技术领域
本发明涉及一种尿素转运蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
氮素是植物必须的矿质营养元素之一，是合成蛋白质、核酸和许多生物活性物质 的必需组分。氮肥在农业生产中的大量使用极大地提高了作物产量，当前全球每年施 用大约8-9千万吨氮肥。作为当今世界上最广泛使用的氮肥类型，在过去十年间(1999 年到2009年)，尿肥(尿素)的产量呈现显著的上升趋势 (http://www.fertilizer.org/ifa/statistics/)。在中国，目前尿素使用量至少占氮 肥使用量的50％以上，而且生产总量每年也在不断增加。因此，尿肥在我国乃至世界 氮肥使用中占据了非常重要的地位。
尿素是一种酰胺态氮肥，含氮量达46％，由于是非酸根类氮肥，因此不会使土壤 板结和酸化，是一种较为理想的氮肥。但是由于土壤中普遍存在着大量的脲酶，能够 快速将尿素水解成CO2和NH3，因此传统观点认为植物根系主要通过吸收尿素降解产物 铵的方式来利用土壤中的尿素。但对叶片施用尿素后发现叶中高水平积累尿素，说明 尿素可以直接被植物吸收利用。进一步利用14C同位素标记尿素的方法直接证明植物不 仅可以吸收尿素，而且在植物中存在着高亲和力和低亲和力两种尿素吸收系统。
高亲和力转运系统(high-affinity transport system，HATS)一般在底物浓度较 低(微摩尔级)时发挥作用，具有饱和动力学特征。最早发现的尿素高亲和力转运蛋白 是酵母中的ScDUR3。Elberry等人(1993)把酵母cDNA文库转入尿素转运缺陷性酵母菌 株(YVNW1)(该菌在供给＜5mM尿素作为唯一氮源时不能生长)，在含2mM尿素的培养基 上筛选得到了具尿素转运功能的ScDUR3基因。通过生物信息学分析，发现ScDUR3的同 源基因在各种动植物中广泛存在，并且大多物种有且仅有一个同源基因。
低亲和力转运系统(low-affinity transport system，LATS)主要在底物浓度(毫 摩尔级)较高时发挥作用，不具有饱和动力学特征。研究表明，某些水通道蛋白(AQP， Aquaporins)可能负责尿素的低亲和力转运。Aquaporin蛋白可以分为四个亚族，分 别是TIPs(tonoplast intrinsic proteins)，NIP(Nod26-like intrinsic protein)， PIPs(Plasma membrane intrinsic proteins)和SIPs(Small and basic intrinsic proteins)。研究表明，水通道除了参与水分子的跨膜运输之外，还介导了中性分子， 包括尿素的跨膜运输。
尿素可以作为氮肥被植物吸收，但在细胞质中如果尿素浓度过高则会产生毒害， 因此植物细胞需要将过多的尿素运入液泡贮存，而在细胞质中尿素浓度低时又可以将 尿素从液泡中运出来参与氮素代谢。
玉米是重要的饲料、经济及生物能源作物，其在国际范围内的需求量与日俱增。 在我国玉米生产中，氮肥的施用量高、利用率低是普遍存在的现象。由于氮肥的大量 施用，随之也带来了环境问题。种植氮高效，特别是尿素高效吸收利用的玉米品种， 是解决氮肥利用率低，降低生产成本，减小环境污染的有效途径，也是农业可持续发 展和增强产品国际竞争力的基本要求。传统选育新品种是个非常长期的过程，现如今 基因工程，特别是玉米转基因技术的成熟，使得我们有可能通过基因工程的手段快速 获得尿素高效吸收利用品种，但是能否快速有效地获得转基因尿素高效新品种在很大 程度上取决于是否具有良好的尿素转运基因。
目前对DUR3和水通道参与尿素转运过程的详细研究仅限于模式植物拟南芥中，对 世界上最重要的粮食作物之一的玉米来说，尿素转运研究还是一片空白，没有相关的 玉米尿素转运蛋白被克隆，更没有相关的文章和专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种尿素转运蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质，名称为ZmTIP4-4蛋白，来源于玉米属玉米(Zea maysL.)， 具体来源为玉米自交系B73，是如下(a)或(b)或(c)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与尿素转运相关的由(a)衍生的蛋白质；
