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1、(10)申请公布号 CN 103570829 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103570829 A (21)申请号 201210271561.6 (22)申请日 2012.08.01 C07K 16/02(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (71)申请人 王玉麒 地址 中国台湾台北市 (72)发明人 王玉麒 汪宗明 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 周长兴 (54) 发明名称 自卵黄萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法 (57) 摘要 一种自卵黄萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的 方法， 包括 ： (A)。
2、 提供一缓冲盐类溶液、 一卵黄样 品及一无机盐类 ； (B) 使用该缓冲盐类溶液稀释 该卵黄样品， 搅拌一预定时间后， 离心以获得一 上清液 ； 以及 (C) 使用该无机盐类对该上清液 进行盐析沉淀， 以获得一高纯度的 - 卵黄球蛋 白 ； 其中， 该缓冲盐类溶液的酸碱值 (pH) 于 4.6 至 5.4 的范围内， 且该缓冲盐类溶液的浓度于 0.05-0.15M 的范围内， 及该无机盐类的饱和度为 30至 60。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 (10)。
3、申请公布号 CN 103570829 A CN 103570829 A 1/1 页 2 1. 一种自卵黄中萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 包括 ： A) 提供一缓冲盐类溶液、 一卵黄样品、 及一无机盐类 ； B) 使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品， 搅拌一预定时间后， 离心以获得一上清液 ； 以及 C) 使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀， 以获得一 - 卵黄球蛋白 ； 其中， 该缓冲盐类溶液的pH值为4.6至5.4范围内， 且该缓冲盐类溶液的浓度为0.05M 至 0.15M 范围内， 及该无机盐类的饱和度为 30至 60。 2.如权利要求1所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法，。
4、 其中， 该卵黄样品为鸡蛋的卵 黄。 3.如权利要求1所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该缓冲盐类溶液的浓度 为 0.08M 至 0.12M 范围内。 4.如权利要求1所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该缓冲盐类溶液为醋酸 系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液。 5.如权利要求4所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该缓冲盐类溶液为醋酸 钠溶液。 6.如权利要求5所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 于步骤B)中， 该缓冲盐 类溶液是以 8 至 10 倍稀释倍率稀释该卵黄样品。 7. 如权利要求 1 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中，。
5、 该搅拌的预定时间为 25 分钟以上。 8. 如权利要求 1 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该无机盐类为硫酸铵。 9.如权利要求1所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该-卵黄球蛋白的纯 度为 50至 95。 10. 如权利要求 1 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该 - 卵黄球蛋白的 产率为 45至 98。 11. 如权利要求 1 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该卵黄样品为鸡蛋的 卵黄 ； 该缓冲盐类溶液的浓度为 0.08M 至 0.12M 范围内 ； 该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液 ； 于 步骤 (B) 中，。
