技术领域
本发明涉及一种新的具有肿瘤靶向、体内示踪和肿瘤治疗作用的细胞。所述细胞是一 种由H9人胚胎干细胞体外分化而来的内皮细胞，能够在静脉注射后特异性富集于肿瘤病 灶，同时还具有分子成像功能，能够在活体状态下实时监测其在体内的分布。具体说是将 海肾荧光素酶-红色荧光蛋白-自杀基因胸苷激酶三融合基因转染入这种内皮细胞，借助活 体成像系统监测荧光素酶信号来监测细胞靶向NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部 转移模型的特异性；对注射了转染三融合基因的内皮细胞的小鼠给予胸苷激酶的底物更西 洛韦，通过旁观者效应诱导内皮细胞周围肿瘤细胞的死亡。
背景技术
目前，乳腺癌已经成为全世界女性发病率最高的恶性肿瘤之一，严重地威胁着女性的 身心健康。在当今技术条件下，其原发肿瘤病灶可以通过手术进行根治，而乳腺癌所发生 的转移成为了患者的重要死因。其中，乳腺癌肺转移是最为常见的转移类型之一，多见双 肺多发转移病灶，这为手术切除造成了很大困难。目前多应用化疗进行治疗，大多数化疗 药物并不能够特异性地作用于肿瘤细胞，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时也会对正常细胞产 生一定杀伤作用，从而产生毒副作用，往往并不能获得长期生存，且花费巨大。找到一种 能够靶向多发的肿瘤病灶部位的载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对 周围的正常组织造成影响将显著提高治疗效果，减低副作用。近年来有研究应用骨髓、胚 胎或脐带血中分离得到的内皮细胞前体细胞进行试验性地肿瘤靶向治疗，虽然被证实具有 一定的有效性，但这类内皮前体细胞来源有限且不易获得，难以应用于临床。人胚胎干细 胞具有自我更新和分化的能力，其分化得到的内皮细胞在体外能够进行大规模扩增，如果 能够被证实具有肿瘤靶向性，将对应用于临床治疗具有重要意义。同时，为了观测肿瘤的 生长情况，并监测载体细胞在体内的分布、增殖和机体排斥的过程，可以应用体内分子成 像技术，其具有微创、直观、动态观察的特点，并能够对同一只动物在不同时间点进行监 测，能够很好地评估靶向治疗的疗效。
发明内容
本发明的目的在于解决目前应用于试验性肿瘤靶向治疗的内皮前体细胞来源有限、不 易获得的问题，提供了一种具有肿瘤靶向性、能够进行体内示踪并具有治疗作用的人胚胎 干细胞来源的内皮细胞。
本发明所涉及的细胞的制备和肿瘤靶向治疗、体内示踪的方法通过以下步骤实现：
1.具有肿瘤靶向、体内示踪和治疗作用的人胚胎干细胞来源的内皮细胞的制备：
(1)构建含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd 抗性的慢病毒表达质粒；
(2)用293T细胞铺六孔板，密度为1.5×106细胞/孔，用于转染；
(3)用lipo-2000将步骤(1)中构建的三融合基因慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转染 入步骤(2)中前一天铺板的293T细胞；
(4)转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于-80℃ 冰箱备用；
(5)用人胚胎干细胞来源的内皮细胞铺六孔板，密度为1×105细胞/孔，用于病毒感染；
(6)待病毒上清常温化冻后，混合2毫升不含抗生素的全培养基和1毫升病毒上清加 入步骤(5)中的内皮细胞孔内，并加入polybrene 24μg/孔，1600rpm，37℃离心1小时；
(7)离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37℃培养箱进行培养；
(8)48小时后向经步骤(6)中病毒感染后的内皮细胞加入Bsd进行药筛共计3天，以 得到稳定表达海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人胚胎干细 胞来源的内皮细胞。
2.体内肿瘤靶向治疗：
(1)用胰酶消化生长良好的野生型或标记萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白的人乳腺癌 MDA-MB-231细胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培养基重悬至1×107细胞/毫升；
(2)对6-8周龄雌性NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠经尾静脉注射150微升上述步骤(1) 中肿瘤细胞悬液，待2周后，双肺形成散在肿瘤灶，建成NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳 腺癌肺部转移模型；
(3)用胰酶消化携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的 人胚胎干细胞来源的内皮细胞，用PBS洗一遍并用EBM-2基本培养基重悬至1×107细胞/ 毫升；
(4)经尾静脉向步骤(2)中乳腺癌肺部转移模型NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠注射 100微升上述步骤(3)中内皮细胞悬液；
(5)经腹腔注射更西洛韦0.5mg，每日2次，两次给药中间间隔12小时，连续4天；
(6)重复上述步骤(4)-(5)3次。
3.体内化学发光成像：
(1)监测肿瘤病灶生长情况：向乳腺癌肺部转移模型NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠腹 腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间根据情况为5-30秒；
(2)监测携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人胚胎 干细胞来源的内皮细胞在体内的分布：向NOD/SCID小鼠经尾静脉注射海肾荧光素酶底物 coelenterazine(500μg/kg)，立即利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光 信号，曝光时间为5分钟。
附图说明
图1携带海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合报告基因的质粒示 意图；
图2携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞表达红色荧光蛋白的情况；
图3携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞生物发光强度与细胞数呈正比关 系；
图4在不同浓度更西洛韦条件下培养携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞 5天的存活率；
