技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方 法。
背景技术
在利用工程菌表达重组蛋白过程中，外源蛋白在大肠杆菌中降解是一个经 常遇到的问题，导致该问题的主要原因是大肠杆菌的蛋白水解酶识别并切割了 外源蛋白的特异性氨基酸序列。目前所用的大肠杆菌工程菌株中，已有Lon蛋 白酶缺失的菌株，如BL21(DE3)等。但不同蛋白酶识别和切割的序列是不一样 的，单一蛋白酶的缺失只能针对特定的情况，因此需要针对特定情况建立新的 蛋白酶缺失菌株。ClpP属于Clp分子伴侣家族，与ClpA、ClpB和ClpX相结合， 能降解大肠杆菌内的一部分蛋白质。其机制是识别蛋白质C端的多肽序列 ANDENYALAA，并在ClpA或ClpX的协助下，将含有此序列的肽链降解。
在工程菌的基因敲除工艺中常用的是同源重组技术，而同源重组与非同源 重组相比频率要低得多。为了避免大容量地筛选重组基因，一般需要在转运盒 中包含筛选标记以利于确认靶点基因区的敲入或敲除。然而，插入的筛选标记 (例如FRT或loxP位点)会影响基因组的进一步改造。
目前常用的是敲除目的基因的手段是依赖λ噬菌体的Red重组系统，该系统 可以直接利用含同源臂的PCR线形片段，替换出同源臂内的目的基因。Red重 组虽然方法比较简单快捷，但同时也存在一些缺点。首先，这种重组方法不适 合用于改造非大肠杆菌K系列的菌株，如BL21(DE3)等。其次，在筛选标记剪切 后仍然存在至少一个FRT位点或loxP位点，即所谓的残留痕迹；此外，即使 在重组酶不存在的情况下，含有多个残留痕迹的染色体由于痕迹点之间的重组 现象，容易导致染色体基因组的随意重排或敲除。因此，需要开发一种能够改 造靶基因或基因组序列而没有留下筛选标记或外源DNA序列等残留痕迹的方 法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法，旨在 提供一种可敲除靶基因而不会引入外源DNA序列的方法。
本发明实施例是这样实现的，一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法，包括 以下步骤：
分别以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，克隆包括ClpP基因5’端表达 序列及其上游序列的第一序列和包括ClpP基因3’端表达序列及其下游序列的 第二序列：其中用第一引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2克隆该第一序 列；用第二引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4克隆该第二序列；
以质粒PUC-KS为模板，获得kansacB基因作为第三序列；
按照第一序列、第三序列及第二序列的顺序将该三条序列连接成一段序列 得第一组合序列，其中该第一序列3’端与第三序列5’端连接，该第三序列3’ 端与该第二序列5’端连接；
将该第一组合序列插入至质粒pMAK705，获得第一敲除质粒；
将该第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经第一次培养及筛选， 获得第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)；
按照第一序列及第二序列的顺序将该两条序列连接成一段序列得第二组合 序列，其中该第一序列3’端与第二序列5’端连接；
将该第二组合序列插入至质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；
将该第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)中，经第二 次培养及筛选，获得目的重组大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明实施例还提供利用本发明的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制 备方法制得的大肠杆菌。
本发明的ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法采用大肠杆菌内源性的recA重 组系统，操作简便，可广泛应用于不适合使用red重组的菌株的改造；本发明 的制备方法未引入任何多余的序列，减少了外源基因对重组蛋白表达的干扰， 避免基因敲除后在染色体上留下残留痕迹，有利于菌株的基因组的稳定，且更 方面于后续的改造工作；本发明的制备方法无痕敲除了ClpP基因，优化了大肠 杆菌BL21(DE3)，获得一种可高效表达外源蛋白的表达菌株，可提高工业发酵 的效率。
附图说明
图1是本发明的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法流程示意图；
图2是本发明实施例提供的第一序列、第二序列、第三序列及第一组合序 列的PCR扩增结果电泳图；
