书签分享收藏举报版权申诉 / 14

立即下载加入VIP,免费下载

当前位置：首页 > > 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法.pdf

一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法.pdf

上传人：南***

文档编号：8697949

上传时间：2020-12-13

格式：PDF

页数：14

大小：728.46KB

《一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法.pdf（14页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510351160.5 (22)申请日 2015.06.19 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 104988133 A (43)申请公布日 2015.10.21 (73)专利权人杭州师范大学地址 310036 浙江省杭州市下沙高教园区学林街16号 (72)发明人谢恬殷晓浦马转转谌容庞潇卿 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人黄美娟李世玉 (51)Int.Cl. C12N 11/18(2006.01) C12N 11。

2、/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) (56)对比文件顾旭炯等.海藻酸钠包埋法共固定-淀粉酶和糖化酶的研究. 化学与生物工程 .2006,第 23卷(第5期),第26页左栏第3段第4-7行、右栏节 1.2.1第1-7行. 叶婷婷.R型醛酮还原酶的克隆、鉴定及其催化制备(R)-CHBE的研究. 中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑 .2013, (第7期),摘要第1段，正文第17页、第19页，正文第36页第1段、图4.1，正文第47页第1-4行. 审查员熊壮壮 (54)发明名称一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法 (57)。

3、摘要本发明公开了一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的固定化方法，所述方法为：将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，滴加入CaCl2水溶液中， 4冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；通过本发明制备的共固定化酶与游离醛酮还原酶相比，催化活性提高了1.32倍，热稳定性、 pH稳定性等方面的性质也有所改善，同时，共固定化酶的重复使用降低了成本。权利要求书1页说明书6页序列表2页附图4页 CN 104988133 B 2018.06.01 CN 104988133 B 1.一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，。

4、其特征在于所述方法为：将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl2水溶液中，滴加结束后， 4冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:0.53.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30170： 1。 2.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于海藻酸钠水溶液的质量浓度为15。 3.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于 CaCl2水溶液质量浓度为0.54。 4.如权利要求1所述醛酮还原。

5、酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:1.2。 5.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述4冰箱内静置1-5h，蒸馏水洗涤2-3次。 6.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述醛酮还原酶是以醛酮还原酶酶液的形式加入，所述酶液是指将含醛酮还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 7.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，。

6、其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是以葡萄糖脱氢酶酶液的形式加入，所述酶液是指将含葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。 8.如权利要求6所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述醛酮还原酶酶液按如下方法制得：将含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中， 37过夜培养，获得菌液；按体积浓度1接种量将菌液转接于含100 g/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 37、 200rpm振荡培养至OD600达。

7、0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG， 25、 150rpm诱导表达1216h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱对其进行纯化，得到醛酮还原酶的酶液。 9.如权利要求7所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶酶液按如下方法制得：将含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中， 37过夜培养，获得菌液；按体积浓度1接种量将菌液转接于含100 g/mL氨苄霉素的LB液体培养基中， 37培养至OD600达0.6，向培养液中加入终浓度0.1mM的IPTG， 25、 150rpm诱导表达1。

8、216h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱进行纯化，得到葡萄糖脱氢酶的酶液。权利要求书 1/1 页 2 CN 104988133 B 2 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法 (一)技术领域 0001 本发明涉及一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶的包埋共固定化方法。 (二)背景技术 0002 酶作为一种生物催化剂，因其专一性强、催化效率高和作用条件温和等特性，广泛应用于医药、食品、化工等方面。但天然酶稳定性差，除了一些耐高温的酶及少数可以耐受较低pH条件的酶以外，大多数酶在高温、强酸、强碱条件下都容易变性失活；反应结束后酶与产物混合，。

9、不能重复利用，产物分离纯化困难；同时，酶的一次性使用，大大提高了生产成本，不利于连续化生产，限制了酶在工业上更广泛的应用。基于上述情况，固定化酶的概念得以提出，近年来，酶的固定化技术得到了不断发展，在综合不同固定化技术的基础上，又出现了酶的共固定化技术，目前，酶的共固定化技术在临床诊断、发酵过程控制及生物传感器制备等方面都发挥着重要作用。 0003 酶的固定化，是指采用物理或化学方法，将酶与水不溶性载体相结合的技术。固定化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性增强，可反复或连续使用及易于和产物分离的显著优点。酶的。

10、共固定化即将不同来源的几种酶或酶与某一完整细胞同时固定在同一个载体上，不仅使不同酶及细胞的各自优势得到充分发挥，而且将不同酶与细胞的生物催化性能结合起来。酶的固定化方法分为四类：吸附法，包埋法，结合法以及交联法。 0004 醛酮还原酶作为一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，可将脂肪族醛酮、芳香族醛酮、类固醇等很多羰基化合物还原成相应的醇类，在手性药物及药物中间体合成领域发挥着重要作用。利用醛酮还原酶催化4-氯-3-羰基乙酸乙酯(Ethyl4- chloro-3-oxobutanoate,COBE)不对称还原合成的(R)-或(S)-4-氯-。

