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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711380125.1 (22)申请日 2017.12.20 (71)申请人 中国人民解放军南京军区福州总医 院 地址 350100 福建省福州市鼓楼区西二环 北路156号 (72)发明人 宋颖芳洪景芳陈锦华邹淑梅 柳德灵赖国祥 (74)专利代理机构 福州科扬专利事务所 35001 代理人 严欢 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/12(2006.01) (54)发明名称 第196位点发。
2、生突变的ACE突变基因及其应 用 (57)摘要 本发明涉及一种新的人ACE突变基因形式， 其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示， 经验证它是 人慢性阻塞性肺疾病即COPD的致病基因， 所发生 的突变为c.196CT， 这可以为COPD致病机理的解 析和致病基因检测提供依据； 此外， 本发明还提 供了基于Sanger测序的ACE突变基因检测方法， 其中ACE突变基因片段的扩增引物序列如SEQID NO:2和SEQIDNO:3所示， 所构建的检测方法可 以快速准确经济地获取COPD致病基因突变信息， 有助于COPD的辅助分析。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 1081303。
3、67 A 2018.06.08 CN 108130367 A 1. 一种ACE突变基因， 其特征在于： ACE基因第196位点的C核苷酸突变成了T核苷酸即 发生了c.196CT突变， 突变所在片段对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的ACE突变基因在构建人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法和 致病基因检测试剂盒中的应用。 3. 如权利要求2所述的人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法， 其特征在于： 检测靶 标为ACE基因， 主要步骤如下： （1） ACE基因片段扩增 提取待测者样本的基因组DNA， 利用设计合成的PCR引物对进行ACE基因突变片段扩增； （2） AC。
4、E基因扩增片段测序分析 将 （1） 中扩增的ACE基因突变片段进行Sanger测序， 与野生型参考序列进行比对获取突 变信息， 以此应用于COPD辅助分析中。 4.根据权利要求3所述的人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法， 其特征在于步骤(1) 中样本为血液或口腔粘膜。 5. 根据权利要求3所述的人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法， 其特征在于步骤 (1)中所述的PCR引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。 6.根据权利要求3所述的人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法， 其特征在于步骤(1) 中所述的ACE基因突变片段扩增其扩增条件为： 95预变性3min； 94变性15。
5、s， 53退火 20s， 72延伸40s， 循环30次； 72终延伸5min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108130367 A 2 第196位点发生突变的ACE突变基因及其应用 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学和医学领域， 具体涉及一种ACE突变基因及其在人慢性阻 塞性肺疾病致病基因检测中的应用。 背景技术 0002 人慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease， COPD)是一种 具有气流受限特征的慢性气道疾病， 其气流受限不完全可逆， 常呈进行性发展,主要包括肺 气肿、 慢性支气管炎和末梢气道疾病。 它是威胁人们健康的常见。