图3是本发明实施例提供的制备方法获得的菌株及野生型大肠杆菌 BL21(DE3)基因组Southern杂交结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以 下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述 的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，包括 以下步骤：
分别以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用第一引物对P1(SEQ ID NO： 1)和P1(SEQ ID NO：2)克隆第一序列，该第一序列包括ClpP基因5’端表达序 列及其上游序列；用第二引物对P3(SEQ ID NO：3)和P4(SEQ ID NO：4)克隆 第二序列，该第二序列包括ClpP基因3’端表达序列及其下游序列；
以质粒PUC-KS为模板，获得第三序列，该第三序列为kansacB基因；
将该第一序列、第三序列及第二序列连接成一段序列得第一组合序列，其 中该第一序列3’端与第三序列5’端连接，该第三序列3’端与该第二序列5’端连 接，即第三序列位于第一序列和第二序列之间；
将该第一组合序列插入至自杀质粒pMAK705，经第一次培养筛选，获得 第一敲除质粒；
将该第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得第一次双交换大肠 杆菌BL21(DE3)，即含有标记基因kansacB的大肠杆菌；
将该第一序列及第二序列连接成一段序列得第二组合序列，其中该第一序 列3’端与第二序列5’端连接，即第一序列位于第二序列上游；
将该第二组合序列插入至自杀质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；
将该第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)中，经第二 次培养筛选，获得ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明实施例中，除非另外说明，“序列”指DNA序列。在本发明实 施例中每次酶切及连接之后均进行检验，验证无误后进行下一步操作，这些操 作均为本领域技术人员熟知，以下不再详细描述。
本发明实施例中使用的大肠杆菌为BL21(DE3)，即含有DE3的BL21菌株， BL21菌株是常用的表达菌株，通常配合以强表达载体来进行目的基因的表达。 (DE3)是指宿主为λDE3，其携带有T7RNA聚合酶基因，其适用于利用pET表 达系统表达重组蛋白。具体地，上述第一引物对、第二引物对的序列如下所示：
第一引物对：
正向引物P1：ATAGGATCCTCGTCATCGA ATGATTTA SEQ ID NO：1，
反向引物P2：GCGTGAGGGGAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO：2，
其中引物P1的下划线部分为BamHI酶切位点；
第二引物对：
正向引物P3：ACGACGCCCGGGTCAATCATTAGAACAG SEQ ID NO：3，
反向引物P4：CGCGAGCTCGCAGACGACCAATAAACT SEQ ID NO：4，
其中引物P4的下划线部分为sacI酶切位点。
利用引物对P1和P2克隆获得的第一序列为SEQ ID NO：5，具体为：
TCGTCATCGAATGATTTACAGTACTTTAGCGGAGGAACTCTCTACTACCGTTCATGCGCTGGCTCT GCATACTTACACTATTAAGGAGTGGGAAGGGTTGCAGGACACCGTCTTTGCCTCTCCTCCCTGTCG TGGAGCAGGAAGCATCGCGTAAAAACGCATTTGCAACTGTCGGCGCTTTTCCAGTATGTTGCTAAA GATTTTATGAAAAACGGCCTGCGGGCCGTTTTGTTTTGTCTGGATTTTGCGCTTTTTGCCCAGCAT TCAGACGAAAATTGCCCGGGAATTGTGAAAAAATACGCGACAGCGCGCAATAACCGTTCTCGACTC ATAAAAGTGATGCCGCTATAATGCCGCGTCCTATTTGAATGCTTTCGGGATGATTCTGGTAACAGG GAATGTGATTGATTATAAGAACATCCCGGTTCCGCGAAGCCAACAACCTGTGCTTGCGGGGTAAGA GTTGACCGAGCACTGTGATTTTTTGAGGTAACAAGATGCAAGTTTCAGTTGAAACCACTCAAGGCC TTGGCCGCCGTGTAACGATTACTATCGCTGCTGACAGCATCGAGACCGCTGTTAAAAGCGAGCTGG TCAACGTTGCGAAAAAAGTACGTATTGACGGCTTCCGCAAAGGCAAAGTGCCAATGAATATCGTTG