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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610543547.5 (22)申请日 2016.07.11 (83)生物保藏信息 CGMCC NO.12226 2016.03.18 (71)申请人 江苏恒顺醋业股份有限公司 地址 212028 江苏省镇江市丹徒新城恒顺 大道66号 (72)发明人 李信余永建朱胜虎李童 其他发明人请求不公开姓名 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 代理人 黄天天 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12J 1/04(2006。
2、.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一株适用于食醋酿造的发酵乳杆菌及其菌 粉的制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一株适用于食醋酿造的发酵 乳 杆 菌 ，其 分 类 命 名 为 发 酵 乳 杆 菌 LactobacillusfermentumHS3-7， 保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所， 保藏登记入册的编号为 CGMCCNO.12226， 保藏日期为2016年3月18。 本发 明进一步提出了上述发酵乳杆菌的直投式菌粉 及其应用。 该菌粉的使用可明显提高食醋或其他 醋产。
3、品中乳酸菌的数量， 增加不挥发酸的含量， 改善产品风味和品质。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图1页 CN 106190893 A 2016.12.07 CN 106190893 A 1.一株适用于食醋酿造的发酵乳杆菌， 其分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地点为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12226， 保藏日期为2016年3月18。 2.权利要求1所述的发酵乳杆菌在醋产品制造中的应用。 3.根据权利要求2所述的。
4、应用， 其中， 所述的醋产品为食醋或醋饮料。 4.一种发酵乳杆菌直投式菌粉， 其特征在于， 其由权利要求1所述的发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum HS3-7制备得到。 5.权利要求4所述的发酵乳杆菌直投式菌粉的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)菌株的扩大培养： 一级种子液的制备： 按照5的接种量， 将纯化的发酵乳杆菌HS3-7接种到液体MRS培养 基中， 37培养2022h。 二级种子液的制备： 选用50L液态发酵罐， 加入35L处理过的米浆， 米浆中米粉含量15 25， 所述米浆的处理过程如下： 100高温糊化30min， 添加68u/ml的淀粉酶保持。
5、85 90液化30min， 然后添加100300u/ml的糖化酶保持5560糖化30min。 添加2的脱脂 奶粉后， 115灭菌20min。 按照5的接种量接入一级种子液。 控制温度37， 罐内压强为 0.05MPa， 搅拌速度为60r/min， 以NaOH溶液控制培养液pH值恒定为6.0， 发酵20h， 乳酸菌的 活菌数达到109cfu/ml。 (2)菌液浓缩： 发酵结束后， 采用中空纤维膜浓缩乳酸菌发酵液， 浓缩结束后液体体积约为原发酵液 体积的1/5； (3)保护剂的配制、 冻干： 发酵液中添加无菌的脱脂奶粉20g/100m L， 谷氨酸钠12g/100m L， 山梨醇4g/100m L。
6、， 然后将菌液分装到冻干盘中， 迅速放入-80超低温冰箱中进行预冻25h， 最后将样品盘 至于冷冻干燥机上进行2448h的冻干处理； (4)菌粉检测、 分装： 称取冻干后的菌粉， 测定水分含量， 若低于2.5时， 表示合格； 检测活菌数， 若高于 1010cfu/g， 表示合格； 对检测合格的菌粉进行分装后真空保存。 6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 在二级种子液的制备中， 发酵条件为： 控制温度37， 罐内压强为0.05MPa， 以NaOH溶液控制培养液pH值恒定为6.0， 搅拌速度为 60r/min， 发酵20h。 7.权利要求4所述的发酵乳杆菌直投式菌粉在醋产品生产中的应。