6、 该缓冲盐类溶液是以 8 至 10 倍稀释倍率稀释该卵黄样品 ； 该搅拌的预定时间 为 25 分钟或以上 ； 且该无机盐类为硫酸铵。 权 利 要 求 书 CN 103570829 A 2 1/7 页 3 自卵黄萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法 技术领域 0001 本发明系关于一种自卵黄萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 尤其指一种可简单、 快速地萃取出高纯度 - 卵黄球蛋白的方法。 背景技术 0002 在脊椎动物的免疫系统遭遇外来特定抗原时， 常会诱发体内产生多种辨识该抗 原不同表位 (epitopes) 的抗体分子， 这些抗体分子的集合统称为多株抗体 (polyclonal anti。
7、bodies) ； 由于抗体与其辨识的抗原表位间具有强结合力与高专一性， 故常被应用于特 定抗原分子的鉴定、 分析与纯化等用途。 目前于基础研究、 一般检验、 与医药治疗上， 多株抗 体已成为不可或缺的工具之一。 0003 由于动物体内被诱发表现的抗体多分布于血液之中， 故多株抗体的生产上， 通 常会选用中、 大体型的兔和羊等动物， 伴随的缺点在于 ： 饲养动物的空间需求与饲养耗费 较高， 且哺乳动物彼此间的亲源关系较接近， 不适合用来制造哺乳动物的保守性蛋白质 (conserved proteins) 的抗体。此外， 对动物重复进行侵入性抽血的方式是常被动物福利 团体争议的行为， 因为动物可。
8、能会遭受痛苦、 较易被感染而造成身体虚弱甚至死亡。 0004 鸡只 (Gallus gallus) 受到免疫刺激后产生的抗体分子以 - 卵黄球蛋白 (-livetin， IgY) 为主， IgY 不仅是鸡血中含量最丰富的抗体分子， 也是卵黄中唯一存 在的抗体种类 ； 又， 鸡只的饲养成本较低， 产蛋效率又高， 且每颗卵黄的 IgY 含量可高达约 100mg， 甚至比鸡血中的 IgY 浓度更高。此外， 相较于哺乳类之间， 鸟类与哺乳类有较大的亲 缘差距， 故成功产生对应哺乳动物保守性蛋白质的抗体的机会较高 ； 又 IgY 与哺乳类的免 疫球蛋白G(Immunoglobulin G， IgG)分子。
9、在Fc部位的序列上有显著差异， 不会与哺乳类动 物的补体、 类风湿性因子、 及Fc受体等成分发生作用， 故可降低分析哺乳动物样品(尤其是 人体样品 ) 时的伪阳性反应。因此， 利用鸡只卵黄来生产 IgY 多株抗体不但生产成本较低、 产量较高且稳定、 可以对应的哺乳动物抗原种类较多元、 分析应用时的伪阳性结果较少、 更 可免去对动物抽血的需求， 而减少社会团体的不必要争议。 0005 但由于卵黄中含有丰富的脂质 ( 高达 34 ) 和其他多种蛋白质， 使 IgY 的纯化不 易， 导致目前 IgY 的应用仍不够普遍。再者， 因 IgY 与 IgG 在 Fc 部位的胺基酸序列差异， 也 使得广泛应用。
10、于纯化 IgG 的 A/G 蛋白质管柱并无法被用来吸附分离 IgY。现有的卵黄 IgY 萃取方法， 皆以去脂步骤开始， 包括水稀法、 PEG 沉淀法、 氯仿沉淀法、 胶液沉淀法等 ； 随后 再由盐析、 或过滤、 或离子交换管柱、 或特定吸附管柱、 或前述方法的不同组合将 IgY 进一 步纯化 ； 过程步骤不仅繁琐且耗时冗长。 0006 因此， 目前亟需发展一种简单快速、 便宜有效的卵黄 IgY 分离方法， 以获得回收量 高且纯度良好的 IgY 样品。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种自卵黄中萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 以简单 说 明 书 CN 103570829 A。