11、3-羟基丁酸乙酯 (Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate,CHBE)，是多种药物活性成分如(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯、 L-肉毒碱、大环内酯A和(R)-氨基- -羟基丁酸(GABOB)等合成的关键中间体，具有重要的应用价值。 0005 在醛酮还原酶的催化反应中，都需要辅酶NAD(P)H的参与以提供反应持续进行所需电子。因此，在反应体系中维持一定浓度的NAD(P)H，是保持反应连续进行的关键因素。葡萄糖脱氢酶作为其辅酶再生系统可在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯的同时，将NADP+不断转化为NADPH，通过其与醛酮还原酶的协同作用，共同。

12、完成CHBE的生物转化过程。采用醛酮还原酶催化CHBE的合成具有高度的化学、区域和对映选择性，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，反应可在常温下进行等，相对传统化学合成工艺催化剂来说，该酶催化的反应具有很强的绿色环保概念，具有广阔的应用前景。 (三)发明内容 0006 目前催化反应使用的酮还原酶多是游离酶或全细胞，虽操作简单，但催化过程中说明书 1/6 页 3 CN 104988133 B 3 所需辅因子NAD(P)H价格比较昂贵，且酶无法重复利用，生产成本偏高，限制了酶催化方法的大规模工业化应用。 0。

13、007 本发明建立在本实验室已构建的来源多样化的各种醛酮还原酶酶库及多种重要化工中间体酶催化生产工艺的基础上，在已有的醛酮还原酶生物催化研究中，为反应循环提供NADPH的多为游离葡萄糖脱氢酶。为了克服游离酶稳定性差、不能重复利用等不足，本发明提供了一种简单、快速的醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶的包埋固定化方法，海藻酸钠作为一种常用的多孔载体，将其与酶液混合后滴入到一定浓度的CaCl2溶液中，海藻酸钠的Na+部分被Ca2+取代，形成凝胶小球颗粒，通过优化固定化条件最终获得性能改善的共固定化酶。本发明首次将醛酮还原酶催化形成CHBE这一化工中间体生产工艺中的双酶进。

14、行固定化，选用的醛酮还原酶为生物催化手性合成(R)-CHBE e.e.值达99以上的优质酶，通过将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶共固定在海藻酸钠载体上制备的共固定化酶，不仅可重复使用，降低酶制剂生产成本，也可为所构建酶库中其它酶的成本降低提供借鉴和示范。 0008 本发明所采用的技术方案是： 0009 本发明提供一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，所述方法包括：将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl2水溶液中， 4冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质。

15、量比为1:0.53.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30170： 1。 0010 进一步，所述海藻酸钠水溶液是将海藻酸钠加入沸水中溶解，冷却后加入酶，或者将海藻酸钠加入水中，置于磁力搅拌器上， 4恒温层析柜中过夜溶解。 0011 进一步，海藻酸钠水溶液的质量浓度为15。 0012 进一步， CaCl2水溶液质量浓度为0.54， CaCl2水溶液体积用量与醛酮还原酶质量计通常为50-100ml/mg。 0013 进一步，优选所述4冰箱内静置1-5h，蒸馏水洗涤2-3次。 0014 进一步，所述醛酮还原酶是以醛酮还原酶酶液的形式加入，所述醛酮还原酶酶液。

16、是指将含醛酮还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 0015 进一步，所述葡萄糖脱氢酶是以葡萄糖脱氢酶酶液的形式加入，所述葡萄糖脱氢酶酶液是指将含葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。 0016 进一步，所述醛酮还原酶按如下方法制得：将含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中， 37过夜培养，获。

17、得菌液；按体积浓度1接种量将菌液转接于含100 g/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 37、 200rpm振荡培养至OD600达 0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG， 25、 150rpm诱导表达1216h， 4、 8000rpm离心15min收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱对其进行纯化，得到醛酮还原酶的酶液。具体菌体破碎纯化的方法为：将菌体用pH 7.4的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，将重悬混合液置于冰水混合物中，利用超声破碎仪进行破壁(工作3s，间隔3s，工作时间45min)，破碎结束后， 4、 12000rpm离心30min，。

18、收集上清并用镍柱对其进行纯化，最终得到醛酮还原说明书 2/6 页 4 CN 104988133 B 4 酶纯酶液。 0017 本发明所述含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与载体pET28a连接，连接产物转化E.coli DH5 感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得重组菌pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)。 0018 进一步，所述葡萄糖脱氢酶按如下方法制得：将含SEQ。

