酯甲磺酸盐溶解后， 慢慢滴加到酶反应器中， 反应过程中用3N盐酸和3mol/L氨。
19、水维持反应 pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 向反应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一 次送检， 当7-ACCA浓度小于0.15%(w/w)时停止反应， 用筛网分离酶与反应液。 0029 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品36.1g， 重量收率为138.8%， 纯度99.7%。 0030 实施例3 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200 mLpH为7.5的。
20、磷酸盐缓 冲液和26g 7-ACCA； （2） 在pH为6.5的条件下加入17.5g左旋苯甘氨酸酰胺和16g固定化青霉素酰化酶II， 反 应过程中用3N盐酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 说明书 3/5 页 5 CN 106222230 A 5 向反应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 当7-ACCA浓度小于0.15%(w/w)时停止 反应， 用筛网分离酶与反应液。 0031 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 。
21、降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品35.7g， 重量收率为137.3%， 纯度99.5%。 0032 实施例4 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200LpH为7.5的磷酸盐缓冲 液和52kg 7-ACCA； （2） 在pH为7.5的条件下加入16kg固定化青霉素酰化酶II， 用100L水将48kg左旋苯甘氨 酸甲酯甲磺酸盐溶解后， 慢慢滴加到酶反应器中， 反应过程中用3N盐酸和3mol/L氨水维持 反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 向反应器中加入0.52kg晶种， 每30min 取样一次送检， 当7-ACC。
22、A浓度小于0.15%(w/w)时停止反应， 用筛网分离酶与反应液。 0033 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶60分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品73.0kg， 重量收率为140.3%， 纯度99.7%。 0034 对照例1 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200 mLpH为7.5的磷酸盐缓 冲液和26g 7-ACCA； （2） 在pH为5的条件下加入24g左旋苯甘氨酸甲酯和16g固定化青霉素酰化酶IPA-750， 反应过程。
23、中用3N盐酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min 后， 向反应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 随着反应的进行， 反应体系变得十 分粘稠， 无法用筛网分离酶与反应液。 0035 （3） 向反应瓶中加入200ml水后再用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得 滤液用 3 mol/L氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽 滤、 洗涤、 干燥得头孢克洛成品23.9g， 重量收率为99.9%， 纯度99.5%。 0036 对照例2 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反。
24、应器中加入200 mLpH为7.5的磷酸盐缓 冲液和26g 7-ACCA； （2） 在pH为5的条件下加入24g左旋苯甘氨酸甲酯和16g固定化青霉素酰化酶PGA-450， 反应过程中用3N盐酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min 后， 向反应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 当7-ACCA浓度小于0.67%(w/w)时体 系中头孢克洛开始水解， 此时终止反应， 用筛网分离酶与反应液。 0037 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.5。
25、5.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品27.6g， 重量收率为115.1%， 纯度99.4%。 0038 对照例3 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200 mL蒸馏水和26g 7- ACCA； （2） 在pH为5的条件下加入24g左旋苯甘氨酸甲酯和16g固定化青霉素酰化酶II， 反应过 说明书 4/5 页 6 CN 106222230 A 6 程中用3N盐酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 向反 应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 当反应结束后， 用筛网分离酶。
26、与反应液。 0039 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品31.26g， 重量收率为120.1%， 纯度98.8%。 0040 对照例4 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200mLpH为7.5的磷酸盐缓冲 液和26g 7-ACCA； 用6mol/L氨水溶液溶清后， 搅拌5分钟。 0041 （2） 向步骤 （1） 中加入24g左旋苯甘氨酸甲酯和16g固定化青霉素酰化酶II， 反应过 程中用3N盐。
27、酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 向反 应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 当反应结束后， 用筛网分离酶与反应液。 0042 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品32.53g， 重量收率为125.1%， 纯度98.6%。 0043 对照例5 （1） 检查仪器装置、 物料是否准备齐全， 向酶反应器中加入200 mLpH为9.0的磷酸盐缓 冲液和26g。
28、 7-ACCA； （2） 在pH为9的条件下加入24g左旋苯甘氨酸甲酯和16g固定化青霉素酰化酶II， 反应过 程中用3N盐酸和3mol/L氨水维持反应pH在6.87.8， 反应温度为25。 反应30min后， 向反 应器中加入0.52g晶种， 每30min取样一次送检， 当反应结束后， 用筛网分离酶与反应液。 0044 （3） 所得混合液用3mol/L盐酸调pH至0.30.8， 过滤、 抽滤、 所得滤液用 3 mol/L 氢氧化钠溶液在25调pH值至4.55.5。 降温至5下养晶30分钟后， 抽滤、 洗涤、 干燥得头 孢克洛成品28.37g， 重量收率为109.1%， 纯度97.9%。 说明书 5/5 页 7 CN 106222230 A 7 。