11、 3 2/7 页 4 快速、 成本低廉的方法获得回收量高且纯度良好的 IgY 样品。 0008 为实现上述目的， 本发明提供的自卵黄中萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 包 括 ： 0009 A) 提供一缓冲盐类溶液、 一卵黄样品、 及一无机盐类 ； 0010 B) 使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品， 搅拌一预定时间后， 离心以获得一上清 液 ； 以及 0011 C) 使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀， 以获得一 - 卵黄球蛋白 ； 0012 其中， 该缓冲盐类溶液的 pH 值为 4.6 至 5.4 范围内， 且该缓冲盐类溶液的浓度为 0.05M 至 0.15M 范围内， 及该无机。
12、盐类的饱和度为 30至 60。 0013 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该卵黄样品为鸡蛋的卵黄。 0014 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该缓冲盐类溶液的浓度为 0.08M 至 0.12M 范围内。 0015 所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该缓冲盐类溶液为醋酸系盐类溶液 或柠檬酸系盐类溶液。 0016 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液。 0017 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 于步骤 B) 中， 该缓冲盐类溶液是以 8 至 10 倍稀释倍率稀释该卵黄。
13、样品。 0018 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该搅拌的预定时间为 25 分钟以上。 0019 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该无机盐类为硫酸铵。 0020 所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该-卵黄球蛋白的纯度为50至 95。 0021 所述萃取-卵黄球蛋白(IgY)的方法， 其中， 该-卵黄球蛋白的产率为45至 98。 0022 所述萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 其中， 该卵黄样品为鸡蛋的卵黄 ； 该缓冲 盐类溶液的浓度为 0.08M 至 0.12M 的范围内 ； 该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液 ； 于步骤 (B)。
14、 中， 该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品 ； 该搅拌的预定时间为25分钟 或以上 ； 且该无机盐类为硫酸铵。 0023 本发明的方法不仅步骤最为简单、 快速， 卵黄 IgY 的回收率与纯度亦佳， 试剂成本 更是低廉， 且无需使用任何有机溶剂， 较符合环保要求。由此， 本发明除了可提供至一般实 验室的 IgY 萃取使用外， 亦可被应用于产业界的大规模 IgY 生产目的。 附图说明 0024 图 1 是本发明实施例 1 的 SDS 胶体电泳分析结果图。 0025 图 2 是本发明实施例 2 的卵黄粗萃液的外观照片。 0026 图 3 是本发明实施例 2 的 SDS 胶体电泳分析结。
15、果图。 0027 图 4 是本发明实施例 3 的酸碱值变化结果图。 0028 图 5 是本发明实施例 4 的 SDS 胶体电泳分析结果图。 具体实施方式 说 明 书 CN 103570829 A 4 3/7 页 5 0029 本发明提供一种自卵黄中萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法， 包括 ： 0030 (A) 提供一缓冲盐类溶液、 一卵黄样品、 及一无机盐类 ； 0031 (B) 使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品， 搅拌一预定时间后， 离心以获得一上清 液 ； 以及 0032 (C) 使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀， 以获得一纯度提升的 - 卵黄球 蛋白样品。 0033 其中， 。