(c)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与尿素利用(吸收)相关的由(a)衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)或(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物 表达得到。上述(b)或(c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义 突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质的基因(ZmTIP4-4基因)也属于本发明的保护范围。
所述DNA具体可为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端第95-850位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2自5’末端第95-853位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件为可用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者 RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元 农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非 翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所 述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表 达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它 们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个 序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的， 也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及 筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的 基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标 记基因，直接根据表型筛选。
所述重组载体具体可为在酵母表达载体pDR195的多克隆位点(如Not I酶切位点) 插入所述基因得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入酵母得到的重组菌。所述酵母具体 可为YNVW1菌株。
本发明还保护所述蛋白或其编码基因在尿素转运和/或利用和/或吸收中的应用。 所述应用具体可为促进尿素转运和/或利用和/或吸收。所述应用具体指的是酵母系统 中。所述酵母具体可为YNVW1菌株。
本发明还保护所述基因在促进生物对尿素的转运和/或利用和/或吸收中的应用。 所述生物为植物或微生物。所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述微生物可为酵 母，如YNVW1菌株。所述促进生物对尿素的转运和/或利用和/或吸收具体可提现为可 以在以尿素为唯一氮源的环境中生长。
本发明还保护一种培育转基因生物的方法，是将所述基因导入目的生物中，得到 转基因生物。所述转基因生物具有如下(I)和/或(II)的属性：(I)所述转基因 生物对尿素转运和/或利用和/或吸收能力高于所述目的生物；(II)在以尿素为唯一氮 源的环境中，所述转基因生物的生长能力高于所述目的生物。所述基因具体可通过所 述重组表达载体导入所述目的生物中。所述目的生物为植物或微生物。所述植物为双 子叶植物或单子叶植物。所述微生物可为酵母，如YNVW1菌株。
本发明发现：ZmTIP4-4基因在玉米根中高表达、且受缺氮诱导，可能介导根系液 泡膜中尿素的装载和卸载；另外，ZmTIP4-4基因在老叶中受缺氮诱导表达，但在新叶 中不受缺氮诱导表达，说明它可能参与老叶中的尿素的再转移。
本发明还发现ZmTIP4-4基因在酵母中的表达可以显著增强酵母的尿素转运和/或 利用和/或吸收能力。
本发明为农作物的尿素高效吸收利用研究提供了更有特色的基因资源，将在基因 工程改良植物的营养高效性能研究中发挥重要作用。
附图说明
图1为cDNA文库筛选及其尿素转运蛋白基因的获得；A图为整个cDNA文库转入 酵母后在2mM尿素培养基上筛选5天后获得的单斑；B图为A图获得的单斑在2mM尿 素培养基上划线继代培养。