19、 ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中， 37过夜培养，获得菌液；按体积浓度1 接种量将菌液转接于含100 g/mL氨苄霉素的LB液体培养基中， 37培养至OD600达0.6，向培养液中加入终浓度0.1mM的IPTG， 25、 150rpm诱导表达1216h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱进行纯化，得到葡萄糖脱氢酶的酶液。具体，所述菌体纯化的方法为：将菌体用pH 8.0的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，重悬混合液置于冰水混合物中超声破碎(工作3s，间隔3s，工作时间45min)，破碎结束后，。

20、4、 12000rpm离心 30min，收集上清并用镍柱进行纯化，最终得到葡萄糖脱氢酶纯酶液。 0019 本发明所述含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列与载体pET22b连接，连接产物转化E.coli DH5 感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET22b-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得工程菌pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)。 0020 本发明所述LB培养基质量组成如下： 1NaCl、 1胰蛋白胨。

21、、 0.5酵母提取物，溶剂为去离子水， pH 7.0。 0021 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在： 0022 通过本发明制备的共固定化酶与游离醛酮还原酶相比，催化活性提高了1.32倍，热稳定性、 pH稳定性等方面的性质也有所改善，并且共固定化酶的重复使用降低了成本，为醛酮还原酶工业化应用的实现提供了一定的理论依据，同时，醛酮还原酶及葡萄糖脱氢酶共固定化体系的初步构建有助于已开发的来源多样化的醛酮还原酶酶库中其它酶的进一步研究。 (四)附图说明 0023 图1是海藻酸钠浓度对固定化酶酶活的影响曲线图。 0024 图2是CaCl2浓度对共固定化酶酶活的影响柱形图。。

22、0025 图3是固定化时间对共固定化酶酶活的影响曲线图。 0026 图4是双酶之间的比例对共固定化酶酶活的影响柱形图。 0027 图5是温度对游离双酶和共固定化酶酶活的影响曲线图， 0028 ：海藻酸钠共固定化酶；：游离葡萄糖脱氢酶；：游离酮还原酶。 0029 图6是pH对游离双酶和共固定化酶酶活的影响曲线图， 0030 ：海藻酸钠共固定化酶；：游离葡萄糖脱氢酶；：游离酮还原酶。 0031 图7是游离双酶和共固定化酶的热稳定性曲线图， 0032 ：海藻酸钠共固定化酶；：游离葡萄糖脱氢酶；：游离酮还原酶。 0033 图8是游离双酶和共固定化酶的pH稳定性曲线图， 0。

23、034 ：海藻酸钠共固定化酶；：游离葡萄糖脱氢酶；：游离酮还原酶。说明书 3/6 页 5 CN 104988133 B 5 (五)具体实施方式 0035 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。 0036 实施例1制备醛酮还原酶 0037 将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与载体pET28a连接，连接产物转化E.coli DH5 感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)菌株。。

24、 0038 将pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)菌株接种于LB液体培养基中， 37过夜培养。按体积浓度1接种量将菌液转接于1L含卡那霉素(100 g/mL)的LB培养基中， 37、 200rpm振荡培养至OD600达0.6，向培养液中加入IPTG使其终浓度为0.1mM， 25、 150rpm诱导表达12 16h。 4、 8000rpm离心15min，收集菌体，用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，将重悬混合液置于冰水混合物中，利用超声破碎仪进行破壁(工作3s，间隔3s，工作时间45min)。破碎结束后， 4、 12000r。

25、pm离心30min，收集上清并用琼脂糖凝胶CL-6B镍柱对其进行咪唑梯度洗脱，纯化后最终得到浓度为7.7mg/mL的纯醛酮还原酶液。 0039 在醛酮还原酶催化的反应过程中，还原型辅酶NAD(P)H被氧化，从而引起340nm处吸光度的明显下降，可利用紫外可见分光光度计测定醒酮还原酶的酶活。 0040 醛酮还原酶活力测定方法如下：在离心管中加入30 L二甲基亚砜(DMSO)、 1 L COBE、终浓度50mM的PBS(pH7.4)缓冲液和10 L纯酶液， 30下温育5min，加入5 L 10mg/mL NADPH，混匀后吸至比色皿中，测定340nm下吸光度的下降值。醛酮。

26、还原酶的酶活定义为：在一定条件下，每分钟消耗1 mol NADPH所需酶量为一个酶活单位(U)。酶比活力则为每毫克蛋白所含酶的催化活力(U/mg)。根据340nm处吸光度变化值测得醛酮还原酶的活力为 0.32U，酶比活力为4.16U/mg。 0041 实施例2制备葡萄糖脱氢酶 0042 将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列与载体pET22b连接，连接产物转化E.coli DH5 感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET22b-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得pET22b-GDH104-E.co。

