纯化白蛋白的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102549012 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102549012 A *CN102549012A* (21)申请号 201080019924.6 (22)申请日 2010.05.07 09159642.9 2009.05.07 EP C07K 14/765(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 19/00(2006.01) (71)申请人 诺维信生物制药丹麦公司 地址 丹麦鲍斯韦 申请人 普罗米蒂克生物科学有限公司 (72)发明人 L.E. 布拉克威尔 J. 卡梅隆 P.H. 莫顿 S.J. 伯顿 R.A. 多德 。

2、M.J. 伯顿 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 史悦 (54) 发明名称 纯化白蛋白的方法 (57) 摘要 公开了一种改进的纯化白蛋白 ( 或其变体或 片段 )、 含白蛋白 ( 或其变体或片段 ) 的融合蛋白 或者含白蛋白 ( 或其变体或片段 ) 的缀合物的方 法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.11.07 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010/056262 2010.05.07 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/128142 EN 2010.11.11 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书。

3、 13 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 13 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种用于纯化白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含 白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法， 所述方法包括 ： (i) 用含白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白 或其变体或片段的缀合物的水溶液上样包含结合在固体支持物上的白蛋白特异性配体的 固体基质 ； (ii) 洗涤所述基质以除去至少一些杂质 ； 并 (iii) 从所述基质上洗脱白蛋白或其变体或片段、 。

4、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋 白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物， 以提供纯化的白蛋白或其变体或片段、 含白蛋 白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。 2. 依照权利要求 1 所述的方法， 其中所述白蛋白源自哺乳动物， 如人、 兔、 小鼠、 山羊、 绵羊、 牛 ； 或者源自禽类， 如鸡。 3. 依照权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中所述白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其 变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物含有与 HSA 的序列 (SEQ ID NO ： 1) 具有至少 60序列同一性， 优选至少 70， 优选至少 80， 优选至少 85同。

5、一性， 更 优选至少 90同一性， 甚至更优选至少 95同一性， 甚至更优选至少 97的序列同一性， 以及最优选至少 99序列同一性的序列。 4. 依照权利要求 3 所述的方法， 其中与 HSA 具有至少 80序列同一性的序列包含至 少 10 个连续的氨基酸， 更优选至少 25 个氨基酸， 更优选至少 50 个氨基酸， 以及最优选至少 100 个氨基酸。 5. 依照权利要求 1 所述的方法， 其中所述白蛋白特异性配体是 2- 氯 -4， 6- 二 (2 - 硫 代苯胺 )-S- 三嗪。 6.依照权利要求1所述的方法， 其中所述包含白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白(或其 变体或片段 ) 的融合蛋。

6、白或者含白蛋白 ( 或其变体或片段 ) 的缀合物的水溶液选自发酵上 清液、 部分纯化的发酵上清液、 血清、 血清级分或者部分纯化的血清或血清级分、 转基因原 料的乳或者转基因植物的提取物。 7. 依照权利要求 1 或权利要求 6 所述的方法， 其中上样到所述基质上的包含白蛋白或 其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合 物的水溶液具有 4-9.5， 更优选 pH4-9， 甚至更优选 4-8， 以及最优选 4-7 的 pH。 8.依照权利要求1所述的方法， 其中所述洗涤是通过具有连续升高的pH的一次或多次 洗涤进行的。 9. 依照权利要求 8 所述的方法，。

7、 其中第一次洗涤具有在 pH4.0-6.0 的范围内的 pH。 10.依照权利要求8或9所述的方法， 其中最后一次洗涤具有在pH7.0-8.0的范围内的 pH。 11. 依照权利要求 8-10 所述的方法， 其中在第一次和最后一次洗涤步骤之间具有至少 一次额外的洗涤步骤。 12. 依照权利要求 1 所述的方法， 其中使用含有脂肪酸的盐或硫氰酸盐的水溶液， 或者 在 pH10 或更高的条件下， 从所述基质上洗脱所述白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变 体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。 13.依照权利要求12所述的方法， 其中所述的脂肪酸的盐在水中具有大于10mM的溶解 权。