图2为实施例2中扩增得到的ZmTIP4-4基因读码框的电泳图。
图3为实施例2中的功能互补验证图。
图4为荧光实时定量PCR分析ZmTIP4-4基因在玉米不同组织器官中的表达情况。
图5为荧光实时定量PCR分析玉米根中ZmTIP4-4基因在缺氮处理下的转录水平 的表达变化情况。
图6为荧光实时定量PCR分析玉米叶中ZmTIP4-4基因在缺氮处理下的转录水平 的表达变化情况。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。
大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101：天根生化科技有限公司。cDNA文库构建试 剂盒：Invitrogen公司。pGEM-T Easy载体：promega公司。各种限制性内切酶购自 Promega公司。各种Taq酶和Trizol RNA小量提取试剂盒购自Takara公司。dNTP混 合物购自上海生工。M-MLV反转酶、T4DNA连接酶购自Promega公司。氨苄青霉素(Amp) 购自欣经科公司。不含氮源的酵母生长培养基(YNB培养基)购自Difco公司。
酵母表达载体pDR195：从国外实验室免费获得；参考文献：Rentsch et al.，1995 FEBS Lett 370：264-268；公众可从中国农业大学获得。
YNVW1菌株(酵母不吸尿素突变体)：从国外实验室免费获得；参考文献：Liu et al.，Urea transport by nitrogen-regulated tonoplast intrinsic proteins in Arabidopsis.Plant Physiol 133：1220-1228；公众可从中国农业大学获得。
玉米自交系B73：由美国Iowa州立大学Kendall Lamkey教授培育，中国农业科学 院作物所种质资源中心从美国引进，公众可以从中国农科院作物所种质资源中心 (http://www.cgris.net/query/croplist.php#)获得，统一编号为：OL702346，公 众也可以从中国农业大学获得。
实施例1、玉米尿素转运蛋白(ZmTIP4-4蛋白)及其编码基因的发现
一、玉米cDNA文库的构建
1、提取玉米自交系B73(苗期)根的总RNA
取200mg新鲜玉米根，在液氮中研磨；加入1ml RNA提取试剂盒提供的Trizol 提取液，室温震荡5分钟；再加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，4℃、12000转离心 15分钟；取上清，加入0.5ml异丙醇，室温静置1小时，4℃、12000转离心15分钟； 取沉淀，加入1ml 70％乙醇，震荡1分钟，4℃、10000转离心10分钟；吸弃上清，沉 淀置通风橱中吹干，加入50μl DEPC水溶解沉淀。1％琼脂糖电泳检测RNA质量，同时 用分光光度计测定RNA浓度。
2、mRNA纯化
取500μg总RNA加入到一新的无RNA酶离心管中，加入1ml试剂盒提供的结合液； 置于65℃10分钟，然后立刻转到冰上放1分钟；液体转移到试剂盒提供的含oligo(dT) 树脂的离心管中，室温轻摇20分钟，室温4000转离心10分钟，小心吸弃上清，重复 2次：然后加入0.3ml结合液重悬树脂，转移到试剂盒提供的spin-column管中，加 入500μl结合液洗涤，4000转室温离心10秒，测洗出液的OD260，如果大于0.05，则 再次加入500μl结合液洗涤，直至洗出液OD260小于0.05；加入200μl洗脱液，柔和悬 起树脂，将spin-column管转到一新的离心管上，室温4000转离心10秒收集mRNA。 最后加入10μl2mg/ml糖苷，30μl2M醋酸钠，600μl无水乙醇，-80℃放置30分钟， 4℃、14000转离心20分钟，弃上清，70％乙醇洗一次，用20μl TE溶解。取出0.5μl 测定OD260并计算浓度。
3、cDNA第一链合成
取5μg mRNA，用cDNA文库构建试剂盒(invi trogen公司，目录号18249-029)所带 的反转录酶进行反转录。具体如下：取1μl试剂盒提供的Biotion-attB2-oligo(dT)加 到10μL浓度为100ng/μl的步骤2纯化得到的mRNA溶液中，70℃放置5分钟，迅速转到 冰上3分钟，然后加入以下成分：
参照试剂盒使用说明书设定如下反应条件：25℃10分钟，42℃60分钟，70℃10 分钟，冰浴2分钟。
4、cDNA第二链合成
以反转录得到的cDNA第一链为模板，合成第二链。