27、li BL21(DE3)菌株。 0043 将成功构建的pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)菌株接种于含氨苄霉素(100 g/ mL)的液体LB培养基中， 37、 220rpm过夜培养。取10mL菌液转接于1L LB培养基中， 37、 200rpm振荡培养至OD600达0.6，向培养液中加入IPTG使其终浓度为0.1mM， 25、 150rpm诱导表达1216h。离心收集菌体，用pH 8.0的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，重悬混合液置于冰水混合物中超声破碎(工作3s，间隔3s，工作时间45min)。破碎结束后， 4、 12000rpm离。

28、心30min，收集上清并用琼脂糖凝胶CL-6B镍柱进行纯化，最终得到浓度为 6.25mg/mL的纯葡萄糖脱氢酶液。 0044 葡萄糖脱氢酶催化的反应过程中，氧化型辅酶NAD(P)被还原生成NAD(P)H，从而引起340nm处吸光度的明显上升。 0045 葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：在离心管中加入10 L1.5M葡萄糖、 PBS(pH7.4) 缓冲液和10 L纯酶液， 37下温育5min，加入5 L 10mg/mLNADP，混匀后吸至比色皿中，测定 340nm下吸光度的动力学变化。定义每分钟消耗1 mol NADP所需酶量为一个酶活单位(U)，酶比活力则为每毫克蛋白所含酶。

29、的催化活力(U/mg)。根据340nm处吸光度变化值测得GDH的说明书 4/6 页 6 CN 104988133 B 6 酶活力和酶比活力分别为0.24U和3.84U/mg。 0046 实施例3将游离双酶制成共固定化酶 0047 将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3的海藻酸钠水溶液(醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶总重量以海藻酸钠水溶液体积计为0.683mg/ml)，充分搅拌使双酶液与海藻酸钠水溶液混合均匀，注射器吸取混合液缓慢滴入20ml质量浓度2CaCl2水溶液。

30、中，滴加过程中不断搅拌，结束后4冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到固定化凝胶颗粒，即共固定化酶。 0048 表1共固定化酶催化反应参数 0049 0050 共固定化酶活力测定方法如下：用纯水将表1中反应体系补齐至1mL， 30、 180r/ min反应1h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取上层有机相在真空干燥箱中抽干， 1mL异丙醇溶解，经滤膜处理后气相色谱法(GC)检测样品。 0051 共固定化酶活定义为：每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量，即一定条件下， 1min催化1 mol底物(COBE)转化为产物(CHBE)所需酶量，表示为 m。

31、olmin-1mg-1。 0052 海藻酸钠浓度为3时共固定化酶活性为4.99U/mg。 0053 实施例4海藻酸钠水溶液浓度对共固定化醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的影响 0054 将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，分别将1mL质量浓度1、 2、 3、 4、 5的海藻酸钠水溶液加入双酶混合液中，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液缓慢滴入20ml质量浓度2CaCl2 水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。 0055 对利用不同浓。

32、度海藻酸钠制备的共固定化酶分别进行相对酶活检测，结果见图1，海藻酸钠浓度为3时共固定化酶活性最高，为相同质量游离酮还原酶的1.2倍。 0056 实施例5CaCl2浓度对共固定化酶酶活的影响 0057 将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3的海藻酸钠水溶液，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液分别滴入20ml质量浓度为0.5、 1、 2、 3、 4的CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定。

33、化酶。相对酶活检测结果见图2。 0058 实施例6固定化时间对共固定化酶酶活的影响 0059 将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3的海藻酸钠水溶液，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液滴入20ml质量浓度为2的CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4冰箱内分别静置1h、 2h、 3h、 4h、 5h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。不同时间下相对酶活检测结果见图3，固定化时间为2h时双酶体系活性最高，为说明书 5/6 页。

34、7 CN 104988133 B 7 游离酶的1.25倍，此时形成的凝胶颗粒规则成形，机械强度适中。 0060 实施例7双酶之间的比例对共固定化酶酶活的影响 0061 将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液分别按1:1、 1:1.5、 1:2、 1:3、 1:4的体积比混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3的海藻酸钠水溶液，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液滴入20ml质量浓度为2的 CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。不同时。

35、间下相对酶活检测结果见图4，当醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶酶液体积比例为1:1.5(醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比1:1.2)时，两种酶的协同作用最佳，具有最大的反应速率。 0062 实施例8游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶性能比较 0063 取实施例1得到的游离醛酮还原酶、实施例2得到的游离葡萄糖脱氢酶及实施例3 得到海藻酸钠共固定化酶进行如下实验： 0064 (1)最适温度 0065 分别在25、 30、 35、 37、 40、 45、 50条件下测定游离双酶及共固定化酶的活力，结果见图5，结果表明游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化。