8、 利 要 求 书 CN 102549012 A 2 2/2 页 3 度。 14. 依照权利要求 13 所述的方法， 其中所述的脂肪酸盐是选自丁酸、 戊酸、 己酸、 庚酸、 辛酸、 壬酸、 癸酸的盐。 15. 依照权利要求 12-14 所述的方法， 其中洗脱缓冲液中所述脂肪酸盐的浓度是在 5mM-0.5mM 的范围内， 优选在 10mM-100mM 的范围内。 16.依照权利要求12所述的方法， 其中所述硫氰酸盐是选自钠、 钾、 铵、 钡或其他1族或 2 族碱金属的盐。 17. 依照权利要求 12 或 16 所述的方法， 其中所述硫氰酸盐以 5mM-1M 的范围内， 优选 10mM-500mM 。

9、的范围内的浓度使用。 权 利 要 求 书 CN 102549012 A 3 1/13 页 4 纯化白蛋白的方法 0001 序列表索引 0002 本申请含有计算机可读形式的序列表。该算机可读形式通过提述并入本文。 技术领域 0003 本发明涉及一种用于纯化白蛋白、 其变体或片段 )， 含白蛋白、 其变体或片段的融 合蛋白， 或者含白蛋白、 其变体或片段 ) 的缀合物的方法。白蛋白可以是获得自动物或微生 物如酵母的血清白蛋白， 如人血清白蛋白。 背景技术 0004 白蛋白用于治疗有严重烧伤， 休克或失血的病人。它也用于补充培养高等真核细 胞的培养基和作为药理学活性化合物 ( 其中许多需要稳定化 )。

10、 的赋形剂。白蛋白融合蛋白 是一种蛋白与白蛋白或与其变体或片段的融合体， 并且提高所述蛋白的半衰期， 如增加的 体内半衰期。 目前， 白蛋白是从血液产品， 如血清中获得， 或在微生物， 如酵母中或由转基因 植物或动物重组产生。为了提供足够纯的产品以满足使用者的需要和 / 或获得高产量的产 品， 白蛋白必须从生产源中纯化出来。 0005 目前白蛋白产品的一个问题是所需的纯化方法。 能够获得高纯度但是这需要多个 费时和 / 或昂贵的层析纯化步骤。例如， WO 2000/044772 中描述的纯化方法包括三步骤的 方法 ： 阳离子交换层析然后是阴离子交换层析然后是染料结合 ( 亲和 ) 层析。因此，。

11、 需要一 种更简单的纯化方法。 发明内容 0006 本发明提供一种更简单的白蛋白纯化方法。 因此本发明涉及一种用于纯化白蛋白 或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀 合物的方法， 该方法包括 ： 0007 (i) 用包含白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含 白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样于包含结合在固体支持物上的白蛋白特异 性配体的固体基质 ； 0008 (ii) 洗涤所述基质以除去至少一些杂质 ； 并 0009 (iii) 从基质上洗脱白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋 白或者含白蛋白或其变体或。

12、片段的缀合物， 获得纯化的白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白 或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。 0010 发明人已鉴定了可以用一种单一亲和步骤代替先前白蛋白纯化中使用的公知的 分离步骤， 如阳离子交换和染料结合方法， 所述单一亲和步骤相对于这些公知步骤提高了 不想要的蛋白的清除和 / 或提高了产量。 0011 在整个本说明书中， 术语 “白蛋白” 包括天然存在的白蛋白、 白蛋白相关蛋白和其 变体， 如天然的或工程化的变体。变体包括多态性， 片段如结构域和亚结构域， 片段和 / 或 说 明 书 CN 102549012 A 4 2/13 页 5 融合蛋白。 白蛋白可与S。

13、EQ ID No.1具有至少40， 50， 60， 70， 80， 90， 95， 96， 97， 98， 99的相 似性或同一性。 0012 附图简述 0013 图 1.Prosaptide 白蛋白融合体纯化的 SDS-PAGE， 见实施例 2。 0014 0015 图 2 显示 T20 白蛋白融合体纯化的 SDS-PAGE， 见实施例 2。 0016 0017 0018 图 3 显示 IL1RA 白蛋白融合体纯化的 SDS-PAGE， 见实施例 2。 0019 说 明 书 CN 102549012 A 5 3/13 页 6 0020 图 4 显示 AlbuPureTM 纯化的动物白蛋白的 。

14、SDS-PAGE， 见实施例 8。 0021 0022 图 5 显示 AlbuPureTM 纯化的白蛋白片段的 SDS-PAGE， 见实施例 8。 0023 0024 发明详述 0025 本发明涉及一种纯化白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋 白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法。在本申请和权利要求中， 术语 “纯化” 意 指一种方法， 通过该方法至少一种不希望得到的化合物， 如细胞碎片、 其他血浆或宿主细胞 蛋白、 盐、 脂质碳水化合物等， 相对于希望得到的化合物减少了。取决于用于此方法的起始 材料， 可从希望得到的化合物， 白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或。

