一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21XA及其应用.pdf

本发明提供一种嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用，本发明属于酶基因工程和酶工程领域，解决现有技术中对于制备木聚糖酶用的嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌比较缺乏或者活性、嗜热耐碱性不理想等问题。本发明包括含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA的核苷酸序列如SEQ NO.1中所述，含有重组质粒pXA的重组工程菌BL21-XA，以及利用该工程菌制备的热稳定木聚糖酶、制备方法及木聚糖酶的应用。本发明工程菌BL21-XA耐热性好、pH值适应性宽，耐受性好，其制备的热稳定木聚糖酶具有很好的活性、耐热耐碱等性能。

1.  一种含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA，其特征在于：所述重组质粒的核苷酸的碱基序列如SEQ NO.1中所述。

2.  一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，其特征在于：所述重组工程菌BL21-XA中含有权利要求1所述的重组质粒。

3.  根据权利要求2所述的嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，其特征在于：所述耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA属于大肠杆菌Escherichia coli，其保藏号为：CCTCC：M209164。

4.  一种热稳定木聚糖酶，其特征在于：所述热稳定木聚糖酶含有如权利要求1所述的DNA的碱基序列。

5.  根据权利要求4所述的热稳定木聚糖酶，其特征在于：所述热稳定木聚糖酶为具有SEQ NO.2氨基酸序列的蛋白质。

6.  根据权利要求4所述的热稳定木聚糖酶，其特征在于：所述热稳定木聚糖酶为采用权利要求2所述的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA制备。

7.  根据权利要求6所述的热稳定木聚糖酶，其特征在于：所述热稳定木聚糖酶的制备步骤包括：
(1)土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的分离鉴定：温泉样品经木聚糖平板分离、纯化，得到酶活较大的菌株TC-W7；对该菌株进行菌落形态，菌株形态的观察，革兰氏属性以及16SrDNA的鉴定，命名为Gebacillus sp.TC-W7；
(2)高温嗜热木聚糖酶酶基因的克隆：从土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA片段，测序验证；
(3)高温嗜热木聚糖酶重组工程菌的构建：采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100μg/ml；挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体；
(4)重组工程菌按微生物发酵和酶工程技术制备高温木聚糖酶。

8.  一种如权利要求4、5、6或7所述的热稳定木聚糖酶的用途，其特征在于：所述热稳定木聚糖酶用于生物质能源、食品、造纸或医药卫生领域，对木聚糖具有降解、糖基转化的作用。