16、该卵黄样品无特别限制， 可视实验所需或材料取得的便利性而选用 ； 较佳可 使用鸡蛋的卵黄， 其 IgY 含量高达约 100mg， 且鸡蛋的取得相当便利。 0034 在本发明的萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法中， 该缓冲盐类溶液的浓度是于 0.05M 至 0.15M 的范围内， 较佳地是于 0.08M 至 0.12M 的范围内。再者， 该缓冲盐类溶液不 受限， 可为酸解离常数(pKa)值约为5.0的醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液 ； 较佳可使 用醋酸钠溶液。此外， 该缓冲盐类溶液的酸碱值 (pH) 为 4.6 至 5.4 的范围内， 可达到最佳 的去脂效果。 与公知的酸水相比， 该缓冲。
17、盐类溶液具有较佳的酸碱缓冲效率， 可减少去脂作 用所需的时间， 提升萃取-卵黄球蛋白的时效， 亦可省去实验期间测量与调整pH的步骤， 进而减少电极的去蛋白操作次数以延长其使用寿命。 0035 于步骤 (B) 中， 该缓冲盐类溶液较佳是以 8 至 10 倍稀释倍率稀释该卵黄样品， 然 而此稀释倍率可依其他实验条件而做适当地调整 ； 若稀释倍率过高， 后续加工程序繁复， 会 造成较高的成本耗费。并且， 该搅拌的预定时间可为 25 分钟或以上， 即此步骤 (B) 的搅拌 时间最短仅需 25 分钟， 即可完成去脂作用。 0036 此外， 该无机盐类可使用如硫酸铵、 硫酸钠、 氯化钠等公知盐类， 较佳可。
18、选用硫酸 铵 ； 该无机盐类吸引大量水分子与该无机盐类离子水合， 使蛋白质表面暴露出来的疏水性 区域增加， 最后蛋白质彼此间由疏水性作用力而结合， 进一步自溶液中沉淀。 0037 在该无机盐类的饱和度为30至60的情况下， 所获得的该-卵黄球蛋白的纯 度为50至95、 产率为45至98。 由此， 使用饱和度近30的该无机盐类进行盐析沉 淀时， 所获得的该 - 卵黄球蛋白的纯度较高 ( 约 95 )、 产率适中 ( 约 45 ) ； 反之， 使用 饱和度近 60的该无机盐类进行盐析沉淀时， 所获得的该 - 卵黄球蛋白的纯度适中 ( 约 50 )、 产率较高 ( 约 98 )。故各实验室可依据 -。
19、 卵黄球蛋白的后续用途而适当地选 择该无机盐类的饱和度， 例如若需在短时效内快速获得高纯度的 IgY 样品， 则可选择 30 饱和度的硫酸铵添加量 ； 若后续需要由抗原管柱来进一步纯化专一的 IgY 抗体， 则可选择 60饱和度的硫酸铵先沉淀大部分的 IgY， 再进行后续专一性抗体的纯化。 0038 由此， 在本发明的萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法中， 可使用浓度于 0.08M 至 0.12M 的范围内、 且酸碱值 (pH) 于 4.6 至 5.4 的范围内的醋酸钠溶液， 以 8 至 10 倍稀释倍 率稀释鸡蛋的卵黄， 搅拌至少 25 分钟后， 离心以获得一上清液 ； 再使用饱和度系。
20、为 30至 60的硫酸铵对该上清液进行盐析沉淀， 以获得纯度为50至95、 产率为45至98的 - 卵黄球蛋白。 0039 与公知技术相比， 现今最常用的 PEG 沉淀法或水稀法， 均需搭配其他多重的 步骤， 并且耗时冗长， 才能获得纯度及产率可与使用本发明方法所得的 - 卵黄球蛋 白相比拟的 - 卵黄球蛋白 ； 近期发展较快速方法是以含果胶 (gum pectin)、 卡拉胶 (-carrageenan) 和氯化钙 (CaCl2) 的溶液进行卵黄的去脂作用， 再搭配两次不同饱和度 说 明 书 CN 103570829 A 5 4/7 页 6 的硫酸铵沉淀步骤， 可于 5 小时内从 1 颗卵黄。
21、中分离得到 60mg、 纯度达 80的 IgY 样品， 且 试剂花费仅需约 5 美元。然而， 本发明的萃取 - 卵黄球蛋白 (IgY) 的方法为一仅有两步 骤的萃取方法， 先以醋酸钠溶液进行卵黄的去脂作用， 再由硫酸铵盐析沉淀 IgY 样品， 完成 萃取仅需约两小时， 即可从卵黄中分离得到高纯度及高产率的 IgY， 比已知技术更加快速， 并且试剂花费估计仅为 1.5 美元。 0040 以下实施例使用的鸡蛋来源为实验室自行饲养的白色莱亨蛋用鸡 (White Leghorn laying hens)。敲破蛋壳， 将分离的卵黄置于不锈钢滤网中， 再将滤网浸入去离 子水中， 以洗去卵黄表面残留的蛋白液。