CTCAGCGTTATGGCGCGTCTGTACGCCAGGACGTTCTGGGTGACCTGATGAGCCGTAACTTCATTG ACGCCATCATTAAAGAAAAAATCAATCCGGCTGGCGCACCGACTTATGTTCCGGGCGAATACAAGC TGGGTGAAGACTTCACTTACTCTGTAGAGTTTGAAGTTTATCCGGAAGTTGAACTGCAGGGTCTGG AAGCGATCGAAGTTGAAAAACCGATCGTTGAAGTGACCGACGCTGACGTTGACGGCATGCTGGATA CTCTGCGTAAACAGCAGGCGACCTGGAAAGAAAAAGACGGCGCTGTTGAAGCAGAAGACCGCGTAA CCATCGACTTCACCGGTTCTGTAGACGGCGAAGAGTTCGAAGGCGGTAAAGCGTCTGATTT。
利用引物对P3和P4克隆获得的第二序列为SEQ ID NO：6，具体为：
GGTCAATCATTAGAACAGATTGAACGTGATACCGAGCGCGATCGCTTCCTTTCCGCCCCTGAAGCG GTGGAATACGGTCTGGTCGATTCGATTCTGACCCATCGTAATTGATGCCAGAGGCGCAACTGTGCC GCTATACTTATCCAGGGCGGCACAACGCTGTAAGCGGCTTGCGCCTGAGAATGGCATTTGCGTCGT CGTGTGCGGCACAAAGAACAAAGAAGAGGTTTTGACCCATGACAGATAAACGCAAAGATGGCTCAG GCAAATTGCTGTATTGCTCTTTTTGCGGCAAAAGCCAGCATGAAGTGCGCAAGCTGATTGCCGGTC CATCCGTGTATATCTGCGACGAATGTGTTGATTTATGTAACGACATCATTCGCGAAGAGATTAAAG AAGTTGCACCGCATCGTGAACGCAGTGCGCTACCGACGCCGCATGAAATTCGCAACCACCTGGACG ATTACGTTATCGGCCAGGAACAGGCGAAAAAAGTGCTGGCGGTCGCGGTATACAACCATTACAAAC GTCTGCGCAACGGCGATACCAGCAATGGCGTCGAGTTGGGCAAAAGTAACATTCTGCTGATCGGTC CGACCGGTTCCGGTAAAACGCTGCTGGCTGAAACGCTGGCGCGCCTGCTGGATGTTCCGTTCACCA TGGCCGACGCGACTACACTGACCGAAGCCGGTTATGTGGGTGAAGACGTTGAAAACATCATTCAGA AGCTGTTGCAGAAATGCGACTACGATGTCCAGAAAGCACAGCGTGGTATTGTCTACATCGATGAAA TCGACAAGATTTCTCGTAAGTCAGACAACCCGTCCATTACCCGAGACGTTTCCGGTGAAGGCGTAC AGCAGGCACTGTTGAAACTGATCGAAGGTACGGTAGCTGCTGTTCCACCGCAAGGTGGGCGTAAAC ATCCGCAGCAGGAATTCTTGCAGGTTGATACCTCTAAGATCCTGTTTATTTGTGGCGGTGCGTTTG CCGGTCTGGATAAAGTGATTTCCCACCGTGTAGAAACCGGCTCCGGCATTGGTTTTGGCGCGACGG TAAAAGCGAAGTCCGACAAAGCAAGCGAAGGCGAGCTGCTGGCGCAGGTTGAACCGGAAGATCTGA TCAAGTTTGGTCTTATCCCTGAGTTTATTGGTCGTCTGC。
在获得第一组合序列或第二组合序列之后，引物P1和引物P4对应的序列 位于该第一组合序列或第二组合序列5’末端和3’末端，而在引物P1和P4中加 入酶切位点，便于在构建敲除质粒时对第一组合序列或者第二组合序列与载体 质粒同时进行双酶切处理，然后进行连接以构建成敲除质粒。本发明实施例中 使用BamHI和sacI酶切位点，该两种酶为本领域技术人员熟知的酶。
具体地，在本发明实施例中，上述第一序列、第二序列、第三序列的克隆 顺序不分先后，可同时进行，也可先后分别进行。
具体地，在本发明实施例中，上述第一敲除质粒、第二敲除质粒的构建顺 序不分先后，可同时进行，也可先后分别进行。
具体地，在本发明实施例中，获得该第三序列，即kansacB基因序列，可 通过设计特定PCR引物克隆获得，也可通过序列合成的方式获得，并且该获得 的第三序列可通过融合PCR或其他连接方式与该第一序列和第二序列进行连 接。本发明实施例中优选使用具有以下序列的引物对P5和P6克隆kansacB基 因序列：
正向引物P5 TCTGATTTCCCCTCACGCTGCCGCAA SEQ ID NO：7，
反向引物P6 ATGATTGACCCGGGCGTCGTGGACTATG SEQ ID NO：8。