一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用
技术领域
本发明属于酶基因工程和酶工程领域，更具体涉及一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用。
背景技术
木聚糖酶是一类可以催化分解半纤维、木聚糖、支链木寡糖的水解酶类。它们不同于一般的酶类，它是一种内切酶系，对底物具有很好的转糖基和降解作用。近年来随着人们对于该酶应用范围认识的增强，此类酶得到了一定的研究。然而由于生产中使用木聚糖酶常需要有一定的高温条件和较高的耐碱性，因此耐热嗜碱木聚糖酶的选育具有极大潜能的应用价值；但是现有技术中理想的制备耐热耐碱木聚糖酶用的重组工程菌比较缺乏。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中对于制备耐热耐碱木聚糖酶用的重组工程菌比较缺乏的问题，提供一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用，由该工程菌BL21-XA制备的热稳定木聚糖酶具有很好的活性、耐受性好、pH值适应性宽，耐热耐碱性等性能。
本发明的含有土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA：所述重组质粒的核苷酸序列的碱基序列为：如SEQ NO.1中所述。
本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA：所述重组工程菌BL21-XA中含有上述的高温木聚糖酶基因的重组质粒pXA。
本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA，用大肠杆菌为宿主细胞得到大肠埃希氏重组工程菌[Escherichia coli BL21-XA]，该菌株已于2009年7月22日由中国典型培养物保藏中心收到登记入册，并于2009年7月25日由该保藏中心检测完毕为存活，其保藏号为：CCTCC：M209164。
本发明的耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA构建为：温泉样品经木聚糖平板分离、纯化，得到酶活较大的菌株TC-W7。经16SrDNA鉴定为Gebacillus sp.TC-W7。从土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA片段，测序验证。采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100μg/ml；挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体。
本发明的热稳定木聚糖酶含有如SEQ NO.1中所述的DNA的碱基序列。
本发明的热稳定木聚糖酶为具有SEQ NO.2氨基酸序列的蛋白质，或者热稳定木聚糖酶也可以是将序列SEQ NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸取代、缺失或添加，并且具有序列SEQ NO.2的相同活性的由序列SEQ NO.2衍尘的蛋白质。
本发明的热稳定木聚糖酶的制备步骤包括：
1、土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7的分离鉴定：将所采集的样品涂布木聚糖平板后，挑取单菌落进行划线纯化，将纯化后的菌株点种透明圈观察平板上，选取有透明圈产生的菌株进行复筛，从而得到酶活较大的菌株TC-W7。对该菌株进行菌落形态，菌株形态的观察，革兰氏属性以及16SrDNA的鉴定，命名为Gebacillus sp.TC-W7。
2、热稳定木聚糖酶酶基因的克隆：从土芽孢杆菌属(Gebacillus sp.)嗜热菌TC-W7中采用常规或采用基因组提取试剂盒提取其总DNA；以所提取的嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7总DNA为模板，采用木聚糖酶酶基因简并引物进行PCR扩增，获得1200bp的DNA片段，测序验证。
3、热稳定木聚糖酶重组工程菌的构建：采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中；然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100μg/ml；挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒；随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体；
4、重组工程菌按微生物发酵和酶工程技术制备热稳定木聚糖酶。
本发明的热稳定木聚糖酶可以用于生物质能源、食品、造纸或医药卫生等领域，对木聚糖具有降解、糖基转化的作用。
本发明的显著优点是：本发明提供的木聚糖酶重组工程菌BL21-XA生产的木聚糖酶具有很好的性能：1、该木聚糖酶的最适作用温度为75℃，但在95℃时仍有一定的酶活，表现了很好的耐热性，同时也具有很强的热稳定性，70℃耐受150min后仍保持着70％的活性，该酶对热也具有较广的耐受范围(35-95度)；2、该酶对pH值有较宽的适应性(3.2-10.2)，其最适最适作用pH为pH8.2，在偏碱性条件下比较稳定，pH7.2与8.2耐受90min后酶活仍高于80％的酶活，在pH10.2耐受90min后仍具有50％的酶活，表现了很好的耐碱性能。3、该酶对去污剂和抑制剂有较强的抗逆性，2-Me、Tween20、Triton X-100、DDT在不同程度上均对该酶有激活作用。4、金属离子Na⁺，K⁺，Li⁺对该酶有较好的促进作用。5、由于在造纸工业中纸浆漂白所需的木聚糖酶应具有在高温强碱条件下热稳定性强、碱稳定强以及抗化学物质与金属离子的特点，本发明得到的木聚糖酶显然具有这些方面的优势，非常适合在纸浆工业尘产中应用。
图1是本发明的木聚糖酶基因的克隆，其中A：木聚糖酶基因的PCR扩增；B：重组质粒的双酶切验证(BamH I和Xho I)。