15、片段的融合蛋 白中完全地或部分地除去不希望得到的化合物。 说 明 书 CN 102549012 A 6 4/13 页 7 0026 作为血浆的最丰富的蛋白质， 白蛋白是本领域已知的， 人们已经从大量哺乳动物 和禽类中描述和表征了白蛋白， 并认为其在维持正确的渗透压中具有作用并且其在转运血 流中多种化合物中也具有作用。 0027 原则上本发明的方法可用于纯化任何已知白蛋白， 例如源自人、 狗、 绵羊、 山羊、 牛 (bovine)、 奶牛(cow)、 驴、 兔、 小鼠、 大鼠、 仓鼠、 豚鼠和鸡(chicken)的白蛋白。 优选的白蛋 白是人血清白蛋白， 尤其是具有 SEQ ID NO ： 1 。

16、中公开的序列的人血清白蛋白。 0028 本发明所述的白蛋白变体意指具有白蛋白整体结构但与亲本白蛋白相比已改变 了至少一个氨基酸残基的化合物。其中亲本白蛋白是理解为天然的未改变的白蛋白化合 物。变体可与亲本白蛋白在多于一个位置上不同， 而且原则上只要变体保持白蛋白的整体 结构， 对于改变的数目没有确定的上限， 所述改变包括氨基酸残基的取代、 缺失或插入以及 化学修饰。在一个优选实施方案中， 与亲本白蛋白相比白蛋白变体包含 1 个改变， 优选地至 少 2 个改变， 更优选至少 5 个改变， 更优选至少 10 个改变， 甚至更优选至少 20 个改变， 以及 最优选具有至少 25 个改变。 0029 。

17、白蛋白变体与亲本白蛋白优选地具有至少 60的序列同一性， 优选地至少 70 的序列同一性， 更优选至少 80的序列同一性， 甚至更优选至少 90的序列同一性， 甚至 更优选至少 95的序列同一性， 最优选与亲本白蛋白具有至少 98的序列同一性。 0030 在一个优选实施方案中， 白蛋白或其片段或变体与 SEQ ID No.1 具有至少 40， 50， 60， 70， 80， 90， 95， 96， 97， 98， 99的序列同一性。 0031 同一性 ： 两条氨基酸序列之间或两条核苷酸序列之间的相关性由参数 “同一性” 来 描述。 0032 就本发明而言， 两条氨基酸序列之间的同一性的程度是使。

18、用如 EMBOSS 程序包 (EMBOSS ： The European Molecular Biology Open SoftwareSuite， Rice 等， 2000， Trends in Genetics 16 ： 276-277)( 优选版本 3.0.0 或更新的版本 ) 中的 Needle 程序所执行的 Needleman-Wunsch 算法 (Needleman 和 Wunsch， 1970， J.Mol.Biol.48 ： 443-453) 来确定的。 使用的可选参数是 ： 缺口产生罚分为10， 缺口延伸罚分为0.5， 以及EBLOSUM62(BLOSUM62的 EMBOSS。

19、 版本 ) 取代矩阵。将标记为 “最长同一性” 的 Needle 输出 ( 使用 -nobrief 选项获 得 ) 用作百分比同一性， 其是如下计算的 ： 0033 ( 相同的残基数 x100)/( 比对的长度 - 比对中的缺口总数 )。 0034 在描述本发明的多种变体时， 应用下述的命名法以便参考。 在所有的情况中， 应用 了公认的 IUPAC 单字母或三字母氨基酸缩写。 0035 取代 ： 对于氨基酸取代， 采用了如下的命名法 ： 原始氨基酸， 位置， 取代的氨基 酸 。因此， 苏氨酸在位置 226 用丙氨酸取代记为 “Thr226Ala” 或 “T226A” 。多个位置突变 通过加入标。

20、记 (“+” ) 分开， 例如，“Gly205Arg+Ser411Phe” 或 “G205R+S411F” ， 代表分别在 位置 205 用精氨酸 (R) 取代甘氨酸 (G) 和在位置 411 用苯丙氨酸 (F) 取代丝氨酸 (S) 的突 变。 0036 缺失 ： 对于氨基酸缺失， 采用了如下命名法 ： 原始氨基酸， 位置 *。因此， 在位置 195 缺失甘氨酸记为 “Gly195*” 或 “G195*” 。多个缺失通过加入标记 (“+” ) 分开， 例如， “Gly195*+Ser411*” 或 “G195*+S411*” 。 0037 插入 ： 对于氨基酸插入， 采用了如下的命名法 ： 原。