6、疾病， 在所有疾病的死亡原 因中高居第四位， 且发病率和死亡率有逐年渐增的趋势， 据WHO报导到2030年COPD或将成为 世界第三大致死疾病， 因此COPD的防治显得尤为迫切， 而这离不开对其致病因素的深入解 析。 流行病学研究表明， COPD是由易感基因和环境因素共同作用所导致的疾病， 其发病机制 复杂， 已知若干基因变异和多态性以及多种环境因素均是其致病的高危因素。 0003 到目前为止为研究所明确的是， a1-AT基因是当前唯一得到确认的与COPD发病有 密切相关的基因， 其编码的蛋白a1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏易发生COPD； 吸烟则是COPD致病 的最危险环境因素。 然而a1-抗。
7、胰蛋白酶缺乏者仅占COPD的1-2， 吸烟者中只有10- 15会发生COPD， 非吸烟者也可以发生慢性气流受限。 除a1-AT基因之外， 初步研究显示基 质金属蛋白酶(MMPs)基因、 SERPINA3基因、 HMOX1基因、 GST-S基因和ACE基因等少数几个基 因的相关变异或多态性也和COPD易感性相关， 但需要进一步确证。 对于不同人种和人群， 其 COPD致病的遗传易感性位点既有共同部分也会有差异部分。 目前中国人群特异的COPD易感 或致病基因及其位点尚未得到很好揭示。 0004 本发明针对收集到的福建省及其周边地区的16个COPD特定家系， 通过对相关家系 成员进行人类基因组全外。
8、显子组测序分析比对， 发现了COPD的一个新的遗传性致病基因突 变ACE基因的c.196CT突变， 并通过构建的Sanger测序检测法在人群样本中做了进一 步的验证。 ACE(Angiotensin Converting Enzyme)是血管紧张素转化酶编码基因， 携带ACE 基因特定基因型的长期吸烟者， 其体内的ACE活性明显增加， 使血管紧张素II量增加， 可以 诱发气道炎症反应， 从而促进COPD的发生。 然而本发明提供的ACE致病基因突变并未见报道 且与COPD患者吸烟与否并无直接关联， COPD相关致病基因突变的全面系统解析将有助于其 防治工作的开展。 发明内容 0005 本发明提供。
9、了一种人ACE突变基因， 其为慢性阻塞性肺疾病的致病基因。 同时提供 了基于Sanger测序技术的ACE突变基因检测方法； 这些可以为特定ACE突变基因引起的COPD 致病机理的解析和致病基因检测提供依据。 0006 本发明的目的之一在于提供一种人ACE突变基因， 其序列分别如SEQ ID NO.1所 示， 对应的突变为c.196CT突变； 发生c.196CT突变的ACE基因经检测和验证为人类COPD致 病基因， 可以被应用于构建人类COPD致病基因检测方法和人类COPD致病基因检测试剂盒 说明书 1/5 页 3 CN 108130367 A 3 中。 0007 其中， 参照野生型ACE基因序。
10、列(NCBI登录号为NG_011648.1)， 所述c.196CT突变 是指ACE基因第196位点的C核苷酸突变成了T核苷酸， SEQ ID NO.1只展现ACE突变基因前 500个核苷酸序列， 其余序列详见参考序列NG_011648.1。 0008 本发明的另一目的在于提供特定ACE突变基因检测方法， 该方法包括如下主要步 骤： 0009 (1)ACE基因突变片段扩增 0010 提取待测者样本的基因组DNA， 利用设计合成的PCR引物对进行ACE基因突变片段 扩增； 0011 (2)ACE基因扩增片段测序分析 0012 将(1)中扩增的ACE基因突变片段进行Sanger测序， 与野生型参考序。
11、列进行比对获 取突变信息， 以此应用于COPD辅助分析中。 0013 其中， 步骤(1)中所述的样本为人体正常组织， 优选血液或口腔粘膜； 所述的PCR引 物对其序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。 扩增条件为： 95预变性3min； 94变性 15s， 53退火20s， 72延伸40s， 循环30次； 72终延伸5min； 所述的ACE基因突变是指ACE 基因的c.196CT突变。 0014 其中， 步骤(2)中所述的Sanger测序只需按标准操作进行即可， 也可以送样品到专 业的DNA测序公司进行Sanger测序， 最终需要得到ACE基因扩增片段的序列； 所述COPD。
12、辅助 分析包括COPD的辅助筛查和诊断。 0015 本发明提供的人ACE突变基因形式， 可以为COPD致病机理的解析和致病基因检测 提供依据； 此外本发明提供的基于Sanger测序的ACE致病基因检测方法， 可以快速准确经济 地获取突变信息， 有助于COPD的辅助分析。 附图说明 0016 图1是实施例1中家系JX1相关信息， COPD先证患者为图中II1。 此图中正方形表示 男性， 圆形表示女性； 黑色填充表示COPD患者， 空心表示非COPD者；“+” 表示存在ACE基因的 c.196CT突变，“-” 表示不存在ACE基因的c.196CT突变，“” 表示吸烟者； I、 II分别代表第1 和。