图2是本发明的木聚糖酶在大肠杆菌表达系统中的表达，其中：泳道：1，只含空载的菌，未诱导；2，只含空载的菌，诱导；3，含重组质粒的菌，未诱导；4，含重组质粒的菌，诱导；5，GST纯化蛋白GST-XA；6，纯化蛋白经凝血酶酶切。
图3重组酶的最适反应温度测定曲线图，酶与底物在不同温度下反应30分，然后进行酶活测定。
图4是重组酶的温度耐受测定曲线图，酶先在不同温度下温育不同时间，然后加底物反应30分，再进行残余酶活的测定。
图5重组酶的最适反应pH测定曲线图，酶与底物在不同pH下反应30分，进行酶活测定。
图6是重组酶的pH耐受测定曲线图，酶分别在不同pH下温育不同时间，然后加底物，反应30分后，再进行酶活测定。
图7是酶抑制剂和去污剂对重组木聚糖酶活的影响图，重组酶在抑制剂(1mM)及去污剂(0.1％)作用下酶活测定。
图8是金属离子对重组木聚糖酶酶活的影响图，在10mM不同浓度的金属离子作用下，进行酶活的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如Sambrook等所著的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.嗜热菌TC-W7的分离与鉴定
将从福建永泰温泉采集的样品，均匀涂布在以木聚糖为碳源的筛选平板上，挑取单菌落进行划线纯化，然后将纯化后的菌株点种于透明圈观察平板上，60℃培养两天后，用0.1％刚果红染色30min，再用1mol/L NaCl溶液脱色。挑选周围有透明圈产生的菌落进行摇瓶发酵复筛，选取酶活较大的菌株TC-W7。
该菌株平板上菌落白色，扁平状，粘性，半透明，边缘不规则，带有小“V”形缺刻。革兰氏染色结果为阳性，显微镜下的形态为长杆状。16S rDNA鉴定：采用天根细菌基因组提取试剂盒说明书提取DNA，用细菌通用引物27F、1500R进行PCR扩增，PCR产物经胶回收后与PMD-18T载体相连，转化E.coli DH5α，双酶切验证后由北京天根有限公司测序。测序结果与GeneBank数据库序列进行相似性比较，初步确定该菌株属于Gebacillus sp.，命名为Gebacillus sp.TC-W7。
实施例2.嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7木聚糖酶基因的克隆
以所提取的嗜热菌Gebacillus sp.TC-W7总DNA为模板，采用下列简并引物：sense primerXA：[5’-CAT(C)ACA(G)C(T)TGGTTTGGCA-3’]，antisense primer XA：[5’-A(T)CCCCAG(A)AAC(T)GTG(A)AC-3’]或者来源于简并引物的一对特异引物。PCR反应体系如下：95℃，4分钟，一个循环；95℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃，1分钟，30个循环；72℃，10分钟一个循环。产物经1％琼脂糖电泳验证得到一个约1200bp的DNA片段，测序验证。
实施例3.木聚糖酶重组工程菌构建，木聚糖重组酶的表达及纯化
采用基因工程工具酶，将扩增的DNA片段连接到质粒载体pGEX中。然后用连接产物转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，均匀涂布在LB平板(含Amp100μg/ml)上。挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒。随后采用双酶切和测序的方法鉴定该木聚糖酶的DNA片段已正确融入了表达载体。
挑取含有重组质粒的单菌落于3ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃摇培过夜。吸取1ml菌液于新的100ml LB液体培养基(含Amp 100μg/ml)，30℃摇培至OD₆₀₀为0.6左右，加入IPTG至终浓度0.4mM，继续震荡培养4h。收集菌液离心，去上清。将细胞用适量PBS(pH 7.2)重悬，超声裂解菌体，离心去沉淀，上清中的重组蛋白木聚糖酶用GST柱进行亲和纯化。
性能测定：
实施例4.木聚糖酶活性测定
按照Bailey et al[8]等建立的酶活测定方法(DNS)。适量酶液与底物混合后，75℃温育30分钟，通过测定540nm波长下的吸光值判定酶活。酶的定义为，单位时间内水解释放出1μmol还原糖木糖所需的酶量Miller[9]。
实施例5.木聚糖酶的性质鉴定
(1)酶最适反应温度与耐受性的测定
以1％的oat spelt xylan为底物，在pH为7.2缓冲液的中，于不同温度下反应30min，分别测定重组木聚糖酶的活性(重复三次)，以不加酶液的反应体系为对照。结果显示，重组木聚糖反应的最适温度是75℃，其反应温度范围在50℃～90℃，当温度高于或低于最适反应酶活时，酶活逐渐降低(图3)。
将重组的木聚糖酶加入缓冲液中，于不同温度条件下温浴不同时间，迅速加入含有底物的反应体积，测定木聚糖酶的残余酶活。结果显示，重组酶在65℃和70℃条件下的热稳定性较强，耐受2.3h后仍有70％的酶活(图4)。75℃时，重组酶的半衰期为70min，温度高于80℃，酶的热稳定性下降比较快。
(2)重组酶的最适pH与pH耐受性测定
以1％的oat spelt xylan为底物，于最适温度条件下，在不同pH(pH3.2-10.2)的缓冲液中反应30min，以不加酶液的反应体系为对照，测定木聚糖酶的酶活(重复三次)。结果显示，重组木聚糖酶的反应最适pH为8.2(图5)，当pH超过10.2或低于5.2时，木聚糖酶的活性逐渐降低。
将重组的木聚糖酶加入不同pH缓冲液中，于不同pH温浴不同时间后取出，迅速加入含有底物的反应体积，测定木聚糖酶的残余酶活。结果显示重组酶在pH7.2-9.2这个范围内比较稳定，耐受60min后酶活仍高于75％的酶活，在pH10.2耐受60min后仍具有70％的酶活，然后这个条件下酶活下降的比较迅速(图6)。
(3)去污剂和抑制剂对酶活的影响
在底物溶液中加入10mM或1％的酶抑制剂(EDTA，2-Me，SDS，PMSF和DDT)和去污剂(Tween20，Triton X-100)，在75℃，pH8.2的条件下，以不加酶抑制剂和去污剂的底物溶液为对照，测定重组木聚糖酶的活性(重复三次)。结果显示(图7)，EDTA和PMSF能够抑制其大约80％的活性，SDS对该酶几乎没有什么影响，2-Me、Tween20、Triton X-100、DDT在一定程度上对该重组酶有促进作用。