36、酶分别在35、 40、 37时活性最高。 0066 (2)最适pH 0067 分别在pH5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0的缓冲液中测定游离双酶及共固定化酶的活力，结果见图6，海藻酸钠共固定化酶的最适pH7.0介于游离醛酮还原酶最适pH6.0 及游离葡萄糖脱氢酶最适pH8.0之间。 0068 (3)热稳定性 0069 将游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶分别于25、 30、 35、 37、 40、 45、 50保温30min，测定不同温度条件下酶的相对活力，结果见图7。游离醛酮还原酶在温度低于35时热稳定较好，保。

37、温30min后，剩余活力仍可达70，随着温度不断升高，剩余活力大幅下降， 50时酶完全失活。游离葡萄糖脱氢酶则在2550温度范围内都保持较好的热稳定性，剩余活力保持在60以上。在相同的温度条件下，海藻酸钠共固定化酶的热稳定性较游离酮还原酶高。 0070 (4)pH稳定性 0071 将游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶分别置于pH5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0的缓冲液中，各自最适温度条件下保温60min，测定酶的相对活力，结果见图8。在pH 6.0-8.5的范围内，海藻酸钠共固定化酶的活性保持在50以上，较游离酮还原酶来说，稳定性提高。说明书 6/6 页 8 CN 104988133 B 8 0001 序列表 1/2 页 9 CN 104988133 B 9 0002 序列表 2/2 页 10 CN 104988133 B 10 图1 图2 说明书附图 1/4 页 11 CN 104988133 B 11 图3 图4 说明书附图 2/4 页 12 CN 104988133 B 12 图5 图6 说明书附图 3/4 页 13 CN 104988133 B 13 图7 图8 说明书附图 4/4 页 14 CN 104988133 B 14 。

摘要
申请专利号：	CN201510351160.5	申请日：	20150619
公开号：	CN104988133B	公开日：	20180601
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12N11/18,C12N11/10,C12N11/04	主分类号：	C12N11/18,C12N11/10,C12N11/04
申请人：	杭州师范大学
发明人：	谢恬,殷晓浦,马转转,谌容,庞潇卿
地址：	310036 浙江省杭州市下沙高教园区学林街16号
优先权：	CN201510351160A
专利代理机构：	杭州天正专利事务所有限公司	代理人：	黄美娟;李世玉
PDF完整版下载：	PDF下载

内容摘要

本发明公开了一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的固定化方法，所述方法为：将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，滴加入CaCl2水溶液中，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；通过本发明制备的共固定化酶与游离醛酮还原酶相比，催化活性提高了1.32倍，热稳定性、pH稳定性等方面的性质也有所改善，同时，共固定化酶的重复使用降低了成本。

权利要求书

1.一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述方法为：将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:0.5～3.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30～170：1。 2.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于海藻酸钠水溶液的质量浓度为1～5％。 3.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于CaCl水溶液质量浓度为0.5～4％。 4.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:1.2。 5.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述4℃冰箱内静置1-5h，蒸馏水洗涤2-3次。 6.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述醛酮还原酶是以醛酮还原酶酶液的形式加入，所述酶液是指将含醛酮还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。 7.如权利要求1所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是以葡萄糖脱氢酶酶液的形式加入，所述酶液是指将含葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。 8.如权利要求6所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述醛酮还原酶酶液按如下方法制得：将含SEQIDNO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1％接种量将菌液转接于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱对其进行纯化，得到醛酮还原酶的酶液。 9.如权利要求7所述醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶酶液按如下方法制得：将含SEQIDNO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1％接种量将菌液转接于含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达0.6，向培养液中加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱进行纯化，得到葡萄糖脱氢酶的酶液。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶的包埋共固定化方法。

(二)背景技术

酶作为一种生物催化剂，因其专一性强、催化效率高和作用条件温和等特性，广泛应用于医药、食品、化工等方面。但天然酶稳定性差，除了一些耐高温的酶及少数可以耐受较低pH条件的酶以外，大多数酶在高温、强酸、强碱条件下都容易变性失活；反应结束后酶与产物混合，不能重复利用，产物分离纯化困难；同时，酶的一次性使用，大大提高了生产成本，不利于连续化生产，限制了酶在工业上更广泛的应用。基于上述情况，固定化酶的概念得以提出，近年来，酶的固定化技术得到了不断发展，在综合不同固定化技术的基础上，又出现了酶的共固定化技术，目前，酶的共固定化技术在临床诊断、发酵过程控制及生物传感器制备等方面都发挥着重要作用。

酶的固定化，是指采用物理或化学方法，将酶与水不溶性载体相结合的技术。固定化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性增强，可反复或连续使用及易于和产物分离的显著优点。酶的共固定化即将不同来源的几种酶或酶与某一完整细胞同时固定在同一个载体上，不仅使不同酶及细胞的各自优势得到充分发挥，而且将不同酶与细胞的生物催化性能结合起来。酶的固定化方法分为四类：吸附法，包埋法，结合法以及交联法。