21、始氨基酸， 位置， 原始氨基酸， 说 明 书 CN 102549012 A 7 5/13 页 8 新插入的氨基酸 。因此， 在位置 195 的甘氨酸之后插入赖氨酸记为 “Gly195GlyLys” 或 “G195GK” 。多个氨基酸插入记为 原始氨基酸， 位置， 原始氨基酸， 新插入的氨基酸 #1， 新插入的氨基酸 #2 ； 等等 。例如， 在位置 195 的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为 “Gly195GlyLysAla” 或 “G195GKA” 。 0038 在此情况下， 通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而 对插入的氨基酸残基进行编号。因此， 在上一例子中序列为 。

22、： 0039 亲本 ： 变体 ： 195 195 195a 195b G G- K- A 0040 在一个优选实施方案中， 白蛋白变体衍生自具有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的人血清 白蛋白， 通过取代、 缺失或插入至少1个氨基酸残基， 优选至少2个氨基酸残基， 更优选至少 5 个氨基酸残基， 甚至更优选至少 10 个氨基酸残基进行。 0041 在另一个优选实施方案中， 变体白蛋白由包含源自人血清白蛋白的一部分和源自 另一种白蛋白的一部分的杂合白蛋白组成。 0042 具有取代 D494N 的在 (Biochim Biophys Acta.1991， 1097 ： 49-54) 中公开的。

23、具有 更低的血浆半衰期的天然变体可以作为变体白蛋白的例子提及。 0043 优选的白蛋白变体包括为了在表面提供一个反应性巯基而在白蛋白中产生的变 体， 例如在未公布的 PCT 申请 PCT/EP2010/051751( 通过提述包括在本申请中 ) 中描述的 SEQ ID NO ： 1 的变体 ： L585C， D1C， A2C， D562C， A364C， A504C， E505C， T79C， E86C， D129C， D549C， A581C， D121C， E82C， S270C， A578C， L595LC， D1DC， A2AC， D562DC， A364AC， A504AC， E50。

24、5EC， T79TC， E86EC， D129DC， D549DC， A581AC， A581AC， D121DC， E82EC， S270SC， A579AC， C360*， C316*， C75*， C168*， C558*， C361*， C91*， C124*， C169*和 C567*， 以及在未公布的欧洲专 利申请EP09174698.2(通过提述包括在本申请中)中公开的SEQ ID NO ： 1在位置492， 493， 494， 495 和 496 中改变的变体。 0044 白蛋白片段意欲理解为包含白蛋白分子的一部分但其中缺少白蛋白分子的至少 另一部分的分子。片段可包含白蛋白的 。

25、N 端或 C 端部分或者白蛋白的内部部分， 而且它可 以甚至由两个或多个在天然白蛋白分子中不直接相连的白蛋白片段组成。 结构域I、 结构域 II、 结构域 III 以及它们其中两者的组合， 可作为优选的白蛋白片段的例子。术语 “白蛋白 片段” 也涵盖白蛋白变体的片段。 0045 白蛋白片段可以甚至包括一个白蛋白的一个或多个部分， 以及一个或多个不同白 蛋白的一个或多个部分， 例如， 人血清白蛋白的一部分与兔血清白蛋白的另一部分。 0046 白蛋白的片段包括至少10个氨基酸残基， 优选地至少25个氨基酸残基， 更优选至 少 50 个氨基酸残基， 甚至更优选至少 100 个氨基酸残基， 更优选至少。

26、 200 个氨基酸残基， 更 优选至少 300 个氨基酸残基， 更优选至少 400 个氨基酸残基， 以及最优选至少 500 个氨基酸 残基。 0047 本发明中， 术语包含白蛋白或其变体或片段的 “融合蛋白” 意指包含白蛋白或其变 说 明 书 CN 102549012 A 8 6/13 页 9 体或片段序列以及一个或多个不同于白蛋白或其变体或片段的序列的多肽。 原则上融合蛋 白的非白蛋白部分可以为任意多肽， 但是， 优选的是其具有医药用途。 0048 在融合蛋白的白蛋白部分和非白蛋白部分之间可以或可以不具有接头序列， 所述 接头可以含有特定蛋白酶的切割位点。 0049 在一个优选实施方案中， 。