(4)金属离子对酶活的影响
在底物缓冲液液中加入终浓度为10mM的金属离子，以不加金属离子的反应体系为对照，在72℃，pH8.2条件下测定重组木聚糖酶的活性(重复三次)。结果如图8所示，一价的金属离子(如Li+、Na+、K+)对重组木聚糖酶有促进作用；二价的金属离子Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺和Mn²⁺对该重组酶也有促进作用。
关于本发明的遗传资源的直接来源和原始来源的说明如下：
遗传资源名称：高温木聚糖酶基因XA；
遗传资源取自微生物；
获取方式自行采集；
直接来源：获取时间2008年8月；
采集方式：
采集地(国家、省(市))中国福建福州
采集者名称(姓名)刘斌；张宁宁
采集者联系方式0591-83794548；13055783073
原始来源：
采集者名称(姓名)刘斌；张宁宁
采集者联系方式0591-83794548；13055783073
获取时间：2006年10月
获取地点(国家、省(市))：中国福州市永泰县
序列表
SEQ NO.1
<110>福建农林大学
<120>一种嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用
<160>2
<210>1
<211>1224
<212>DNA
<213>土芽孢杆菌属(Gebacillus sp)嗜热菌
<220>
<223>
<400>1
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tggccgccgc gggcctaccc gtcgtatgac gccattccgg agcaaaagtt tttggaccaa    960
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SEQ NO.2
<210>2
<211>1224
<212>DNA
<213>土芽孢杆菌属(Gebacillus sp)嗜热菌
<220>
<223>
<400>2
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1               5                   10                  15
atg ctg ttg ctc cct  60
MET Leu Leu Leu Pro
                20
tta ggg atg acg aat gca ttg gca aaa act gaa caa tca tac tct  105
Leu Gly MET Thr Asn Ala Leu Ala Lys Thr Glu Gln Ser Tyr Ser
                25                  30                  35
aaa aag cct caa atc 120
Lys Lys Pro Gln Ile
                40
agc gca ttg cat gcc cca caa ttg gac cag cgc tac aaa gat tca  165
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Phe Thr Ile Gly Ala
                60
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Ala Val Glu Pro Tyr Gln Leu Leu Asn Glu Lys Asp Ala Gln MET
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cta aaa cgc cat ttt 240
Leu Lys Arg His Phe
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Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Val MET Lys Pro Ile Asn Ile Gln
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ccg gaa gaa gga aaa 300
Pro Glu Glu Gly Lys
                100
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                105                 110                 115
cac cat atg gat atc 360
His His MET Asp Ile
                120
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Arg Phe His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Val Pro Gln Trp Phe
                125                 130                 135
ttt ctt gac aag gaa 420
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                140
ggc caa cca atg gtc aat gaa acg gac cct gtg aaa cgc gaa caa  465
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tta aaa cgg atc gaa acc cat att aaa acg att gtc gag cgg tat  525
