一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法 【技术领域】
本发明涉及一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(DNA TopoisomeraseI)连接DNA片段的方法。
背景技术
传统基因克隆方法利用T4DNA连接酶(T4DNA Ligase)的方法将待克隆的目的基因与载体连接，将该重组子转化到受体菌中，筛选鉴定正确的克隆。但是该方法涉及的步骤多，并且繁琐费时。目前还有一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的切割和连接功能，连接DNA片段的方法。牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别CCCTT，TCCTT，CCCUU，TCCUU，CCCTU，TCCTU位点。Invitrogen公司已利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别CCCTT位点的特性，经DNA拓扑异构酶I酶切，形成不同的粘性末端，成功应用于TA、平端克隆，以及定向克隆。该方法和传统方法相比，具有快速，效率高的特点。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(DNA Topoisomerase I)可以识别CCCTT，TCCTT，CCCUU，TCCUU，CCCTU，TCCTU位点并同时具有酶切和连接功能的特点，用以连接DNA片段，并应用于TA、UA、平端克隆及定向克隆载体构建的新方法。用此方法制成试剂盒，将大大方便使用者，为实现基因克隆、表达、蛋白功能等研究提供良好的技术平台。
本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，并用于TA、UA、平端克隆及定向克隆载体构建的新方法，具体：
一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，该方法通过引物设计，利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的酶切和连接作用实现DNA片段的连接，其步骤包括：
(1)设计引物：对至少两个待连接的DNA片段分别设计引物，每条待连接片段设计正向引物和反向引物，相邻连接处对应的前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物的5’到3’端依次包含接头DNA序列、牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，其中所述前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物中的接头序列反向互补配对，不同连接处的互补接头序列不同；
(2)片段扩增
分别以相应待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)片段连接
将待连接片段混合，加入牛痘病毒DNA拓扑异构酶I，37℃15min，得到重组DNA片段。
所述步骤(2)后，还包括对PCR扩增产物进行纯化的步骤。
所述步骤(1)中牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点为XCCYZ，其中，X为T或C；Y为T或U；Z为T或U。
所述步骤(1)中，在引物设计过程中，引物中包含的接头DNA序列为至少3个核苷酸。
本发明的优点：传统的DNA片段连接方法，需要利用限制性内切酶使DNA片段产生相匹配的末端，纯化后利用T4连接酶连接片段。与传统方法相比，本发明提供的DNA片段连接方法利用了牛痘病毒DNA拓扑异构酶I同时实现酶切与连接的功能，因此具有更加快速、高效的特点；待连接片段内部的序列不会对连接产生影响，消除了传统方法中酶切步骤的缺陷；互补的接头序列设计灵活多变，且连接特异性高，使得这种连接方法适用范围更广泛，特别是针对多个片段的连接构建有明显的优势。
【附图说明】
图1：使用本发明方法构建的重组DNA片段的示意图；
其中：A和B分别为两条待连接DNA片段
C为重组DNA片段
A’为A的扩增产物，B’为B的扩增产物
1为引物1(A的正向引物)，2为引物2(A的反向引物)
3为引物3(B的正向引物)，4为引物4(B的反向引物)
引物2和引物3从5’到3’端依次包含接头DNA序列、牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，两条引物中的接头DNA序列反向互补配对，其中：空心方框为牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列；实心方框为PCR扩增后的牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点；
图2：实施例1中两元件连接的电泳图；
其中：泳道M：1Kb Plus DNA Ladder，
泳道1、2：片段1、片段2
泳道3：两片段的连接产物。
【具体实施方式】
实施例中所用的材料及来源分别为：质粒pCMV-cyto-GFP、pcDNA3.1/V5-His/lacZ(美国Invitrogen公司)、pGL3-Control Vector(Promega公司)，TransTaq-T DNA聚合酶，2×EasyTaq PCR Supermix，Trans2K DNA Marker，Trans2K PlusDNA marker，1Kb DNA Ladder，100bp Plus DNA Ladder，Trans DNA Marker IV，pEASY-T3Cloning Kit，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit，EasyPure Quick Gel Extraction Kit，Trans1-T1感受态细胞，pUC19质粒(北京全式金生物技术有限公司)，引物合成(北京英俊生物技术有限公司)。
实施例1：
用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接2个长度为1.2kb的DNA片段。
1.DNA片段的扩增
根据基因序列设计引物：
引物1、2与引物3、4各扩增一个长度为1.2kb的片段，其中引物1、4仅含有与模板互补序列，引物2、3从5’到3’端依次包含接头DNA序列、牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列，以及与模板配对的DNA序列。引物2、3的接头DNA序列反向互补。
两个DNA片段的来源、大小、引物见表1。
PCR反应体系为50μl。
λDNA模板(5ng/μl) 1μl
10×TransTaq-T Buffer(含Mg
2+) 5μl
TransTaq-T DNA聚合酶(5u/μl) 0.5μl
10mM dATP 1μl
10mM dGTP 1μl
10mM dCTP 1μl
10mM dTTP 0.5μl
10mM dUTP 0.5μl
基因正向引物(10μM) 1μl
基因反向引物(10μM) 1μl
ddH
2O 37.5μl
总体积 50μl
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃30秒，55℃30秒，1kb/min于72℃延伸，共30个循环；72℃20分钟PCR结束后，取5μl于1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增体系中同时利用了dTTP与dUTP，产物带有CCCTT，TCCTT，CCCUU，TCCUU，CCCTU，TCCTU等牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的识别位点。
表1PCR扩增所用引物、DNA片段来源与大小
![]()
黑体字母表示接头序列，下划线字母表示牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(TOPO)识别位点的互补序列。
2.PCR产物纯化
用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收和纯化PCR产物。
3.片段的连接
1)片段的连接
按照以下步骤处理PCR产物：
在0.2ml反应管中，加入：
牛痘病毒DNA拓扑异构酶I 1μl
片段 14μl
片段 24μl
1M Tris-Cl缓冲液，pH 7.5 0.75μl
ddH
2O 5.25μl
总体积 15μl
轻轻混合，于37℃反应15分钟。
2)电泳确认：
向连接产物中加入3μl 6×Stop Buffer(0.6％SDS，30mM EDTA pH 8.0)以终止反应，将片段1、2与连接产物于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图3。
可见，连接产物中出现明显的2.4kb的DNA条带，证明连接成功。
【序列表】
<110>北京全式金生物技术有限公司
<120>一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法
<140>2009101628055
<141>2009-08-07
<160>4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA，PCR制备片段1所需的正向引物。
<400>1
taggctagca aaggagaaga ac 22
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA，PCR制备片段1所需的反向引物，含有接头DNA序列和牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列
<400>2
gatcagaagg actttgtaga gctcatccat gc 32
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA，PCR制备片段2所需的正向引物，含有接头DNA序列和牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列
<400>3
ctgatcaagg gtccgctcat gagacaataa cc 32
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA，PCR制备片段2所需的反向引物。
<400>4
ttaccaatgc ttaatcagtg agg 23