醛酮还原酶作为一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，可将脂肪族醛酮、芳香族醛酮、类固醇等很多羰基化合物还原成相应的醇类，在手性药物及药物中间体合成领域发挥着重要作用。利用醛酮还原酶催化4-氯-3-羰基乙酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-oxobutanoate,COBE)不对称还原合成的(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate,CHBE)，是多种药物活性成分如(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯、L-肉毒碱、大环内酯A和(R)-γ-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)等合成的关键中间体，具有重要的应用价值。

在醛酮还原酶的催化反应中，都需要辅酶NAD(P)H的参与以提供反应持续进行所需电子。因此，在反应体系中维持一定浓度的NAD(P)H，是保持反应连续进行的关键因素。葡萄糖脱氢酶作为其辅酶再生系统可在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯的同时，将NADP+不断转化为NADPH，通过其与醛酮还原酶的协同作用，共同完成CHBE的生物转化过程。采用醛酮还原酶催化CHBE的合成具有高度的化学、区域和对映选择性，与化学工艺相比，具有明显优势，如：避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，反应可在常温下进行等，相对传统化学合成工艺催化剂来说，该酶催化的反应具有很强的绿色环保概念，具有广阔的应用前景。

(三)发明内容

目前催化反应使用的酮还原酶多是游离酶或全细胞，虽操作简单，但催化过程中所需辅因子NAD(P)H价格比较昂贵，且酶无法重复利用，生产成本偏高，限制了酶催化方法的大规模工业化应用。

本发明建立在本实验室已构建的来源多样化的各种醛酮还原酶酶库及多种重要化工中间体酶催化生产工艺的基础上，在已有的醛酮还原酶生物催化研究中，为反应循环提供NADPH的多为游离葡萄糖脱氢酶。为了克服游离酶稳定性差、不能重复利用等不足，本发明提供了一种简单、快速的醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶双酶的包埋固定化方法，海藻酸钠作为一种常用的多孔载体，将其与酶液混合后滴入到一定浓度的CaCl2溶液中，海藻酸钠的Na+部分被Ca2+取代，形成凝胶小球颗粒，通过优化固定化条件最终获得性能改善的共固定化酶。本发明首次将醛酮还原酶催化形成CHBE这一化工中间体生产工艺中的双酶进行固定化，选用的醛酮还原酶为生物催化手性合成(R)-CHBE e.e.值达99％以上的优质酶，通过将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶共固定在海藻酸钠载体上制备的共固定化酶，不仅可重复使用，降低酶制剂生产成本，也可为所构建酶库中其它酶的成本降低提供借鉴和示范。

本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法，所述方法包括：将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl2水溶液中，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:0.5～3.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30～170：1。

进一步，所述海藻酸钠水溶液是将海藻酸钠加入沸水中溶解，冷却后加入酶，或者将海藻酸钠加入水中，置于磁力搅拌器上，4℃恒温层析柜中过夜溶解。

进一步，海藻酸钠水溶液的质量浓度为1～5％。

进一步，CaCl2水溶液质量浓度为0.5～4％，CaCl2水溶液体积用量与醛酮还原酶质量计通常为50-100ml/mg。

进一步，优选所述4℃冰箱内静置1-5h，蒸馏水洗涤2-3次。

进一步，所述醛酮还原酶是以醛酮还原酶酶液的形式加入，所述醛酮还原酶酶液是指将含醛酮还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述醛酮还原酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述葡萄糖脱氢酶是以葡萄糖脱氢酶酶液的形式加入，所述葡萄糖脱氢酶酶液是指将含葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镍柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述醛酮还原酶按如下方法制得：将含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1％接种量将菌液转接于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，4℃、8000rpm离心15min收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱对其进行纯化，得到醛酮还原酶的酶液。具体菌体破碎纯化的方法为：将菌体用pH 7.4的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，将重悬混合液置于冰水混合物中，利用超声破碎仪进行破壁(工作3s，间隔3s，工作时间45min)，破碎结束后，4℃、12000rpm离心30min，收集上清并用镍柱对其进行纯化，最终得到醛酮还原酶纯酶液。

本发明所述含SEQ ID NO.1所示醛酮还原酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与载体pET28a连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得重组菌pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)。

进一步，所述葡萄糖脱氢酶按如下方法制得：将含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养，获得菌液；按体积浓度1％接种量将菌液转接于含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600达0.6，向培养液中加入终浓度0.1mM的IPTG，25℃、150rpm诱导表达12～16h，离心收集菌体，超声破碎，离心收集上清并用镍柱进行纯化，得到葡萄糖脱氢酶的酶液。具体，所述菌体纯化的方法为：将菌体用pH 8.0的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，重悬混合液置于冰水混合物中超声破碎(工作3s，间隔3s，工作时间45min)，破碎结束后，4℃、12000rpm离心30min，收集上清并用镍柱进行纯化，最终得到葡萄糖脱氢酶纯酶液。