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Lys Asp Asp Ile Lys
                180
tat tgg gac gtt gta aat gag gta gtc ggg gat gat gga gaa ttg  585
Tyr Trp Asp Val Val Asn Glu Val Val Gly Asp Asp Gly Glu Leu
                185                 190                 195
cgc gat tcc cca tgg 600
Arg Asp Ser Pro Trp
                200
tat caa atc gct ggc atc gat tat att aag gta gcg ttc caa aca  645
Tyr Gln Ile Ala Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Val Ala Phe Gln Thr
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gca aga aaa tat ggc 660
Ala Arg Lys Tyr Gly
                220
ggc aac aag att aaa ctt tac att aat gat tac aat acg gaa gtt  605
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                240
gct ctt tat aac ttg gtg aaa caa tta aaa gaa gag ggc att ccc  765
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att gat ggt att ggc 780
Ile Asp Gly Ile Gly
                260
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Glu Lys Thr Ile Ile
                280
atg ttt gcc gat cta ggg tta gac aac caa att act gag ctg gat  885
MET Phe Ala Asp Leu Gly Leu Asp Asn Gln Ile Thr Glu Leu Asp
                285                 290                 295
gtg agc atg tac ggc 900
Val Ser MET Tyr Gly
                300
tgg ccg ccg cgg gcc tac ccg tcg tat gac gcc att ccg gag caa  945
Trp Pro Pro Arg Ala Tyr Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Pro Glu Gln
                305                 310                 315
aag ttt ttg gac caa  960
Lys Phe Leu Asp Gln
                320
gcg aat cgc tat gat cga ttg ttt aag ctg tat gaa aaa cac agc  1005
Ala Asn Arg Tyr Asp Arg Leu Phe Lys Leu Tyr Glu Lys His Ser
                325                 330                 335
gat aaa atc agt aac 1020
Asp Lys Ile Ser Asn
                340
gtc acc ttc tgg ggc atc gcc gac aac cat acg tgg ctc gac agt  1065
Val Thr Phe Trp Gly Ile Ala Asp Asn His Thr Trp Leu Asp Ser
                345                 350                 355
cga gcg gat gtt tac 1080
Arg Ala Asp Val Tyr
                360
tat gat gct gat ggg aat gtg att gta gac ccg aaa gcc cca tac  1125
Tyr Asp Ala Asp Gly Asn Val Ile Val Asp Pro Lys Ala Pro Tyr
                365                 370                 375
acg aga gtg gaa aaa 1140
Thr Arg Val Glu Lys
                380
ggg aat gga aaa gat gcg cca ttt gtg ttc gac ccc gaa tac aac  1185
Gly Asn Gly Lys Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp Pro Glu Tyr Asn
                385                 390                 395
gta aaa cct gcg tat 1200
Val Lys Pro Ala Tyr
                400
tgg gct att atc gat cat aag tga    1224
Trp Ala Ile Ile Asp His Lys ^＊＊＊
                405
序列表
SEQ NO.1
<110>福建农林大学
 