反应体系为：
16℃静置2小时，然后加入2μl T4DNA聚合酶，16℃静置5分钟，补平cDNA的粘末 端，最后加入10μL 0.5M EDTA终止反应。加入160μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 比例混合)混合液，轻摇30秒，14000转离心5分钟，小心取上清到一新离心管中，加 入试剂盒提供的糖原20μg、7.5M醋酸铵80μl、无水乙醇600μl。-20℃放置5小时， 14000转，4℃离心25分钟。小心吸弃上清，沉淀中加入150μl 70％乙醇洗一次，4℃ 14000转离心2分钟，吸弃上清，重复洗一次。离心管开盖常温放置10分钟吹干沉淀， 加入18μl DEPC水溶解沉淀，获得双链cDNA。
5、构建cDNA文库
取获得的双链cDNA 18μl，加入如下成分进行末端attB1加尾：
混匀后16℃反应16-24小时。转入70℃反应15分钟使连接酶失活。
再加入如下成分进行重组反应，将文库DNA连入cDNA文库构建试剂盒提供的 pDONR222载体(invitrogen公司，目录号18249-029)：
25℃反应16-20小时，然后加入2μl蛋白酶K，37℃15分钟使BP Clonase酶失活， 然后置75℃10分钟，使蛋白酶K失活。然后加入糖原20μg，7.5M醋酸铵50μl， 无水乙醇375μl。-20℃放置5小时以上，14000转，4℃离心25分钟。弃上清，加150 μl 70％乙醇洗一次。溶于9μl TE中。每0.5μl DNA加入到50μl大肠杆菌DH10B感 受态中，混匀，转入预冷的电极杯中，2.0kV，200Ω，25μF电击一次，迅速加入 1ml SOC液体培养基，37℃，250转培养45分钟，涂在灭菌的含卡那霉素抗性的SOC 固体培养基上，37℃倒置培养20小时后，用TE溶液将平板上生长的菌体全部收集混合， 提取质粒DNA，即为获得的cDNA文库。
将cDNA文库从pDONR222载体上转移到pDR195载体(Rentsch et al.，1995FEBS Lett 370：264-268，公众可从中国农业大学获得)上，具体操作为在一新离心管中加 入：
同时在一离心管中加入：
37℃放置10-16小时后，两管分别加入1/10体积的10M醋酸铵，2倍体积的无水乙 醇，混匀，4℃，14000转离心15分钟，75％乙醇洗一次，吹干后分别用50μl水溶解。
pDR195载体酶切后进行去磷酸化，方法：
37℃放置5-8小时，加入1/10体积的10M醋酸铵，2倍体积的无水乙醇，混匀，4 ℃，14000转离心15分钟，75％乙醇洗一次，20μl水溶解。
从pDONR222载体上切下来的cDNA文库和pDR195载体连接，反应为：
16℃连接16-20小时后，每5μl转入100μl DH5α感受态细胞(购自天根生化科 技有限公司)中，涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养20小时，收集所有菌体 混匀，提取质粒DNA即为在pDR195载体上的cDNA文库。
二、玉米尿素转运蛋白及其编码基因的克隆
1、cDNA文库转化酵母及尿素转运蛋白筛选
挑取-80℃保存的YNVW1菌株，涂布在YPD固体培养基(1％酵母提取液，2％蛋白胨， 2％葡萄糖)上，30℃培养2天，然后挑单斑入20ml YPD液体培养基中，30℃230rpm 振荡培养2天至饱和；取上述菌液(约2ml)转接入75ml液体YPD培养基中，28℃ 200rpm振荡培养过夜；取2.5ml(具体体积可根据原菌液的OD600再确定)上述菌液 于50ml的YPD液体培养基中至终浓度OD600＝0.1。
30℃200rpm振荡培养5小时左右，至OD600＝0.5-0.8；取50ml菌液，4500rpm常 温离心5分钟收集菌体；加50ml无菌水洗菌体，4500rpm常温离心5分钟收集菌体； 重悬到45ml无菌水中，加入5ml 10×LiAc-TE溶液(1M LiAc，100mM Tris-Cl，20 mM EDTA，pH7.5，灭菌)；4500rpm常温离心5分钟，弃大部分上清，留部分上清，并 将菌体重悬起来，使上清加菌体刚好300ul；每300μl上述菌液中加入30ul新变性 的鲑鱼精DNA，1.05ml 50％PEG4000，120μl10×LiAc-TE，2μlcDNA文库，混匀于 2ml离心管中；28℃摇床中培养30min，42℃水浴中热激15min，取出后4500rpm，20 ℃离心7min至底部，吸出液相弃去。