22、 ； 随后以纸巾从滤网外侧将多余的水分吸干， 再用解 剖针搓破卵黄膜， 并以量筒收集卵黄液。以下实施例使用的鸡蛋其卵黄液体积约为 13 至 15mL。 0041 以下实施例使用的统计分析， 对两两比较的实验结果， 是以 Student s T-test 来 分析其是否具显著差异 ； 对多组比较的实验结果， 则是以单因子变异数分析 (ANOVA) 来检 测组间的差异性， 并以 p 0.05 做为显著的标准。 0042 实施例 1- 粗萃取卵黄 IgY 的搅拌时间测试 0043 卵黄 IgY 的粗萃取 0044 取定量体积的卵黄液， 加入9倍体积的0.1M， pH5.0的醋酸钠溶液， 混合均匀后，。
23、 置 于 4中以四种不同搅拌时间 (0.5h、 1h、 3h、 6h) 搅拌， 接着以 12,000g， 4离心 30 分钟， 而收集到的上清液即为卵黄的粗萃液(crude extract)， 量测体积后， 加入NaN3至最终浓度 为 0.02 (w/v)， 并保存于 4中供后续分析使用。 0045 IgY 的定量分析 0046 以酵素连结免疫吸附法 (enzyme-linked immuno-sorbent assay ； ELISA) 来测定 分析样品中的 IgY 含量。首先将 IgY 标准品 (Jackson， 003-000-003) 与待测样品分别以 0.2M硼酸盐进行一系列稀释， 。
24、再各取50L分注至ELISA盘(Costar EW-01959-20)的样品 孔中， 经6h(室温)或隔夜(4)的吸附作用后， 以洗涤缓冲液(wash buffer)冲洗三次， 再 加入180L封闭缓冲液(blocking buffer)， 并于室温下反应两小时或于4中隔夜反应 ； 之后， 以洗涤缓冲液冲洗三次， 并于各孔加入 50L 兔子抗鸡 IgY(rabbit anti-chicken IgY， Jackson 303-005-003 ； 1g/ml)， 在室温下反应 2h 后， 以洗涤缓冲液冲洗三次， 再于 各孔中加入 50L 山羊抗兔子抗体 - 碱性磷酸酶 (goat anti-ra。
25、bbit antibody-alkaline phosphatase， Sigma A3687 ； 使用 10,000 倍稀释液 )， 随后于室温下反应两小时， 以洗涤缓 冲液冲洗三次， 各孔分别加入 50L pNPP 受质以进行 30 至 60 分钟的呈色反应， 最后以酵 素免疫分析测读仪 (ELISA reader， BIO-TEK MQX220) 测定吸光值 (OD405-490)。利用系列稀 释的 IgY 标准品读值， 推估待测样品的 IgY 含量。 0047 蛋白质定量 0048 由 Bradford 测定法来估测分析样品中的蛋白质含量， 并以牛血清白蛋白 (BSA， Sigma A。
26、7906) 做为蛋白质标准品。先将 BSA(2mg/mL) 与待测样品进行系列稀释， 并各取 50L 分别加注于 96 孔盘中， 随后各孔加入 200L Bradford 试剂， 静置十分钟后， 以酵素 免疫分析测读仪 (ELISA reader， BIO-TEK MQX220) 测定 OD595的读值。取 BSA 系列稀释样 品的读值做一标准曲线， 用以估算待测样品的蛋白质浓度。 0049 如下表一所示， 四种不同搅拌时间 (0.5h、 1h、 3h、 6h) 的处理下， 每毫升卵黄所能 说 明 书 CN 103570829 A 6 5/7 页 7 萃得的 IgY 含量 (6.0 7.2mg。
27、) 及蛋白质含量 (21.7 24.9mg)， 经 ANOVA 分析后 (p 0.05) 并无统计上的差异， 表示仅需 0.5 小时就足够完成去脂程序。 0050 表一 0051 搅拌时间 0.5h 1h 3h 6h IgY(mg)/mL 卵黄 6.92.0 7.21.7 7.21.8 6.01.1 蛋白质 (mg)/mL 卵黄 24.91.1 22.70.9 21.71.6 23.11.4 0052 SDS 胶体电泳分析 (Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ； SDS-PAGE) 0053 各取 8g 蛋白质，。
28、 以 4焦集胶体 (stacking gel)、 12分离胶体 (separating gel) 进行 SDS-PAGE 分析， 电泳的条件为固定 120V 约 2.5h。电泳后， 将胶片取下摇荡浸泡 于 CBB 染剂中 1 小时以上， 随后以一级褪染液褪染 10 至 20 分钟， 再以二级褪染液褪染至胶 片上的蛋白质色带清晰可见且背景透明为止。 0054 如图 1 所示， 图右箭头分别标记 IgY 的 H 链 (70kDa) 及 L 链 (26kDa) 位置， MW 为 蛋白质分子量标准品 (Bioman， PL01425) ； 四种不同搅拌时间样品中的蛋白质种类与个别 含量亦无明显不同。 。