27、融合蛋白的非白蛋白部分是具有医药用途的多肽， 例如 具有治疗作用的多肽。 0050 WO 9315199， WO 01079271 和 WO 03059934( 通过提述并入本申请 ) 中公开的白蛋 白融合多肽可以作为融合蛋白的例子。 0051 本发明中含白蛋白或其变体或片段的缀合物可意指通过将一个或多个缀合配偶 体化学附接于白蛋白或其变体或片段上而制备的化合物。 缀合配偶体可以是生物活性化合 物， 如治疗或诊断化合物。 治疗化合物可为用于癌症化疗的化疗药物， 其可为抑制细胞生长 的或细胞毒性的 ； 其可为肿瘤抑制试剂。 0052 缀合配偶体可以使用本领域已知的方法附接于白蛋白或其变体或片段。。

28、 0053 WO 2009019314和未公布的欧洲专利申请EP 09174698.2(以提述方式并入)中能 够找到合适的缀合配偶体和连接缀合配偶体与白蛋白或其变体或片段的方法的例子。 0054 所述方法中的第一步是提供含有结合于固体支持物的白蛋白特异性配体的固体 基质。 含有结合到固体支持物上的白蛋白特异性配体的固体基质具有特异地结合白蛋白的 能力。 所述具有以比其他化合物更高的亲和力结合特定蛋白的能力的基质在本领域中是公 知的。 0055 原则上白蛋白特异性配体可为任意对白蛋白具备高亲和力的配体。 原则上对白蛋 白有特异性的配体可通过以下发现 ： 将候选配体结合于固体支持物， 通过使候选配。

29、体与白 蛋白溶液接触测试亲和力， 用不含白蛋白的溶液冲洗配体， 随后通过冲洗后附接于候选配 体的白蛋白的量评估候选配体结合白蛋白的能力。 0056 优选的白蛋白特异性配体是 2- 氯 -4， 6- 二 (2 - 硫代苯胺 )-S- 三嗪。 0057 原则上固体支持物可以是在预设条件下是惰性的任意固相材料。 惰性是指固体支 持物与包含白蛋白的水溶液、 洗涤溶液、 洗脱溶液的组分不发生或仅在不显著程度上发生 化学相互作用。 0058 本发明可使用的固体支持物的例子包括聚合物， 例如纤维素或琼脂糖及其衍生 物、 聚乙烯、 聚苯乙烯、 聚丙烯酸 ( 酯 ) 类和硅酸盐。 0059 上述的固体支持物和将。

30、白蛋白特异性配体结合于固体支持物的方法是本领域公 知的， 技术人员知晓如何将上述教导应用到本发明中。 WO 97/10887中可以发现用于将白蛋 白特异性配体结合于固体支持物的优选方法的例子。 特别优选的含有结合于固体支持物的 白蛋白结合配体 2- 氯 -4， 6- 二 (2 - 硫代苯胺 )-S- 三嗪的固体基质是以商品名 Albupure TM 由 ProMetic BioSciences Ltd， Cambridge， UK 可得到的固体基质。 0060 通常地在筒、 柱或能够填充固体材料的其他形式容器中填充含有白蛋白结合配体 的固体基质作为固定床， 而且含有白蛋白或其变体或片段、 含白。

31、蛋白或其变体或片段的融 合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液， 洗涤和洗脱溶液能够流过含有固 体基质的固定床， 然而， 其他公知的技术， 如将固体基质与适当的溶液在容器中混合然后是 分离步骤(如过滤或离心)， 以及流化床技术也可应用于本发明的方法。 提供亲和材料如含 说 明 书 CN 102549012 A 9 7/13 页 10 有白蛋白特异性配体的固体基质的技术是本领域已知的， 而且选择并将合适的技术应用于 本发明在普通实施者的技术范围内。 0061 原则上含有白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含 白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液可以是任意如此的溶。

32、液。 含有白蛋白或其变体或 片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的合适 水溶液的例子包括 ： 血浆或其级分， 能够产生上述蛋白的细胞的细胞培养物的培养物上清 液， 能够产生上述蛋白的转基因动物的乳和能够产生上述蛋白的转基因植物的提取物。含 有白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或 片段的缀合物的水溶液可为其中生产蛋白的培养基， 例如细胞培养物上清液， 或者其部分 纯化的级分。 0062 待与固体基质接触的含有白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融 合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液的pH具有。