图5在200μM更西洛韦条件下培养携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞不 同天数的存活率；
图6携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞经尾静脉注射后在乳腺癌肺部 转移模型NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠的体内示踪；
图7携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞经尾静脉注射，并给予更西洛韦 后在乳腺癌肺部转移模型NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠的体内示踪；
图8携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞与人乳腺癌MDA-MB-231细胞 以不同比例混合后在200μM更西洛韦条件下培养5天后肿瘤细胞的存活率；
图9携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞与人乳腺癌MDA-MB-231细胞 以1∶1比例混合后在不同浓度更西洛韦条件下培养5天后肿瘤细胞的存活率；
图10经尾静脉注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞建立NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠 乳腺癌肺部转移模型后肿瘤的生长情况；
图11经尾静脉注射人乳腺癌MDA-MB-231细胞建立NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳 腺癌肺部转移模型后给予携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞加更西洛韦治 疗后肿瘤的生长情况。
本发明结合附图和具体实施方式做进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞的制备
(1)构建含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合基因的具有Bsd 抗性的慢病毒表达质粒：将亚克隆的含海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶 三融合基因的片断插入到商业化载体pLV-EF1α-MCS-IRES-Bsd的多克隆位点当中，得到 pLV-EF1α-TF-Bsd质粒，如图1所示；
(2)用293T细胞铺六孔板，密度为1.5×106细胞/孔，用于转染；
(3)用lipo-2000将pLV-EF1α-TF-Bsd慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转染入步骤 (2)中前一天铺板的293T细胞；
(4)转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于-80℃ 冰箱备用；
(5)用人胚胎干细胞来源的内皮细胞铺六孔板，密度为1×105细胞/孔，用于病毒感染；
(6)待病毒上清常温化冻后，混合2毫升不含抗生素的全培养基和1毫升病毒上清加 入步骤(5)中的内皮细胞孔内，并加入polybrene 24μg/孔，1600rpm，37℃离心1小时；
(7)离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37℃培养箱进行培养；
(8)48小时后向经步骤(6)中病毒感染后的内皮细胞加入Bsd进行药筛共计3天，以 得到稳定表达海肾荧光素酶、红色荧光蛋白和自杀基因胸苷激酶三融合蛋白的人胚胎干细 胞来源的内皮细胞。
在荧光显微镜下观察携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞红色荧光蛋白 的表达情况，结果如图2所示，可见A图中镜下全部细胞在B图中表达红色荧光蛋白； 应用活体成像系统观察该细胞海肾荧光素酶的表达情况，结果如图3所示，加入稀释后的 海肾荧光素酶底物coelenterazine后，可见A图中随着细胞数量的增加生物发光强度增加， B图中生物生物发光强度与细胞数呈正比线性关系。
在人胚胎干细胞来源的内皮细胞培养基中加入不同浓度的HSV-ttk底物更西洛韦 (0-1000μM)，培养5天后，用WST-1法检测细胞存活率，结果如图4所示，在200-1000μM 更西洛韦培养条件下细胞存活率小于10％。在200μM更西洛韦培养条件下，绝大多数细 胞在2天内发生凋亡，如图5所示。
实施例2
携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞经尾静脉注射后在乳腺癌肺部转移模 型NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠的体内示踪
(1)向6-8周雌性NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠经尾静脉注射携带萤火虫荧光素酶和 绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.5×106/只；
(2)10天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟 后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见 双肺散在信号，确定NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模型建立成功；
(3)用胰酶消化实施例1中得到的携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞，用 基本培养基重悬至1×107细胞/毫升，对NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模 型经尾静脉注射100微升每只；
(4)分别在注射内皮细胞后立刻及注射后24小时及48小时向NOD/SCID小鼠经尾静 脉注射海肾荧光素酶底物coelenterazine(500μg/kg)，立即利用Xenogen IVIS Lumina II活 体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟，监测内皮细胞在体内的分布。
在向NOD/SCID小鼠乳腺癌肺部转移模型经尾静脉注射三融合蛋白的人胚胎干细胞 来源内皮细胞后，如图6所示，注射后立即能够在小鼠肺部监测到海肾荧光素信号，注射 后24小时大部分细胞信号仍集中于肺部，小部分出现在腹部，注射后48小时肺部信号消 失，腹部仍有部分信号。