7、用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述的醋产品为食醋或醋饮料。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 在制备醋产品时， 添加所述的发酵乳杆菌 直投式菌粉进行发酵制备。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106190893 A 2 一株适用于食醋酿造的发酵乳杆菌及其菌粉的制备方法和 应用 技术领域 0001 本发明涉及食醋酿造加工领域， 具体涉及一株适用于食醋酿造的发酵乳杆菌及其 菌粉的制备方法和应用。 背景技术 0002 乳酸菌广泛分布于自然界中， 具有非常悠久的应用历史， 早在4000年前古人已有 酸奶饮用的历史。 乳酸菌在传统的酿造食品如食醋、 黄酒、 酱油、 腐。
8、乳等产品中具有重要的 功能， 随着微生物技术的发展， 乳酸菌人们也受到越来越多的关注。 0003 乳酸菌也是食醋酿造过程中重要的微生物， 在食醋生产过程中乳酸菌产生的乳酸 不仅可以缓和醋酸的刺激性， 增加食醋的醇和感， 而且可以促使产生乳酸乙酯等多种香气 成分， 使其口感醇和， 后味绵长。 乳酸是我国四大名醋之一的镇江香醋所具有醇香浓厚特点 的重要贡献者。 0004 我国传统酿造食醋在酿造过程中主要以天然乳酸菌为主， 部分学者采用液体的乳 酸菌进行强化， 但液体乳酸菌具有运输成本高， 使用不便， 不易储存、 容易染菌等缺点， 为企 业生产带来不便。 近几年不少科研工作者对直投式乳酸菌发酵剂进行。
9、了研究， 如专利CN 101218964， 但未见到适用于食醋酿造的直投式乳酸菌发酵剂。 因此， 筛选出适合食醋特殊 酿造环境的乳酸菌， 并制备成直投式菌粉应用于食醋的酿造具有重要的意义。 发明内容 0005 针对上述技术问题， 本发明提供一株可适用于食醋酿造的乳杆菌菌株， 并提供该 菌株的直投式乳杆菌菌粉， 该菌粉的使用可明显提高食醋中乳酸菌的数量， 增加不挥发酸 的含量， 改善产品风味和品质。 0006 本发明提供的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7， 它保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科。
10、学院微生物研究所， 保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12226， 保藏日期为2016年3月18。 0007 使用的分离培养基(MRS培养基)为： 酪蛋白胨10.0g， 葡萄糖20.0g， 酵母粉4.0g， 牛 肉粉8.0g， 乙酸钠5.0g， 柠檬酸三铵2.0g， 磷酸氢二钾2.0 g， 硫酸镁0.2g， 硫酸锰0.05g， 吐 温80 1.0g， 蒸馏水1000mL， 调节pH6.20.2。 固体培养基添加1520g/L琼脂粉。 0008 乳酸菌的分离、 纯化及鉴定： 0009 (1)乳酸菌的分离： 取25g镇江香醋的醋醅样品加入225ml无菌生理盐水中， 在摇床 上摇匀。 取1ml样。
11、品加入到9ml无菌生理盐水中， 在漩涡混合器上混和均匀后， 再取1ml稀释 过的溶液加入到9ml的生理盐水中， 以此类推。 选取3个合适的浓度依次涂布到添加有碳酸 钙(添加量为1520g/L)的MRS固体平板上， 于37厌氧培养箱中培养48h。 0010 挑取钙溶解圈较大的疑似乳酸菌菌落， 并利用划线的方法在MRS平板上划线纯化2 次后置于4冰箱保存。 说明书 1/7 页 3 CN 106190893 A 3 0011 (2)菌株初筛 0012 将保存的菌株接种到含液体MRS培养基的试管中， 纱布封口后于37普通培养箱 中培养24h， 观察浑浊情况， 选择浑浊体积距离液面最近的菌株， 即氧耐受。
12、性强的菌株。 0013 将上述耐氧强的的菌株分别接种到含有9vol乙醇的MRS培养基中， 37培养24h 后测定发酵液的pH值， 选取pH值低于4.5的菌株。 0014 将上述产酸强的菌株接种到含乙酸1的MRS培养基中， 37培养24h， 测定发酵液 的OD600， 选取OD600最高的菌株， 即为目标菌株。 0015 综合上述结果， 筛选得到一株耐氧气、 耐乙醇、 耐乙酸、 产酸特性好的菌株HS3-7。 0016 (3)生理生化特性 0017 表1生理生化特性 0018 0019 0020 注：“+” 代表阳性，“-” 代表阴性，“w” 生长弱。 0021 (4)菌株分子生物学鉴定 0022。
13、 检测菌株HS3-7的16S rRNA的序列。 0023 采用生工生物工程(上海)股份有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒， 提取本发 明筛选到的菌株HS3-7的基因组DNA， PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提 供， 测序引物如下： 0024 27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 0025 1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT 0026 PCR反应循环条件： 说明书 2/7 页 4 CN 106190893 A 4 0027 0028 PCR产物的检测： 取5ul反应产物， 利用1的琼脂糖凝胶电泳检测。 如果PCR成功， 在约1500bp处有条带。