本发明所述含SEQ ID NO.2所示葡萄糖脱氢酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列与载体pET22b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET22b-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得工程菌pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)。

本发明所述LB培养基质量组成如下：1％NaCl、1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物，溶剂为去离子水，pH 7.0。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

通过本发明制备的共固定化酶与游离醛酮还原酶相比，催化活性提高了1.32倍，热稳定性、pH稳定性等方面的性质也有所改善，并且共固定化酶的重复使用降低了成本，为醛酮还原酶工业化应用的实现提供了一定的理论依据，同时，醛酮还原酶及葡萄糖脱氢酶共固定化体系的初步构建有助于已开发的来源多样化的醛酮还原酶酶库中其它酶的进一步研究。

(四)附图说明

图1是海藻酸钠浓度对固定化酶酶活的影响曲线图。

图2是CaCl2浓度对共固定化酶酶活的影响柱形图。

图3是固定化时间对共固定化酶酶活的影响曲线图。

图4是双酶之间的比例对共固定化酶酶活的影响柱形图。

图5是温度对游离双酶和共固定化酶酶活的影响曲线图，

◆：海藻酸钠共固定化酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶；■：游离酮还原酶。

图6是pH对游离双酶和共固定化酶酶活的影响曲线图，

◆：海藻酸钠共固定化酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶；■：游离酮还原酶。

图7是游离双酶和共固定化酶的热稳定性曲线图，

◆：海藻酸钠共固定化酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶；■：游离酮还原酶。

图8是游离双酶和共固定化酶的pH稳定性曲线图，

◆：海藻酸钠共固定化酶；▲：游离葡萄糖脱氢酶；■：游离酮还原酶。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1制备醛酮还原酶

将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列与载体pET28a连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)菌株。

将pET28a-Lek-E.coli BL21(DE3)菌株接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。按体积浓度1％接种量将菌液转接于1L含卡那霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，向培养液中加入IPTG使其终浓度为0.1mM，25℃、150rpm诱导表达12～16h。4℃、8000rpm离心15min，收集菌体，用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，将重悬混合液置于冰水混合物中，利用超声破碎仪进行破壁(工作3s，间隔3s，工作时间45min)。破碎结束后，4℃、12000rpm离心30min，收集上清并用琼脂糖凝胶CL-6B镍柱对其进行咪唑梯度洗脱，纯化后最终得到浓度为7.7mg/mL的纯醛酮还原酶液。

在醛酮还原酶催化的反应过程中，还原型辅酶NAD(P)H被氧化，从而引起340nm处吸光度的明显下降，可利用紫外可见分光光度计测定醒酮还原酶的酶活。

醛酮还原酶活力测定方法如下：在离心管中加入30μL二甲基亚砜(DMSO)、1μL COBE、终浓度50mM的PBS(pH7.4)缓冲液和10μL纯酶液，30℃下温育5min，加入5μL 10mg/mL NADPH，混匀后吸至比色皿中，测定340nm下吸光度的下降值。醛酮还原酶的酶活定义为：在一定条件下，每分钟消耗1μmol NADPH所需酶量为一个酶活单位(U)。酶比活力则为每毫克蛋白所含酶的催化活力(U/mg)。根据340nm处吸光度变化值测得醛酮还原酶的活力为0.32U，酶比活力为4.16U/mg。

实施例2制备葡萄糖脱氢酶

将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列与载体pET22b连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到pET22b-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，获得pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)菌株。

将成功构建的pET22b-GDH104-E.coli BL21(DE3)菌株接种于含氨苄霉素(100μg/mL)的液体LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养。取10mL菌液转接于1L LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600达0.6，向培养液中加入IPTG使其终浓度为0.1mM，25℃、150rpm诱导表达12～16h。离心收集菌体，用pH 8.0的PBS溶液洗涤后重悬于50mL的相同缓冲液中，重悬混合液置于冰水混合物中超声破碎(工作3s，间隔3s，工作时间45min)。破碎结束后，4℃、12000rpm离心30min，收集上清并用琼脂糖凝胶CL-6B镍柱进行纯化，最终得到浓度为6.25mg/mL的纯葡萄糖脱氢酶液。