<120>一种嗜热耐碱木聚糖酶重组工程菌BL21-XA及其应用
 
<160>2
<210>1
<211>1224
<212>DNA
<213>土芽孢杆菌属(Gebacillus sp)嗜热菌
<220>
<223>
<400>1
 
atgttgaaaa gatcgcgaaa agcgataata gttggattct catttatgct gttgctccct      60
ttagggatga cgaatgcatt ggcaaaaact gaacaatcat actctaaaaa gcctcaaatc     120
agcgcattgc atgccccaca attggaccag cgctacaaag attcattcac tattggtgcg     180
gctgttgaac cttatcagct actaaacgag aaagacgcac aaatgctaaa acgccatttt     240
aacagcattg tcgctgagaa cgttatgaag ccgattaata ttcaaccgga agaaggaaaa     300
ttcaattttg ctgaggcgga tcaaatcgtt cggtttgcta aaaaacacca tatggatatc     360
cgtttccaca cgctcgtttg gcatagccaa gtacctcaat ggttctttct tgacaaggaa     420
ggccaaccaa tggtcaatga aacggaccct gtgaaacgcg aacaaaataa acagctgtta     480
ttaaaacgga tcgaaaccca tattaaaacg attgtcgagc ggtataaaga tgacatcaaa     540
tattgggacg ttgtaaatga ggtagtcggg gatgatggag aattgcgcga ttccccatgg     600
tatcaaatcg ctggcatcga ttatattaag gtagcgttcc aaacagcaag aaaatatggc     660
ggcaacaaga ttaaacttta cattaatgat tacaatacgg aagttgaacc aaagcgaagc     720
gctctttata acttggtgaa acaattaaaa gaagagggca ttcccattga tggtattggc     780
catcagtccc acatccaaat tgactggcct tctgaagagg aaatcgaaaa aacgattatc     840
atgtttgccg atctagggtt agacaaccaa attactgagc tggatgtgag catgtacggc     900
tggccgccgc gggcctaccc gtcgtatgac gccattccgg agcaaaagtt tttggaccaa     960
gcgaatcgct atgatcgatt gtttaagctg tatgaaaaac acagcgataa aatcagtaac    1020
gtcaccttct ggggcatcgc cgacaaccat acgtggctcg acagtcgagc ggatgtttac    1080
tatgatgctg atgggaatgt gattgtagac ccgaaagccc catacacgag agtggaaaaa    1140
gggaatggaa aagatgcgcc atttgtgttc gaccccgaat acaacgtaaa acctgcgtat    1200
tgggctatta tcgatcataa gtga                                           1224
 