14、出现。 0029 测序分析： 将PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序， 得到菌株 HS3-7的16S rRNA序列， 测得的序列用BLAST程序在NCBI数据库中比对分析。 结果本发明菌 株HS3-7与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NBRC 15885的16S rRNA同源性为99。 0030 本发明进一步提出了上述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7在醋产品 制造中的应用。 0031 具体地， 所述的醋产品可以为香醋或醋饮料。 0032 为方便上述发酵乳杆菌的应用， 本发明进一步提出了上述发酵乳杆菌的直投式菌 粉。
15、。 0033 该直投式菌粉的制备方法如下： 0034 (1)菌株的扩大培养： 0035 一级种子液的制备： 按照5的接种量， 将纯化的发酵乳杆菌HS3-7接种到液体MRS 培养基中， 37培养2022h； 0036 二级种子液的制备： 选用50L液态发酵罐， 加入35L处理过的米浆， 米浆中米粉含量 1525， 所述米浆的处理过程如下： 100高温糊化30min， 添加68u/ml的淀粉酶保持 8590液化30min， 然后添加100300u/ml的糖化酶保持5560糖化30min。 添加2的 脱脂奶粉后， 115灭菌20min。 按照5的接种量接入一级种子液进行发酵， 发酵结束后， 乳 酸菌。
16、活菌数达到109cfu/ml。 0037 (2)菌液浓缩： 0038 发酵结束后， 采用中空纤维膜浓缩乳酸菌发酵液， 浓缩结束后液体体积约为原发 酵液体积的1/5； 0039 (3)保护剂的配制、 冻干： 0040 发酵液中添加无菌的脱脂奶粉20g/100mL， 谷氨酸钠12g/100mL， 山梨醇4g/100mL， 然后将菌液分装到冻干盘中， 迅速放入-80超低温冰箱中进行预冻25h， 最后将样品盘 至于冷冻干燥机上进行2448h的冻干处理； 0041 (4)菌粉检测、 分装： 0042 称取冻干后的菌粉， 测定水分含量， 若低于2.5时， 表示合格； 检测活菌数， 若高 于1010cfu/。
17、g， 表示合格； 对检测合格的菌粉进行分装后真空保存。 0043 优选地， 在二级种子液的制备中， 发酵条件为： 控制温度37， 罐内压强为 0.05MPa， 以NaOH溶液控制培养液pH值恒定为6.0， 搅拌速度为60r/min， 发酵20h。 0044 上述发酵乳杆菌直投式菌粉在醋产品制造中的应用同样在本发明的保护范围之 内。 说明书 3/7 页 5 CN 106190893 A 5 0045 具体地， 所述的醋产品为食醋或醋饮料， 如镇江香醋或苹果醋饮料。 0046 在应用时， 在制备醋产品时， 添加所述酵乳杆菌直投式菌粉进行发酵制备。 0047 有益效果： 本发明从镇江香醋生产过程的醋。
18、醅中分离筛选得到一株适合于食醋酿 造的发酵乳杆菌， 该菌株制备的直投式乳酸菌菌粉的活菌数可以达到 1010cfu/g以上。 该菌 粉适合食醋及其它醋产品的生产、 使用方便、 便于储藏和运输， 为企业带来极大的便利。 通 过该菌粉的使用， 可以提高食醋食醋及其它醋产品中不挥发酸的含量， 改善产品的风味与 品质。 附图说明 0048 图1为镇江香醋中乳酸含量变化的示意图。 具体实施方式 0049 本发明提供的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7， 它保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所。
19、， 保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12226， 保藏日期为2016年3月18。 0050 实施例1： 乳酸菌的分离与鉴定。 0051 1.乳酸菌的分离、 纯化 0052 取25g镇江香醋的醋醅样品， 加入225ml无菌生理盐水中摇匀。 取1ml样品加入到 9ml无菌生理盐水中， 在漩涡混合器上混和均匀后， 再取1ml稀释过的溶液加入到9ml的生理 盐水中， 以此类推。 选取3个合适的浓度依次涂布到添加有碳酸钙(添加量为1520g/L)的 MRS固体平板上， 于37厌氧培养箱中培养48h。 0053 挑取钙溶解圈较大的疑似乳酸菌菌落， 并利用划线的方法在MRS平板上划线纯化2 次后置于4。