葡萄糖脱氢酶催化的反应过程中，氧化型辅酶NAD(P)被还原生成NAD(P)H，从而引起340nm处吸光度的明显上升。

葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：在离心管中加入10μL1.5M葡萄糖、PBS(pH7.4)缓冲液和10μL纯酶液，37℃下温育5min，加入5μL 10mg/mLNADP，混匀后吸至比色皿中，测定340nm下吸光度的动力学变化。定义每分钟消耗1μmol NADP所需酶量为一个酶活单位(U)，酶比活力则为每毫克蛋白所含酶的催化活力(U/mg)。根据340nm处吸光度变化值测得GDH的酶活力和酶比活力分别为0.24U和3.84U/mg。

实施例3将游离双酶制成共固定化酶

将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3％的海藻酸钠水溶液(醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶总重量以海藻酸钠水溶液体积计为0.683mg/ml)，充分搅拌使双酶液与海藻酸钠水溶液混合均匀，注射器吸取混合液缓慢滴入20ml质量浓度2％CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4℃冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到固定化凝胶颗粒，即共固定化酶。

表1共固定化酶催化反应参数

共固定化酶活力测定方法如下：用纯水将表1中反应体系补齐至1mL，30℃、180r/min反应1h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取上层有机相在真空干燥箱中抽干，1mL异丙醇溶解，经滤膜处理后气相色谱法(GC)检测样品。

共固定化酶活定义为：每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量，即一定条件下，1min催化1μmol底物(COBE)转化为产物(CHBE)所需酶量，表示为μmol·min-1·mg-1。

海藻酸钠浓度为3％时共固定化酶活性为4.99U/mg。

实施例4海藻酸钠水溶液浓度对共固定化醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的影响

将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，分别将1mL质量浓度1％、2％、3％、4％、5％的海藻酸钠水溶液加入双酶混合液中，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液缓慢滴入20ml质量浓度2％CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4℃冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。

对利用不同浓度海藻酸钠制备的共固定化酶分别进行相对酶活检测，结果见图1，海藻酸钠浓度为3％时共固定化酶活性最高，为相同质量游离酮还原酶的1.2倍。

实施例5CaCl2浓度对共固定化酶酶活的影响

将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3％的海藻酸钠水溶液，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液分别滴入20ml质量浓度为0.5％、1％、2％、3％、4％的CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4℃冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。相对酶活检测结果见图2。

实施例6固定化时间对共固定化酶酶活的影响

将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液0.06ml混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3％的海藻酸钠水溶液，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液滴入20ml质量浓度为2％的CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4℃冰箱内分别静置1h、2h、3h、4h、5h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。不同时间下相对酶活检测结果见图3，固定化时间为2h时双酶体系活性最高，为游离酶的1.25倍，此时形成的凝胶颗粒规则成形，机械强度适中。

实施例7双酶之间的比例对共固定化酶酶活的影响

将实施例1得到的7.7mg/mL的醛酮还原酶液0.04ml及实施例2得到的6.25mg/mL的葡萄糖脱氢酶液分别按1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4的体积比混匀，混合液中加入1mL质量浓度为3％的海藻酸钠水溶液，充分搅拌混匀后，注射器吸取混合液滴入20ml质量浓度为2％的CaCl2水溶液中，滴加过程中不断搅拌，结束后4℃冰箱内静置2h，蒸馏水洗涤2-3次，真空泵抽干，得到共固定化酶。不同时间下相对酶活检测结果见图4，当醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶酶液体积比例为1:1.5(醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比1:1.2)时，两种酶的协同作用最佳，具有最大的反应速率。

实施例8游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶性能比较

取实施例1得到的游离醛酮还原酶、实施例2得到的游离葡萄糖脱氢酶及实施例3得到海藻酸钠共固定化酶进行如下实验：

(1)最适温度

分别在25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃条件下测定游离双酶及共固定化酶的活力，结果见图5，结果表明游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶分别在35℃、40℃、37℃时活性最高。

(2)最适pH

分别在pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液中测定游离双酶及共固定化酶的活力，结果见图6，海藻酸钠共固定化酶的最适pH7.0介于游离醛酮还原酶最适pH6.0及游离葡萄糖脱氢酶最适pH8.0之间。

(3)热稳定性

将游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶分别于25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃保温30min，测定不同温度条件下酶的相对活力，结果见图7。游离醛酮还原酶在温度低于35℃时热稳定较好，保温30min后，剩余活力仍可达70％，随着温度不断升高，剩余活力大幅下降，50℃时酶完全失活。游离葡萄糖脱氢酶则在25～50℃温度范围内都保持较好的热稳定性，剩余活力保持在60％以上。在相同的温度条件下，海藻酸钠共固定化酶的热稳定性较游离酮还原酶高。

(4)pH稳定性

将游离醛酮还原酶、游离葡萄糖脱氢酶、海藻酸钠共固定化酶分别置于pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液中，各自最适温度条件下保温60min，测定酶的相对活力，结果见图8。在pH 6.0-8.5的范围内，海藻酸钠共固定化酶的活性保持在50％以上，较游离酮还原酶来说，稳定性提高。