13、2代， 数字为成员编号。 0017 图2是实施例1中家系JX2相关信息， COPD先证患者为图中II1。 此图中正方形表示 男性， 圆形表示女性； 黑色填充表示COPD患者， 空心表示非COPD者；“+” 表示存在ACE基因的 c.196CT突变，“-” 表示不存在ACE基因的c.196CT突变，“” 表示吸烟者； I、 II分别代表第1 和2代， 数字为成员编号。 0018 图3是ACE基因扩增片段电泳图谱， 图中从左右到右对应DNAMarker和家系JX1成员 II1、 II2、 I1和I2样本。 0019 图4是COPD患者ACE基因扩增片段测序局部示意图谱， 图中箭头指示第196位点测。
14、 序结果为T核苷酸。 0020 图5是非COPD者其ACE基因扩增片段测序局部示意图谱， 图中箭头指示第196位点 测序结果为C核苷酸。 说明书 2/5 页 4 CN 108130367 A 4 具体实施方式 0021 以下结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 0022 COPD的发生涉及遗传因素和环境因素， 这两者均发挥着重要的作用。 吸烟是COPD 致病的最危险环境因素， 然而在特定家系中， 吸烟甚至是严重吸烟成员并不患COPD， 而不吸 烟成员反而患COPD， 在此类家系中有很大可能性其遗传因素占主导地位。 对于此类家系成 员遗传差异性的解析， 将是筛选COPD致病基因突变的良好切入点。。
15、 COPD的相关检查和诊断 分析遵循现有常规的临床实际和标准。 肺功能是临床诊断的金标准： 吸入支气管舒张剂后， FEV1/FVCT突变， 非COPD患者(JX1的II2和I1， JX2 的II2和I2)均无此突变， 如表1和图1、 图2所示。 0029 表1ACE基因突变信息 0030 家系COPD患者基因突变突变类型染色体外显子测序数 JX1II1和I2ACEc.196CT错义突变17号1号892 JX2II1和I1ACEc.196CT错义突变17号1号765 0031 (3)ACE突变基因检测方法构建 0032 由于筛选到明确的COPD的候选致病基因及其突变位点， 因此可以构建基于San。
16、ger 测序的突变基因检测方法， 先检验(2)中的全外显子组测序结果的正确性， 再在COPD人群样 本中对ACE基因突变情况和遗传特性做进一步分析和确证。 针对新发现的ACE基因的c.196C T突变， 利用Permer6.0和Oligo7.0设计PCR引物对扩增该突变所在基因片段。 设计的引物 对序列如SEQ ID NO.2(上游引物)和SEQ ID NO.3(下游引物)所示， 所扩增片段长度为 说明书 3/5 页 5 CN 108130367 A 5 336bp。 采用步骤(2)中提取的基因组DNA作为ACE基因突变片段的扩增模板， 按照表2所示配 制扩增体系， 引物由上海生工生物工程股份。
17、有限公司合成， 其余PCR扩增试剂也购置于该公 司。 扩增条件为： 95预变性3min； 94变性15s， 53退火20s， 72延伸40s， 循环30次； 72 终延伸5min。 PCR扩增仪为美国ABI公司的2720。 0033 表2ACE突变片段扩增体系 0034 组份添加量/ l 10PCR Buffer2.5 dNTP Mixture2.0 上游引物(10 mol/l)0.5 下游引物(10 mol/l)0.5 rTaq DNA聚合酶0.25 基因组DNA(100ng/ l)0.25 灭菌去离子水19.0 0035 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。 图3是家系JX1的4个成员样本的AC。
18、E基因扩增片 段， 均出现单一的扩增条带， 且扩增片段长度范围符合理论长度336bp； 家系JX2成员的扩增 情况类似。 将扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序， 测序仪为美国 ABI公司的3730 xl DNAAnalyzer。 经检测， Sanger测序结果和全外显子组测序结果一致， 即 对于相关成员全外显子组测序检出ACE基因c.196CT突变的， Sanger测序也检出同样的突 变， 而全外显子组测序未检出ACE基因c.196CT突变的， Sanger测序也未检出此突变； 以此 验证了全外显子组测序的突变检测结果， 同时也说明了所构建的基于Sanger测序的突变基。
19、 因检测方法的准确性。 0036 在JX1家系中(图1)， II1是COPD先证者但不吸烟， 其母亲I2也是不吸烟但有COPD， 而其弟弟II2和其父亲I1均是吸烟但没患COPD， 经检测家系成员遗传背景存在差异。 II1和 I2都为COPD患者均存在ACE基因的c.196CT突变(Sanger测序结果详见图4)， 而II2和I1均 无此突变均为非COPD者(Sanger测序结果详见图5)。 在家系JX2中(图2)， 也是COPD患者即 II1和I1均存在ACE基因的c.196CT突变(参见图4)， 而II2和I2均无此突变均为非COPD者 (详见图5)。 由此可知， ACE基因的c.196C。