33、4-9.5， 优选4-9， 更优选 4-8， 及最优选 4.5-8 范围内的 pH。若水溶液本身不具备上述 pH 值， 通常需要使用公知的 pH 调节化合物， 如用于提高 pH 的氢氧化钠或氢氧化钾和用于降低 pH 的盐酸、 硫酸或乙酸， 来调节 pH。 0063 采用公知的技术将含有白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合 蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样到含有白蛋白结合配体的固体 基质上。熟练的技术人员可以理解的是可考虑到因素如上样量、 上样速率、 流动粘度、 接触 时间等优化上样条件， 而且此优化完全在本领域熟练技术人员的技术范围内。 0064 在将含有白蛋。

34、白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白 蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样到固体基质的过程中， 白蛋白或其变体或片 段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物结合于连 接于固体基质的白蛋白结合配体。 0065 上样后， 洗涤含白蛋白结合配体 ( 其现在结合于白蛋白或其变体或片段、 含白蛋 白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物 ) 的固体基质以除 去杂质。 0066 本发明的杂质意指除包含白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融 合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液中包含的白蛋白或其变体或片段、。

35、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物以外的化合 物。杂质可以是化合物， 例如蛋白、 碳水化合物、 脂类、 小有机分子、 盐类、 化学试剂等， 而且 通常存在多种不同杂质的混合物。 0067 通常用含有水、 无机盐和缓冲液体系的水溶液洗涤基质。还可存在额外的化合物 如表面活性剂、 防腐剂、 螯合剂。通常洗涤溶液是本领域已知的并且可用于本发明。在将固 体基质置于固定床的情况下， 洗涤步骤通常通过用对应于至少1体积固定床， 优选至少2体 积， 更优选至少 3体积， 最优选至少 5 体积固定床的洗涤溶液灌注 (perfusing) 固定床来进 行。 0068 洗涤溶液可。

36、具有 4-9.5， 更优选 4-9， 甚至更优选 4-8， 及最优选 5-8 范围内的 pH。 0069 洗涤可在一步或多步中进行， 其中在每步中用洗涤溶液洗涤固体基质。 0070 优选使用两个或更多个洗涤步骤， 其可使用具有相同 pH 的洗涤溶液或具有不同 说 明 书 CN 102549012 A 10 8/13 页 11 pH 的洗涤溶液进行。在一个优选实施方案中， 两个或更多个洗涤步骤的 pH 是不同的， 并且 两个或更多个洗涤步骤的 pH 是连续升高或连续降低的， 优选地两个或更多个洗涤步骤的 pH 是连续升高的。 0071 在连续升高 pH 的两个或更多个洗涤步骤的实施方案中， 第一。

37、洗涤步骤的 pH 优 选在 pH 4.0-8.0 的范围内， 优选在 pH 4.0-7.0 的范围内， 更优选在 pH 4.0-6.0 的范围 内。最后洗涤步骤优选在 pH 7.0-9.5 的范围内， 优选在 pH8.0-9.5 的范围内， 最优选在 pH 8.5-9.5的范围内。 优选地在第一和最后步骤间有至少一个进一步的步骤， 如在第一和最后 步骤间有 1， 2， 3， 4 或 5 步。 0072 洗涤步骤后， 用含有脂肪酸的盐或硫氰酸盐的洗脱溶液， 或使用具有 10.0 或更高 pH 的洗脱溶液， 或其任意组合， 从固体基质洗脱白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体 或片段的融合蛋白或。

38、者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。 0073 脂肪酸的盐优选是在洗脱条件下在洗脱溶液中具有至少 10mM， 优选地至少 20mM， 更优选至少 50mM， 甚至更优选至少 100mM， 最优选至少 500mM 溶解度的脂肪酸的盐。合适的 脂肪酸的盐可提及乙酸、 丙酸、 丁酸、 戊酸、 己酸、 庚酸、 辛酸、 壬酸和癸酸的钠盐和钾盐。 0074 在洗脱条件下的脂肪酸的盐的浓度优选在 5mM-0.5mM 的范围内， 优选在 10mM-100mM 的范围内。 0075 原则上根据本发明可使用任意硫氰酸盐， 但是， 优选使用在洗脱条件下在洗脱溶 液中具有至少 10mM， 优选的至少 20mM， 更优选。