20、冰箱保存。 0054 2.菌株初筛 0055 将保存的菌株接种到含液体MRS培养基的试管中， 纱布封口后于37普通培养箱 中培养24h， 观察浑浊情况， 选择浑浊体积距离液面最近的菌株， 即氧耐受性强的菌株。 0056 将上述耐氧强的的菌株分别接种到含有9vol乙醇的MRS培养基中， 37培养24h 后测定发酵液的pH值， 选取pH值低于4.5的菌株。 0057 将上述产酸强的菌株接种到含乙酸1的MRS培养基中， 37培养24h， 测定发酵液 的OD600， 选取OD600最高的菌株， 即为目标菌株。 0058 综合上述结果， 筛选得到一株耐氧气、 耐乙醇、 耐乙酸、 产酸特性好的菌株HS3-。
21、7。 0059 3.生理生化特性 0060 表1生理生化特性 说明书 4/7 页 6 CN 106190893 A 6 0061 0062 注：“+” 代表阳性，“-” 代表阴性，“W” 生长弱。 0063 4.菌株分子生物学鉴定 0064 检测菌株HS3-7的16S rRNA的序列。 0065 采用生工生物工程(上海)股份有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒， 提取本发 明筛选到的菌株HS3-7的基因组DNA， PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提 供， 测序引物如下： 0066 27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 0067 1492R： GGTTACCTTGT。
22、TACGACTT 0068 PCR反应循环条件： 0069 0070 PCR产物的检测： 取5ul反应产物， 利用1的琼脂糖凝胶电泳检测。 如果PCR成功， 在约1500bp处有条带出现。 0071 测序分析： 将PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序， 其16S rRNA序列如下： 0072 GAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACTTGATTGA TTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGAC。
23、AACATTTGGAA ACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGA TGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTG ATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCA 说明书 5/7 页 7 CN 106190893 A 7 AGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGA。
24、GTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTAT GAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC GTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCT TCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCG GTGGAATGCGTAG。
25、ATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAA AGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTC CGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT C。
26、TTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAG TGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACA CGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTC。
27、TCAGTTCGGA CTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCC C G G G C C T T G T A C A C A C C G C C C G T C A C A C C A T G A G A G T T T G T A A C ACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGG 0073 测得的序列用BLAST程序在NCBI数据库中比对分析。 结果本发明菌株HS3-7与发酵 乳杆菌(Lactoba。