涂布在含2％葡萄糖和2mM尿素的YNB固体培养基上，30℃黑暗培养5天，获得 长出的菌斑12个(图1A)。将这12个克隆分别在含2mM尿素的固体培养基上划线继 代培养(图1B)，结果有9个克隆依然能够功能互补尿素缺陷性酵母，也即获得了9 个独立阳性克隆。
2、酵母质粒DNA的提取、测序
从获得的9个独立酵母菌斑中提取质粒DNA并测序。
酵母质粒DNA的提取方法如下：挑取生长菌斑入0.5ml含1mM Arg的YNB液体 培养基中，30℃，230rpm振荡培养过夜；4,000rpm离心5分钟收集菌体；倒掉上清 液，用新鲜的液体培养基重悬菌体(总体积约50μl)，然后每管加入10μl浓度10 mg/ml的溶菌酶溶液，充分振荡使溶液与菌体完全混匀；将试管在30℃，230rpm振 荡培养60分钟；每管加入10μl 20％SDS，剧烈振荡1分钟使充分混匀；将样品放 到-20℃2小时，取出再融解，剧烈振荡使充分裂解；用TE缓冲液(pH7.0)将每管体 积补充到200μl；加200μl酚∶仿∶异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡5分钟；14,000rpm 离心10分钟，将上清转移到新离心管中；加8μl 10M NH4Ac和500μl无水乙醇； 在-70℃冰箱中放1小时，14,000rpm离心10分钟；弃去上清，吹干沉淀，用20μl H2O溶解沉淀；取0.5μl质粒转到E.coli感受态细胞(DH5α菌株)中，37℃摇菌，提 取质粒，酶切鉴定后送公司测序。
测序结果表明9个克隆中有3个克隆属于同一个基因，将其命名为ZmTIP4-4基因 (如序列表的序列2所示，其开放阅读框为自5’末端第95至850位核苷酸)。ZmTIP4-4 基因编码ZmTIP4-4蛋白(如序列表的序列1所示)。根据生物信息学分析，ZmTIP4-4 蛋白属于水通道TIP亚家族成员，为跨膜转运蛋白，其分子量25.3KD，等电点6.96， 具有7个跨膜结构域。
实施例2、序列1所示蛋白的功能互补验证
一、Zm7IP4-4基因读码框的扩增
1、提取玉米自交系B73(苗期)根的总RNA，并反转录得到cDNA。
2、根据实施例1的测序结果，设计一对引物如下：
P1-F：5’-CATGGCAAAGTTCGCTCTTGGTC-3’；
P1-R：5’-GCCTAGAAGTCGGTGTCATCCCTG-3’。
其中P1-F包含翻译起始密码子ATG，P1-R包含翻译终止密码子TAG，靶序列约为 760bp。
3、以步骤1的cDNA为模板，用步骤2设计的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物。
PCR反应体系(50μl)：cDNA(2μg总RNA的反转录产物)5.0μl、2×GC Buffer II 25.0μl、P1-F(10μM)2.0μl、P1-R(10μM)2.0μl、dNTP mix(10mM each)2.0μl、 pfu酶(5U/μl)0.5μl、补H2O至50μl。
PCR反应条件：94℃预变性1分钟；然后94℃30秒、60℃30秒、72℃3分钟， 35个循环；之后加入1μl Taq酶，72℃延伸和加尾20分钟。
PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图见图2(1为以水为模板的阴性对照，2为 PCR扩增产物)。
二、制备重组质粒
1、将步骤一获得的PCR扩增产物插入pGEM-T easy，得到重组质粒甲。
2、用限制性内切酶Not I酶切重组质粒甲，回收小片段。
3、用限制性内切酶Not I酶切酵母表达载体pDR195，回收载体骨架(约6300bp)。
4、将步骤2回收的小片段和步骤3回收的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据 测序结果对重组质粒乙进行结构描述如下：在酵母表达载体pDR195的Not I酶切位点 插入了包括序列表的序列2自5’末端第95至853位核苷酸所示ZmTIP4-4基因在内 的DNA片段。
三、序列1所示蛋白的功能验证
1、挑取YNVW1菌株，涂布在YPD固体培养基上，30℃培养2天，然后挑单斑接种 至20ml YPD液体培养基中，30℃、230rpm振荡培养2天。
2、将2ml步骤1的菌液转接入75ml YPD液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养 过夜。
3、将2.5ml步骤2的菌液转接入50ml YPD液体培养基中，30℃、200rpm振荡培 养至OD600＝1.0。
4、取50ml步骤3的菌液，4500rpm离心5分钟，收集沉淀(菌体)。