29、此一结果显示， 在以醋酸钠溶液为卵黄的萃取试剂时， 0.5h的低温搅拌 时间即可达到充分的萃取效果。 0055 实施例 2-pH 值对卵黄 IgY 的萃取效果 0056 配制 pH 值为 4.2、 4.6、 5.0、 及 5.4 的四种 0.1M 醋酸钠溶液， 再分别用以进行与实 施例1中卵黄IgY的粗萃取相同的过程， 其中搅拌时间为30分钟。 经离心处理后， 如图 2 所示， 四种不同 pH 条件的卵黄粗萃液在外观上有明显差异 ： pH 4.2 的粗萃液最为黄浊， 其次为 pH 5.4 的粗萃液， 而 pH 5.0 的粗萃液则相对最为清澈。由于卵黄萃取液的黄浊颜 色主要受非水溶性脂质含量的影。
30、响， 故可推知醋酸钠溶液的去脂效果是呈 pH 依赖现象 (pH dependent)。 0057 另外， 将上述四种不同 pH 条件的卵黄粗萃液， 进行与实施例 1 中 IgY 的定量分 析 及 蛋白质定量 相同的分析。如下表二所示， 四种卵黄粗萃液之间的 IgY 含量并无 显著不同 ( 每 10mL 粗萃液的 IgY 含量为 8.7 9.2mg)， 但蛋白质含量则有明显差异， 并似 乎与粗萃液的浊度成正相关 ： 每 10mL 最黄浊的粗萃液 (pH 4.2) 中， 蛋白质含量约为 63mg ； 同体积最清澈的粗萃液 (pH 5.0) 中， 蛋白质含量则仅约为 27.6mg。若以 IgY 含量。
31、与蛋白 质含量的比值来代表为萃取样品的 IgY 纯度， 则四种不同 pH 条件的粗萃液中， IgY 的纯度 依序为 32.6 (pH 5.0)、 30.6 (pH 4.6)、 21.6 (pH 5.4)、 和 14.7 (pH 4.2) ； 统计分 析的结果显示， 前两者 (pH 5.0 和 pH 4.6) 的纯度并无明显不同， 但其与后两者 (pH 5.4 和 pH 4.2) 之间则有显著差异。 0058 表二 0059 说 明 书 CN 103570829 A 7 6/7 页 8 醋酸钠液溶液 pH 4.2 pH 4.6 pH 5.0 pH 5.4 IgY(mg)/mL 卵黄 9.20.7。
32、 8.71.8 9.21.1 8.71.9 蛋白质 (mg)/mL 卵黄 63.62.2 26.40.6 27.62.5 39.30.7 IgY 纯度 ( ) 14.71.1 30.66.0 32.62.5 21.65.1 0060 接着， 将上述四种不同 pH 条件的卵黄粗萃液进行与实施例 1SDS 胶体电泳分析 相同的分析， 其中各组蛋白质取 12g， 标准样品系取 3g。结果如图 3 所示，S 表示 IgY 的标准样品， 图右的箭头指示 IgY 的 H 链 (70kDa) 及 L 链 (26kDa) 位置 ； 在等蛋白质量的基 准下， pH 4.2 的粗萃液中， 蛋白质的种类明显最多， 。
33、根据 H 链及 L 链的染色密度可知 IgY 的 含量也相对较少 ； 而在 pH 5.0 与 pH 4.6 的粗萃液中， 蛋白质的种类则较少， IgY 的含量也 较高， 此结果与表二的结果一致。 0061 实施例 3- 卵黄粗萃液的 pH 值变化 0062 为要探讨何以使用醋酸钠溶液可较常用的酸水具有更高的卵黄 IgY 萃取效率， 本 实验设计共分成 3 组 ： 第一组取定量卵黄， 加入 9 倍体积的 0.1M 醋酸钠溶液 (pH 5.0)， 稀 释样品的初始 pH 值为 5.1( 醋酸钠稀释组 ) ； 第二组取与第一组同量的卵黄， 并加入 9 倍体 积的二次水， 稀释样品的初始 pH 值为 。
34、6.2， 然后立即加入少量 0.1N HCl( 2总体积 ) 使 其 pH 值调整为 5.0( 酸水稀释组 ) ； 第三组为单纯二次水， 并加入少量 0.1N HCl 使其 pH 值 调整为 5( 酸水对照组 )。三组样品完成制备后， 移入 4中进行搅拌， 并随时间进展检测其 酸碱值的变化情形。 0063 结果如图 4 所示， 在 6 小时的搅拌期间内，醋酸钠稀释组 样品的 pH 值恒定维持 在 5.1 范围 ；酸水稀释组 样品的 pH 值则是逐渐上升至 5.4 ； 而 酸水对照组 的 pH 值则 于搅拌初期 ( 经搅拌 1 小时 ) 即迅速下降至 4.4， 而后维持于该 pH 值范围内。 0。
35、064 酸水对照组 的 pH 值于搅拌期间迅速下降 (5.0 4.4)， 应与空气中的二氧化碳 溶入有关 ； 而两组蛋黄稀释液样品的 pH 值不降反升 ( 其中 醋酸钠稀释组 ， 5.0 5.1 ； 及 酸水稀释组 ， 5.0 5.4)， 则说明蛋黄脂质的堆聚过程会消耗稀释液中的氢离子。由于醋 酸钠溶液具有酸碱缓冲的功效， 能补充被耗去的氢离子， 故除了反应初期可能因可堆聚的 脂质量最高， 致使醋酸钠稀释液的 pH 值些许上升 (5.0 5.1)， 随后该样品则能恒定维持 在 5.1 范围。另一方面， 由于酸水不具酸碱缓冲的效果， 无法适切补充被耗去的氢离子， 因 此随着蛋黄脂质堆聚过程进行，。