具体地，kansacB基因序列是指两段串连在一起的两段基因序列：kan基因 和sacB基因，其中kan基因为卡那霉素抗性基因，sacB基因表示的是蔗糖果 聚糖酶基因。
kan基因序列为SEQ ID NO：9，具体为：
CCCCTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGC CAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAA CGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGT TTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTG CAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCA AGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGC TTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGT GTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAA TGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGT GCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCT CCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCA TACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC TCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGC CGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGA TGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCT GGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGG CGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTT CTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACG CCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATC GTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCAC CCCAGCTTCAAAAGCGCTCT。
sacB基因序列为SEQ ID NO：10，具体为：
TGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCAT CGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCTAGAGGATCGATC CTTTTTAACCCATCACATATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTGAAATGAGATATTATGATATTT TCTGAATTGTGATTAAAAAGGCAACTTTATGCCCATGCAACAGAAACTATAAAAAATACAGAGAAT GAAAAGAAACAGATAGATTTTTTAGTTCTTTAGGCCCGTAGTCTGCAAATCCTTTTATGATTTTCT ATCAAACAAAAGAGGAAAATAGACCAGTTGCAATCCAAACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAAA AGTAAATCGCGCGGGTTTGTTACTGATAAAGCAGGCAAGACCTAAAATGTGTAAAGGGCAAAGTGT ATACTTTGGCGTCACCCCTTACATATTTTAGGTCTTTTTTTATTGTGCGTAACTAACTTGCCATCT TCAAACAGGAGGGCTGGAAGAAGCAGACCGCTAACACAGTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATG AACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGC GCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACATACGGCATTTCCCAT ATTACACGCCATGATATGCTGCAAATCCCTGAACAGCAAAAAAATGAAAAATATCAAGTTTCTGAA TTTGATTCGTCCACAATTAAAAATATCTCTTCTGCAAAAGGCCTGGACGTTTGGGACAGCTGGCCA TTACAAAACGCTGACGGCACTGTCGCAAACTATCACGGCTACCACATCGTCTTTGCATTAGCCGGA GATCCTAAAAATGCGGATGACACATCGATTTACATGTTCTATCAAAAAGTCGGCGAAACTTCTATT GACAGCTGGAAAAACGCTGGCCGCGTCTTTAAAGACAGCGACAAATTCGATGCAAATGATTCTATC CTAAAAGACCAAACACAAGAATGGTCAGGTTCAGCCACATTTACATCTGACGGAAAAATCCGTTTA TTCTACACTGATTTCTCCGGTAAACATTACGGCAAACAAACACTGACAACTGCACAAGTTAACGTA TCAGCATCAGACAGCTCTTTGAACATCAACGGTGTAGAGGATTATAAATCAATCTTTGACGGTGAC GGAAAAACGTATCAAAATGTACAGCAGTTCATCGATGAAGGCAACTACAGCTCAGGCGACAACCAT ACGCTGAGAGATCCTCACTACGTAGAAGATAAAGGCCACAAATACTTAGTATTTGAAGCAAACACT GGAACTGAAGATGGCTACCAAGGCGAAGAATCTTTATTTAACAAAGCATACTATGGCAAAAGCACA TCATTCTTCCGTCAAGAAAGTCAAAAACTTCTGCAAAGCGATAAAAAACGCACGGCTGAGTTAGCA AACGGCGCTCTCGGTATGATTGAGCTAAACGATGATTACACACTGAAAAAAGTGATGAAACCGCTG ATTGCATCTAACACAGTAACAGATGAAATTGAACGCGCGAACGTCTTTAAAATGAACGGCAAATGG TACCTGTTCACTGACTCCCGCGGATCAAAAATGACGATTGACGGCATTACGTCTAACGATATTTAC ATGCTTGGTTATGTTTCTAATTCTTTAACTGGCCCATACAAGCCGCTGAACAAAACTGGCCTTGTG TTAAAAATGGATCTTGATCCTAACGATGTAACCTTTACTTACTCACACTTCGCTGTACCTCAAGCG AAAGGAAACAATGTCGTGATTACAAGCTATATGACAAACAGAGGATTCTACGCAGACAAACAATCA ACGTTTGCGCCGAGCTTCCTGCTGAACATCAAAGGCAAGAAAACATCTGTTGTCAAAGACAGCATC CTTGAACAAGGACAATTAACAGTTAACAAATAACAAATAAAAACGCAAAAGAAAATGCCGATGGGT ACCGAGCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGC CTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCA CGACGCCCG。
其中sacB基因的作用是利用培养基进行反选。含有sacB基因的细菌在含 有蔗糖的培养基中是致死的，因而在本发明实施例中可以用含有蔗糖的固体培 养基来筛选第二次双交换的菌株，即目的重组大肠杆菌。在原来已经插入细菌 基因组上的自杀质粒(即PMAK705质粒，含有sacB)在传代中消失时，sacB基 因也随之从重组菌的基因组中消失，因而发生第二次双交换的目的菌株能在蔗 糖培养基上生长，即实现了对于第二次双交换的菌株的筛选。
在本发明实施例中利用了两次双交换操作，在每次双交换操作过程中，先 将特定基因序列插入至特定位点，进行单交换，然后利用同源重组，特定基因 序列替换掉目的基因序列，实现了双交换。
具体地，该第一序列、第三序列和第二序列的连接通过融合PCR进行，融 合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产 物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的DNA片段连接起来，该 技术不需要内切酶和连接酶而实现了DNA片段的连接，操作简便。
优选地，在将上述第一序列及第二序列连接成第二组合序列时，使用引物 对P1(SEQ ID NO：1)和P7(SEQ ID NO：11)扩增该第一序列，同时用引物对 P8(SEQ ID NO：12)和P4(SEQ ID NO：4)扩增第二序列，然后利用融合PCR技 术，将该第一序列及第二序列连接在一起。其中引物P7和引物P8序列为具体 为：
P7 ATGATTGACCAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO：11，