实施例3
携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞经尾静脉注射后并给予更西洛韦腹腔 注射后在乳腺癌肺部转移模型NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠的体内示踪
(1)向6-8周雌性NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠经尾静脉注射携带萤火虫荧光素酶和 绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.5×106/只；
(2)10天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟 后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见 双肺散在信号，确定NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模型建立成功；
(3)用胰酶消化实施例1中得到的携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源内皮细胞，用 基本培养基重悬至1×107细胞/毫升，对NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模 型经尾静脉注射100微升每只；
(4)注射内皮细胞半小时后经腹腔注射更西洛韦0.5mg，之后每12小时1次；
(5)分别在注射内皮细胞后立刻及注射后24小时及48小时向NOD/SCID小鼠经尾静 脉注射海肾荧光素酶底物coelenterazine(500μg/kg)，立即利用Xenogen IVIS Lumina II活 体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为5分钟，监测内皮细胞在体内的分布。
在向NOD/SCID小鼠乳腺癌肺部转移模型经尾静脉注射三融合蛋白的人胚胎干细胞 来源内皮细胞后，如图7所示，注射后立即能够在小鼠肺部监测到海肾荧光素信号，注射 后24小时肺部信号消失，小部分出现在腹部，注射后48小时几乎不能监测海肾荧光素信 号。
实施例4
携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细 胞的杀伤作用
(1)用商业化的pLV-EF1α-MCS-IRES-GFP-Bsd慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒转 染293T细胞；
(2)转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于-80℃ 冰箱备用；
(3)用人乳腺癌细胞MDA-MB-231铺六孔板，密度为1×105细胞/孔，用于病毒感染；
(4)待病毒上清常温化冻后，混合2毫升不含抗生素的全培养基和1毫升病毒上清加 入步骤(3)中孔内，并加入polybrene 24μg/孔，1600rpm，37℃离心1小时；
(5)离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37℃培养箱进行培养；
(6)48小时后向细胞培养基中加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达绿色荧光 蛋白的MDA-MB-231-GFP细胞；
(7)将MDA-MB-231-GFP细胞和实施例1中制备得到的携带三融合蛋白的人胚胎干 细胞来源的内皮细胞混合，并在培养基中加入更西洛韦，培养5天后裂解细胞，应用多功 能检测仪测定细胞裂解液的GFP强度，以GFP的相对强度代表MDA-MB-231-GFP的存 活情况。
结果如图8-9所示，在图8中将两种细胞按照不同比例进行混合后在200μM更西洛 韦条件下培养5天后在25％-90％混合组中MDA-MB-231细胞死亡率大于50％；图9中将 两种细胞1∶1混合后在不同浓度更西洛韦条件下培养5天，在全部的给药组MDA-MB-231 的死亡率均大于50％。
实施例5
NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模型肿瘤的体内示踪
(1)向6-8周雌性NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠经尾静脉注射携带萤火虫荧光素酶和 绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.5×106/只；
(2)10天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟 后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见 双肺散在信号，确定NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模型建立成功；
(3)分别于第20天、第25天、第30天、第35天重复上一步骤，监测肺部肿瘤生长 情况。
结果如图10所示，可见小鼠肺部肿瘤转移灶自接种肿瘤细胞后第10天至第35天生 长迅速。
实施例6
NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模型给予携带三融合蛋白的人胚胎干 细胞来源的内皮细胞加更西洛韦治疗后肿瘤的体内示踪
(1)向6-8周雌性NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠经尾静脉注射携带萤火虫荧光素酶和 绿色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231细胞1.5×106/只；
(2)10天后，向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟 后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间为30秒，可见 双肺散在信号，确定NOD/SCID联合免疫缺陷小鼠乳腺癌肺部转移模型建立成功；
(3)分别在第11天、第16天、第21天和第26天消化携带三融合蛋白的人胚胎干细 胞来源的内皮细胞，用基本培养基重悬至1×107细胞/毫升，对NOD/SCID联合免疫缺陷 小鼠乳腺癌肺部转移模型经尾静脉注射100微升每只；
(4)连续4天经腹腔注射更西洛韦0.5mg，每日2次，两次给药中间间隔12小时；
(5)分别于每轮治疗后，即第20天、第25天、第30天和第35天重复第2步骤，监 测肺部肿瘤生长情况。
结果如图11所示，可见经携带三融合蛋白的人胚胎干细胞来源的内皮细胞加更西洛 韦治疗后小鼠肺部肿瘤转移灶生长缓慢，明显慢于图10中未经治疗小鼠。