39、至少 50mM， 甚至更优选至少 100mM， 甚至更优 选至少500mM， 最优选至少1M溶解度的硫氰酸盐。 此外， 优选使用在终产物中具有可接受的 阳离子的硫氰酸盐。根据本发明可使用的硫氰酸盐的合适的例子包括 ： 硫氰酸钠和硫氰酸 钾。硫氰酸盐优选在洗脱溶液中以 5mM-1M 范围内， 优选 10mM-500mM 范围内的浓度使用。 0076 洗脱液可进一步包括缓冲液系统、 盐和防腐剂， 优选药用级的。 基于本申请和亲和 介质领域的教导组成洗脱溶液在普通实施者的技术范围内。 0077 洗脱通常用小体积进行从而以高浓度获得白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其 变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白。

40、或其变体或片段的缀合物， 但另一方面， 又希望使用 更大体积以获得更大产量。因此， 技术人员需要使用公知的优化方法， 相对于体积、 流速等 优化洗脱。 0078 根据本发明的方法， 白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的融合蛋 白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的回收率较高， 通常高于 25， 优选高于 40， 更优选高于50， 更优选高于60， 甚至更优选高于70， 甚至更优选高于80， 最优选高 于 90。 0079 本发明的方法可以作为在本发明的方法之前和 / 或之后涉及一个或多个额外的 纯化步骤的更长的纯化流程的一部分， 或者它可以无额外步骤而进行。 通常， 尤其是固体基 。

41、质是在固定床中提供时， 为了从包含白蛋白或其变体或片段、 含白蛋白或其变体或片段的 融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物水溶液中去除特殊材料和 / 或脂质胶束， 优选在本发明的方法前进行分离步骤， 否则所述特殊材料和 / 或胶束可阻塞固定床并使床 层的流动性质恶化。 0080 在如下实施例中进一步说明本发明， 所述实施例不应被认为以任何方式限制本发 明的范围。 说 明 书 CN 102549012 A 11 9/13 页 12 实施例 0081 材料 ： 0082 固体基质 ： 使用含有 2- 氯 -4， 6- 二 (2 - 硫代苯胺 )-S- 三嗪的固体基质， 此固体 基质可以商品名 。

42、“Albupure TM” 由 ProMetic BioSciences Ltd， Cambridge， UK 得到。 0083 重组人血清白蛋白 (rHSA) ： 使用含有编码人血清白蛋白的表达质粒的重组酵母 的发酵的培养物上清液作为 rHSA 的来源。表达质粒的产生、 转化酵母菌株、 发酵条件基本 上如 WO 00/44772 实施例 1 所公开的。 0084 实施例 1 ： rHSA 的两步 AlbuPureTM 纯化与三步传统纯化的比较 0085 阳离子交换， 阴离子交换和染料亲和层析的常规三步纯化方法如 WO 2000/044772 中所述进行。 0086 两步 AlbuPureTM。

43、 纯化通过如下进行 ： 使用乙酸和水调整用于层析的 rHSA 发酵上 清液以实现 pH 为大约 5.3 且导电率为大约 3mS.cm-1。将用 AlbuPureTM 基质填充的柱用 50mM 乙酸钠 pH5.3 平衡。将相当于 20mg rHSA/ 每 mL 基质的调整后样品的体积上样。连 续用 50mM 乙酸钠 pH5.3、 50mM 磷酸钠 pH6.0、 50mM 磷酸钠 pH7.0 和 50mM 乙酸铵 pH8.0 洗 涤基质， 之后用 50mM 乙酸铵， 10mM 辛酸钠 pH7.0 洗脱， 并最终用 0.5M 氢氧化钠再生。将 AlbuPureTM 洗脱物用水稀释到 2.5mS/cm。

44、 并用乙酸将 pH 调整到 pH 5.5 以调整用于阴离子 离子交换层析。 如WO 2000/044772所述使用DE-FF Sepharose进行阴离子交换层析。 由通 过 GP-HPLC 测量的浓度和相关的回到开始时的总量 (related back to the total amount at the start) 计算白蛋白产量。用抗酵母抗体的夹心法 ELISA 测量宿主细胞蛋白 (HCP) 并测量相对于起始材料的清除倍数。 0087 表 1 ： 0088 0089 因此， 两步法给出多 18产量 ( 产品 ) 并保持大约相当的 HCP 水平 ( 在测定法的 限度内 )。 0090 实。