SEQ NO.2
 
<210>2
<211>1224
<212>DNA
<213>土芽孢杆菌属(Gebacillus sp)嗜热菌
<220>
<223>
 
<400>2
atg ttg aaa aga tcg cga aaa gcg ata ata gtt gga ttc tca ttt 45
MET Leu Lys Arg Ser Arg Lys Ala Ile Ile Val Gly Phe Ser Phe
1               5               10                      15
atg ctg ttg ctc cct  60
MET Leu Leu Leu Pro
                 20
tta ggg atg acg aat gca ttg gca aaa act gaa caa tca tac tct 105
Leu Gly MET Thr Asn Ala Leu Ala Lys Thr Glu Gln Ser Tyr Ser
                 25                 30                  35
aaa aag cct caa atc 120
Lys Lys Pro Gln Ile
                 40
agc gca ttg cat gcc cca caa ttg gac cag cgc tac aaa gat tca 165
Ser Ala Leu His Ala Pro Gln Leu Asp Gln Arg Tyr Lys Asp Ser
                 45                 50                  55
ttc act att ggt gcg 180
Phe Thr Ile Gly Ala
                 60
gct gtt gaa cct tat cag cta cta aac gag aaa gac gca caa atg 225
Ala Val Glu Pro Tyr Gln Leu Leu Asn Glu Lys Asp Ala Gln MET
                 65                 70                  75
cta aaa cgc cat ttt 240
Leu Lys Arg His Phe
                 80
aac agc att gtc gct gag aac gtt atg aag ccg att aat att caa 285
Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Val MET Lys Pro Ile Asn Ile Gln
                 85                 90                  95
ccg gaa gaa gga aaa 300
Pro Glu Glu Gly Lys
                100
ttc aat ttt gct gag gcg gat caa atc gtt cgg ttt gct aaa aaa  345
Phe Asn Phe Ala Glu Ala Asp Gln Ile Val Arg Phe Ala Lys Lys
                105                  110                115
cac cat atg gat atc 360
His His MET Asp Ile
                120
cgt ttc cac acg ctc gtt tgg cat agc caa gta cct caa tgg ttc  405
Arg Phe His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Val Pro Gln Trp Phe
                125                  130                135
ttt ctt gac aag gaa 420
Phe Leu Asp Lys Glu
                140
ggc caa cca atg gtc aat gaa acg gac cct gtg aaa cgc gaa caa  465
Gly Gln Pro MET Val Asn Glu Thr Asp Pro Val Lys Arg Glu Gln
                145                 150                155
aat aaa cag ctg tta 480
Asn Lys Gln Leu Leu
                160
tta aaa cgg atc gaa acc cat att aaa acg att gtc gag cgg tat  525
Leu Lys Arg Ile Glu Thr His Ile Lys Thr Ile Val Glu Arg Tyr
                165                 170                 175
aaa gat gac atc aaa 540
Lys Asp Asp Ile Lys
                180
tat tgg gac gtt gta aat gag gta gtc ggg gat gat gga gaa ttg  585
Tyr Trp Asp Val Val Asn Glu Val Val Gly Asp Asp Gly Glu Leu
                185                 190                195
cgc gat tcc cca tgg  600
Arg Asp Ser Pro Trp
                200
tat caa atc gct ggc atc gat tat att aag gta gcg ttc caa aca  645
Tyr Gln Ile Ala Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Val Ala Phe Gln Thr
                205                  210                215
gca aga aaa tat ggc 660
Ala Arg Lys Tyr Gly
                220
ggc aac aag att aaa ctt tac att aat gat tac aat acg gaa gtt  605
Gly Asn Lys Ile Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Thr Glu Val
                225                 230                 235
gaa cca aag cga agc 720
Glu Pro Lys Arg Ser
                240
gct ctt tat aac ttg gtg aaa caa tta aaa gaa gag ggc att ccc  765
Ala Leu Tyr Asn Leu Val Lys Gln Leu Lys Glu Glu Gly Ile Pro
                245                 250                 255
att gat ggt att ggc 780
Ile Asp Gly Ile Gly
                260
cat cag tcc cac atc caa att gac tgg cct tct gaa gag gaa atc  825
His Gln Ser His Ile Gln Ile Asp Trp Pro Ser Glu Glu Glu Ile
                265                 270                 275
gaa aaa acg att atc 840
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                280
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MET Phe Ala Asp Leu Gly Leu Asp Asn Gln Ile Thr Glu Leu Asp
                285                 290                 295
gtg agc atg tac ggc  900
Val Ser MET Tyr Gly
                300
tgg ccg ccg cgg gcc tac ccg tcg tat gac gcc att ccg gag caa  945
Trp Pro Pro Arg Ala Tyr Pro Ser Tyr Asp Ala Ile Pro Glu Gln
                305                 310                 315
aag ttt ttg gac caa  960
Lys Phe Leu Asp Gln
                320
gcg aat cgc tat gat cga ttg ttt aag ctg tat gaa aaa cac agc  1005
Ala Asn Arg Tyr Asp Arg Leu Phe Lys Leu Tyr Glu Lys His Ser
                325                 330                 335
gat aaa atc agt aac  1020
Asp Lys Ile Ser Asn
                340
gtc acc ttc tgg ggc atc gcc gac aac cat acg tgg ctc gac agt  1065
Val Thr Phe Trp Gly Ile Ala Asp Asn His Thr Trp Leu Asp Ser
                345                 350                 355
cga gcg gat gtt tac  1080
Arg Ala Asp Val Tyr
                360
tat gat gct gat ggg aat gtg att gta gac ccg aaa gcc cca tac  1125
Tyr Asp Ala Asp Gly Asn Val Ile Val Asp Pro Lys Ala Pro Tyr
                365                 370                 375
acg aga gtg gaa aaa 1140
Thr Arg Val Glu Lys
                380
ggg aat gga aaa gat gcg cca ttt gtg ttc gac ccc gaa tac aac  1185
Gly Asn Gly Lys Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp Pro Glu Tyr Asn
                385                 390                 395
gta aaa cct gcg tat  1200
Val Lys Pro Ala Tyr
                400
tgg gct att atc gat cat aag tga          1224
Trp Ala Ile Ile Asp His Lys ^＊＊＊
                405