5、向步骤4的菌体中加入50ml无菌水，洗涤菌体，4500rpm离心5分钟，收集 沉淀(菌体)。
6、将步骤5的菌体用45ml无菌水重悬，加入5ml 10×LiAc-TE溶液(1M LiAc、 100mM Tris-Cl、20mM EDTA，其余为水；pH7.5；灭菌后使用)，4500rpm离心5分钟， 弃除大部分上清，剩余上清和菌体的体积为300ul。
7、将300ul步骤6的上清菌体混合物、30ul新变性的鲑鱼精DNA、1.05ml 50％ (质量百分含量)PEG4000水溶液、120μl 10×LiAc-TE溶液和2μl(约2μg)步骤二 制备的重组质粒乙混匀于2ml离心管中，28℃、150rpm摇床培养30min，然后42℃ 水浴中热激15min，再然后20℃、4500rpm离心7min，取沉淀(菌体)。
8、将步骤7收集的菌体用水分别稀释至OD600＝1、0.1、0.01、0.001或0.0001五 个梯度，然后依次涂布在含2mM尿素的YNB固体培养基上，30℃黑暗培养5天，观察 并拍照。
用酵母表达载体pDR195代替重组质粒进行步骤1至步骤8，作为负对照。
结果见图3。转化酵母表达载体pDR195的菌株不能生长，但转化含ZmTIP4-4基 因的重组质粒可以利用尿素作为唯一氮源生长，说明ZmTIP4-4蛋白在酵母系统中具有 尿素转运功能。
实施例3、ZmTIP4-4基因的表达特性分析
一、实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)分析ZmTIP4-4基因的器官表达特性
1、选用玉米自交系B73，分别提取苗期的根和叶，抽雄期的新叶、老叶、穗位叶、 雄穗和幼穗，授粉后15天的新叶、老叶、穗位叶、穗轴和种子，提取总RNA。
2、分别将步骤1的各个总RNA反转录为cDNA并进行Real-time PCR。
P2-F：5′-ACACGAACCGCTTCCCAGGG-3′；
P2-R：5′-CATTCCATTCGAATCGAAACCG-3′。
P3-F：5′-CCTATAACGCCACGCTCTCTGT-3′；
P3-R：5′-CATTGTCCAGCACCATGCA-3′。
试剂选用TOYOBO公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix(目录号91620F3)， 定量PCR仪器型号为ABI7500。PCR反应程序：50℃2分钟，95℃10分钟，45个循 环(95℃15秒，61℃30秒，72℃1分钟)。融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟 一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环。
以P2-F和P2-R扩增ZmTIP4-4基因(靶片段约为125bp)，以P3-F和P3-R扩增玉 米TUB基因(耙片段约为138bp)作为内参对照，用同一样品中的ZmTIP4-4基因的表 达量除以TUB基因的表达量作为ZmTIP4-4基因的相对表达量，研究ZmTIP4-4基因在 玉米不同组织部位中表达特性。结果见图4。玉米ZmTIP4-4基因主要在玉米根部、幼 穗和穗轴中高表达。
二、Real-Time PCR分析ZmTIP4-4基因在玉米根中受氮素处理的表达特性
1、水培玉米自交系B73幼苗，用Hoagland营养液(K2SO40.5mM、MgSO4·7H2O 0.6mM、 KH2PO40.1mM、CaCl2·2H2O0.5mM、NH4NO32mM、H3BO31μM、MnSO4·H2O0.5μM、ZnSO4·7H2O 0.5μM、CuSO4·5H2O 0.2μM、Na2MoO4·2H2O 0.07μM、NaFe-EDTA 0.1mM，其余为水； pH为5.7)培养，每2天换一次营养液。生长到五叶期时(萌发后20天)，移入不含 硝酸铵的Hoagland营养液中进行缺氮处理。分别在缺氮前、缺氮1天和缺氮3天收取 根和叶，其中叶又分为新叶(最幼嫩的一片叶)和老叶(完全展开叶，一般五叶期玉 米的中间叶)。
2、将步骤1收取的各个组织分别提取总RNA。
3、分别将步骤2的各个总RNA反转录为cDNA并进行Real-time PCR，方法同步 骤一。
结果见图5(根)和图6(叶)。在根中，缺氮1天后ZmTIP4-4基因的表达水平明 显升高，推测该基因在玉米根中行使吸收尿素的功能，并且受到缺氮的诱导。在叶中， ZmTIP4-4基因的表达水平仅在老叶中受到缺氮胁迫的诱导升高，而在新叶中不受缺氮 处理影响，推测该基因在老叶中负责尿素的转运，可能与老叶中的尿素再转移有关。