45、施例 2 ： rHSA 融合体 0091 用乙酸和水对分别含有 prosaptide、 T20(PCT/IB03/00434) 和 IL1RA 的 C- 末 端 rHSA 融合体的酵母来源的培养物上清液进行调整用于层析以实现大约 5.3 的 pH 和 2.6-3.3mS.cm-1的导电率。将用 AlbuPureTM 基质填充的 1.6cm11.0cm(22.1mL) 柱子用 50mM乙酸钠pH5.3平衡。 将相当于20mg融合蛋白/每mL基质的调整后样品的体积上样。 连 续用50mM乙酸钠pH5.3、 50mM磷酸钠pH6.0、 50mM磷酸钠pH7.0和50mM乙酸铵pH8.0洗涤基 质， 。

46、之后用50mM乙酸铵， 10mM辛酸钠pH7.0洗脱， 并最终用0.5M氢氧化钠再生。 Prosaptide 白蛋白融合体纯化的 SDS PAGE 如图 1 所示。T20 白蛋白融合体纯化的 SDS-PAGE 如图 2 所 说 明 书 CN 102549012 A 12 10/13 页 13 示。IL1RA 白蛋白融合体纯化的 SDS-PAGE 如图 3 所示。 0092 实施例 3 ： 抗 FITC(scFv(vHvL)-rHSA-FLAG) 抗体 0093 用水对含有抗 FITC(scFv(vHvL)-rHSA-FLAG)(EP 申请 No 09159642 公开 ) 抗体 融合体 (N-。

47、 端融合体 ) 的酵母来源的培养物上清液进行调整用于层析以实现 6.2 的 pH 和 7.9mS.cm-1的导电率。将用 AlbuPureTM 基质填充的 4.4cm11.0cm(167.3mL) 柱子用 50mM 磷酸钠 pH6.0 平衡。将相当于 9.5mg 蛋白 / 每 mL 基质的调整后样品的体积上样。连续用 50mM 磷酸钠 pH6.0、 50mM 磷酸钠 pH7.0 和 50mM 乙酸铵 pH8.0 洗涤基质， 先用 50mM 乙酸铵， 10mM辛酸钠pH7.0然后用50mM乙酸铵， 30mM辛酸钠， 200mM氯化钠pH7.0洗脱结合的蛋白。 基质用 0.5M 氢氧化钠再生。如通。

48、过 GP.HPLC 估计的， 在合并的 2 洗脱物中回收了总共 84 的抗 FITC(scFv(vHvL)-rHSA-FLAG)。 0094 实施例 4 ： 抗 AMA(vNAR-rHSA-FLAG) 抗体融合体 0095 含有抗 AMA(vNAR-rHSA-FLAG) 抗体融合体 (N- 端融合体 ) 的酵母来源的培养物上 清液无需调整， 在 5.8 的 pH 和 47.0mS.cm-1的导电率进行纯化。将用 AlbuPureTM 基质填充 的2.6cm11.0cm(58.4mL)柱子用50mM磷酸钠pH6.0平衡并将相当于14.25mg蛋白/每mL 基质的调整后样品的体积上样。先用 50m。

49、M 磷酸钠 pH6.0 然后用 50mM 乙酸铵 pH8.0 洗涤基 质。先用 50mM 乙酸铵， 10mM 辛酸钠 pH7.0， 然后用 50mM 乙酸铵， 30mM 辛酸钠， 200mM 氯化钠 pH7.0， 最后用含 1M 硫氰酸钾的磷酸盐缓冲盐水 pH8.6 洗脱。基质用 0.5M 氢氧化钠再生。 如通过 GP.HPLC 估计的， 在合并的 3 洗脱物中回收了总共 53的抗 AMA(vNAR-rHSA-FLAG)。 0096 实施例 5 ： 在 pH 范围 4.0-10.0 中 AlbuPure 基质上样量 (loading) 的影响 0097 研究了在 pH4.0， 5.0， 6.0， 6.5， 7.0， 7.5， 8.0， 8.5， 9.0， 9.5 和 10.0， 上样量对分步 收率和基质容量的影响。 用合适pH增量的缓冲液稀释部分纯化的N-端抗-FITC scFv-rHA 融合体至10mg.mL-1来制备上样材料。 然后检查每一上样样品的pH， 必要时用NaOH或冰醋酸 调节。 用1mL 50mM乙酸钠pH5.0平衡含有200uL AlbuPureTM基质(ProMetic Biosciences) 的5mm直径10mm床高离心驱动的MediaScoutMiniColumns。 每根柱子施加足够的上样。