36、 酸水稀释液样品的酸碱值也逐渐持续上升。 0065 萃取蛋黄 IgY 时的去脂作用属于 pH-dependent 的反应， 并且仅有狭窄的适用 pH 范围。本发明证实在萃取蛋黄 IgY 的去脂过程中， 会消耗稀释液中的氢离子。由于醋酸钠 溶液的pH缓冲效应， 能较稳定维持去脂反应所需的pH范围， 故可有较快、 较佳的去脂效果 ； 反之， 酸水因无维持适当pH范围的效果， 因此随着pH值的上升， 去脂效果渐差， 故需更长的 作用时间才能达到充足的去脂效果。 0066 实施例 4- 卵黄粗萃液的硫酸铵盐析沉淀测试 0067 卵黄 IgY 的硫酸铵盐析沉淀 0068 取四等份卵黄粗萃液 ( 各 10。
37、mL)， 分别添加硫酸铵 (ammonium sulfate ； Merk 1.01217) 至 30、 40、 50、 和 60四种不同饱和程度， 经 4中搅拌 30 分钟， 接着以 12,000g， 4离心30分钟， 再分别以1mL PBS溶液回溶沉淀(pellet)， 进行与实施例1中 说 明 书 CN 103570829 A 8 7/7 页 9 IgY 的定量分析 及 蛋白质定量 相同的分析。 0069 如下表三的结果显示， 卵黄粗萃液中的硫酸铵饱和程度越高， 蛋白质及 IgY 的沉 淀量亦随之增加 ： 在 30饱和度的条件下， 每 10mL 卵黄粗萃取液可沉淀出 4.9mg 蛋白质，。
38、 其中 4.4mg 为 IgY ； 在 60饱和度的条件下， 同体积的卵黄粗萃取液则可沉淀出 16.9mg 蛋 白质， 包含 8.9mg IgY。此一结果显示在不同硫酸铵饱和度的条件下， 蛋白质与 IgY 的沉淀 量并非以等比例的形式变化， 故硫酸铵的添加量除了会影响 IgY 的回收率之外， 亦会影响 各回收样品的 IgY 纯度 (IgY/total protein) ： 在 30硫酸铵的饱和度条件下， IgY 的回收 率虽只有 48， 但纯度却高达近 90； 在 60硫酸铵饱和度的条件下， IgY 的回收率虽可高 达 96， 但纯度则减至 53。 0070 表三 0071 0072 接着， 。
39、将上述四种不同硫酸铵饱和度的盐析沉淀样品进行与实施例 1SDS 胶体电 泳分析 相同的分析， 其中各组蛋白质取 3g， 结果如图 5 所示，S 表示 IgY 的标准品 (Jackson， 003-000-003)， 图右的箭头标示卵黄中各特定蛋白质的位置， MW 为蛋白质分子量 标准品 ； 可见 30饱和度的沉淀样品其 IgY 纯度最高， 仅含有些许 - 卵黄球蛋白及 血 清白蛋白， 随着硫酸铵饱和度的增加， 沉淀的蛋白质种类亦随之增多， 而 IgY 的纯度则随之 递减， 此一结果与表三的结果一致。 0073 据此， 醋酸钠溶液 (0.1M ； pH 5.0) 具有良好的卵黄去脂效果， 相较于。
40、常见的酸水 稀释法需要作用 5.5h 或更久时间， 醋酸钠溶液仅需反应 0.5h 即可分离得到 IgY 含量超过 30的粗萃液， 因此， 仅需进行本发明萃取方法的粗萃步骤， 所得的 IgY 含量即已足够直接 使用于多种免疫化学试验， 如西方墨点法 (Western Blot)、 酵素连结免疫吸附法 (ELISA) 等。进一步的盐析沉淀结果则显示， 粗萃液中分别添加硫酸铵至 30、 40、 50、 和 60饱 和度时， IgY 的沉淀回收率为 48、 69、 90、 及 96， 而回收样品的 IgY 纯度则分别为 90、 83、 66、 及 53， 此项结果可做为参考， 供各实验室依后续用途对 IgY 产率和纯度 的要求， 而选择沉淀 IgY 的适当硫酸铵添加量。 0074 上述实施例仅为了方便说明而举例而已， 本发明所主张的权利范围自应以申请的 权利要求范围所述为准， 而非仅限于上述实施例。 说 明 书 CN 103570829 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103570829 A 10 2/3 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103570829 A 11 3/3 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 103570829 A 12 。