28、cillus fermentum)NBRC 15885的16S rRNA同源性为99。 0074 综合以上结果， 将本发明菌株命名为Lactobacillus fermentum HS3-7， 于2016年 3月18日将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地点为北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所， 保藏登记入册的编号为CGMCC NO.12226。 0075 实施例2： 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7直投式菌粉的制备。 0076 1.菌株的扩大培养 0077 一级种子液的制备： 按照5的接种量， 将纯化的发酵乳杆菌。
29、HS3-7接种到液体MRS 培养基中， 37培养20h。 0078 二级种子液的制备： 选用50L液态发酵罐， 加入35L处理过的米浆， 米浆中米粉含量 1525， 所述米浆的处理过程如下： 100高温糊化30min， 添加68u/ml的淀粉酶保持 8590液化30min， 然后添加100300u/ml的糖化酶保持5560糖化30min。 添加2的 脱脂奶粉后， 115灭菌20min。 按照5的接种量接入一级种子液。 控制温度37， 罐内压强 为0.05MPa， 以NaOH溶液控制培养液pH值恒定为6.0， 搅拌速度为60r/min， 发酵20h。 发酵结 束后， 乳酸菌活菌数达到109cfu。
30、/ml。 0079 2.菌液浓缩 0080 发酵结束后， 采用中空纤维膜浓缩乳酸菌发酵液， 浓缩结束后液体体积约为原发 酵液体积的1/5。 0081 3.保护剂的配制、 冻干 0082 发酵液中添加无菌的脱脂奶粉20g/100mL， 谷氨酸钠12g/100mL， 山梨醇4g/100mL， 然后将菌液分装到冻干盘中， 迅速放入-80超低温冰箱中进行预冻25h。 最后将样品盘 至于冷冻干燥机上进行2448h的冻干处理。 0083 4.菌粉检测、 分装 说明书 6/7 页 8 CN 106190893 A 8 0084 称去冻干后的菌粉， 测定水分含量， 若低于2.5时， 表示合格； 检测活 菌数，。
31、 若高 于1010cfu/g， 表示合格。 对检测合格的菌粉进行分装后真空保存。 为延长保存时间， 可将其 保存于4冰箱中。 0085 实施例3： 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7直投式菌粉在镇江香醋中 的应用。 0086 1.直投式菌粉接种发酵 0087 选取6个400kg大缸， 每个缸中加入酒醪250kg， 麸皮90kg， 大糠50kg。 选3个缸为试 验组， 每个缸中接入100g菌粉， 剩余3个缸为对照组。 按照镇江香醋酿造工艺进行带种， 翻醅 发酵。 0088 2.乳酸含量的检测 0089 发酵过程中， 取接种后、 露底和封醅时的卤子进行检测。 00。
32、90 乳酸采用高效液相色谱法， 参照 GB/T 18623-2011地理标志产品 镇江香醋 附录 B中方法， 测定结果如图1所示。 0091 在发酵过程中， 接入菌粉的试验组中乳酸含量明显高于对照组， 封醅时试验组乳 酸含量比对照组提高9.25。 试验组的食醋品质在口感、 滋味上明显优于对照组。 0092 本发明的菌株HS3-7制备的直投式菌粉可作为乳酸菌强化菌种应用于镇江香醋的 生产中， 通过该菌株的强化可提高镇江香醋中的乳酸含量， 改善产品品质。 0093 实施例4： 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum HS3-7直投式菌粉在苹果醋饮中 的应用. 0094 在50L发。
33、酵罐中加入25L经过调配糖含量为68， pH值为4.55.0的苹果汁， 接 种酵母菌， 2830发酵至酒精度为3vol。 投入2.53.5g菌粉， 调节发酵罐温度为28 30， 保持压力0.05Mpa， 搅拌速度为60r/min， 发酵24h。 最后接入醋酸菌进行醋酸发酵。 发 酵结束后乳酸含量为0.55g/100mL， 而不添加乳酸菌菌粉制备的苹果醋饮中乳酸含量几乎 为零。 在普通的苹果醋饮的基础上接入乳酸菌菌粉后乳酸含量增加， 使其具有绵柔的口感， 还可以在一定程度上提高果醋的营养及保健功效， 具有广阔的市场前景。 说明书 7/7 页 9 CN 106190893 A 9 0001 序列表 1/3 页 10 CN 106190893 A 10 0002 序列表 2/3 页 11 CN 106190893 A 11 0003 序列表 3/3 页 12 CN 106190893 A 12 图1 说明书附图 1/1 页 13 CN 106190893 A 13 。