20、T突变为COPD的致病基因突变， 家系JX1中II1的突 变遗传自其母亲I2， 家系JX2中II1的突变遗传自其父亲I1， 符合遗传规律。 在此2个家系中 遗传因素做主导， 吸烟与否并非COPD患病的决定性因素。 0037 实施例2 0038 实施例2是利用本发明构建的基于Sanger测序的ACE基因c.196CT突变检测方法 在群体样本中进行的验证。 0039 另外随机选取与实施例1不同的经临床确诊的COPD患者100例(COPD组)以及100例 非COPD的健康人(健康组)， 在知情同意的情况下抽取每个人空腹静脉抗凝血样2ml， 采用本 发明构建的基于Sanger测序的ACE基因c.196。
21、CT突变检测方法， 具体操作和参数同实施例 1。 结果发现健康组均不含ACE基因的c.196CT突变， 该突变只在COPD患者中检出。 共5例 COPD患者检出了ACE基因的c.196CT突变， 其中4例收集到了家系样本(编号jx1-4)， 同实施 例1的家系分析， 发现这4个家系成员均符合COPD患者存在ACE基因的c.196CT突变， 非COPD 说明书 4/5 页 6 CN 108130367 A 6 患者不存在ACE基因的c.196CT突变， 且致病基因突变在家系中符合代际遗传规律(表3， I、 II和III分别代表第1、 2和3代， 数字为成员编号， I1为父亲或祖父， I2为母亲或。
22、祖母)； 从而 从正反两方面再次验证了本发明提供的ACE基因突变形式的COPD致病性， 以及本发明提供 的检测方法具有良好的可靠性和准确性。 0040 表3验证家系突变检测情况 0041 0042 虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明， 但是对于本领域的技术人员来 说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同 替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 108130367 A 7 序列表 中国人民解放军南京军区福州总医院 第196位点发生突变的ACE突变基因及其应用 3 SIPOSequenceListing。
23、 1.0 1 500 DNA 智人(Homo sapiens) 1 agaaggggca gagccgagca ccgcgcaccg cgtcatgggg gccgcctcgg gccgccgggg 60 gccggggctg ctgctgccgc tgccgctgct gttgctgctg ccgccgcagc ccgccctggc 120 gttggacccc gggctgcagc ccggcaactt ttctgctgac gaggccgggg cgcagctctt 180 cgcgcagagc tacaattcca gcgccgaaca ggtgctgttc cagagcgtgg cc。
24、gccagctg 240 ggcgcacgac accaacatca ccgcggagaa tgcaaggcgc caggtgggcg cccgggcccg 300 ggcgggggcg gggcggggcc gcggcggcca atcacagcac gcggccggct tgtggggcgg 360 gcaggctggc gcccccgacc cgaaccccac cccgaccccg gaccctcgcc ccgacagtca 420 gccgcggggc ccgagcgccg ggctgcgcgc acggcctgcg ctcccagcat gcacgagttg 480 gatggat。
25、gag ggtggctgct 500 2 19 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 caacttttct gctgacgag 19 3 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 caactcgtgc atgctgggag 20 序列表 1/1 页 8 CN 108130367 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 108130367 A 9 图3 说明书附图 2/4 页 10 CN 108130367 A 10 图4 说明书附图 3/4 页 11 CN 108130367 A 11 图5 说明书附图 4/4 页 12 CN 108130367 A 12 。