P8 CGTCTGATTTGGTCAATCATTAGAACAG SEQ IDNO：12。
具体地，在将该第一组合序列插入至质粒pMAK705时，将该第一组合序 列和质粒pMAK705分别进行BamHI和sacI双酶切处理，然后用DNA连接酶 连接，获得第一敲除质粒，该DNA连接酶为T4连接酶。
具体地，在将该第二组合序列插入至质粒pMAK705时，将该第二组合序 列和质粒pMAK705分别进行BamHI和sacI双酶切处理，然后用DNA连接酶 连接以获得第二敲除质粒。
在本发明实施例中，将该第一敲除质粒和该第二敲除质粒转化至大肠杆菌 时均采用电转化的方式，以具有较高的转化效率。
具体地，在将第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中之后，该第一敲 除质粒与大肠杆菌染色体进行同源重组，如图1所示，左侧图中CU为第一序 列，kansacB为第三序列，CD为第二序列，它们组合在一起构成第一组合序列， 该第一组合序列替换掉大肠杆菌BL21(DE3)中含有ClpP基因及其上下游部分 序列的一段序列。由于同源重组的效率不可能为100%，因此需对转化后的大 肠杆菌进行相应的培养筛选，以获得转化有该第一敲除质粒的第一次双交换大 肠杆菌。本发明使用的质粒PMAK705为温度敏感复制子,其在44℃时不表达 氯霉素抗性且不能复制，但在该质粒整合至宿主染色体上时，可利用宿主的启 动子来启动表达，因此可利用含氯霉素抗性的培养基对转化有质粒PMAK705 的菌株进行筛选，以得到转化有该第一敲除质粒的第一次双交换大肠杆菌。
具体地，在将第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)中 之后，该第二敲除质粒与上述第一次双交换大肠杆菌同源重组，如图1所示， 右侧图中第二组合序列，即CU-CD，替换掉与之有同源臂的KansacB基因及其 上下游序列，通过第二次双交换实现了对KansacB基因的敲除。由于不可能全 部实现双交换，因此该敲除后同样需要培养筛选以获得第二次双交换大肠杆菌， 即敲除标记基因的KansacB基因的大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明实施例利用了RecA重组系统，通过构建携带有目的基因上下游同 源臂的自杀质粒(本发明实施例使用PMAK705质粒)，使质粒骨架上两同源臂中 的标记基因替代基因组上的目的基因，第一次替换是将ClpP基因替换为 KansacB基因，引入卡那霉素抗性，便于筛选，第二次利用相同的同源重组步 骤将KansacB基因敲除，最终构建成目的基因突变菌。本发明实施例制备的ClpP 基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)在表达外源蛋白时可减少目的蛋白的降解。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释。
实施例1
1.第一组合序列的获得
(1)按以下序列合成各对引物：
第一引物对：
正向引物P1：ATAGGATCCTCGTCATCGAATGATTTA SEQ ID NO：1，
反向引物P2：GCGTGAGGGGAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO：2，
其中引物P1的下划线部分为BamHI酶切位点；
第二引物对：
正向引物P3：ACGACGCCCGGGTCAATCATTAGAACAG SEQ ID NO：3，
反向引物P4：CGCGAGCTCGCAGACGACCAATAAACT SEQ ID NO：4，
其中引物P4的下划线部分为sacI酶切位点；
第三引物对：
正向引物P5 TCTGATTTCCCCTCACGCTGCCGCAA SEQ ID NO：7，
反向引物P6 ATGATTGACCCGGGCGTCGTGGACTATG SEQ ID NO：8。
(2)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用引物P1和P2，用fastPfu DNA 聚合酶扩增部分ClpP基因5’端部分序列及其上游序列的一部分，得到1051bp 上游同源臂(SEQ ID NO：5)，命名为CU；同时以引物P3和P4扩增ClpP基因 3’端部分序列及其下游序列的一部分，得到1161bp下游同源臂(SEQ ID NO：6)， 命名为CD。再以质粒PUC-KS为模板，以引物P5和P6扩增kansacB基因序 列，得到3527bp的DNA片段：SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10，两者串联在一 起。PCR反应体系如下所示：
将以上混合物混匀，进行PCR反应。其中CU、kansacB、CD三段序列的 PCR反应均包括以下过程：
95℃预变性2min，
30次循环反应，
72℃继续延伸3min，
不同之处在于30次循环反应的条件不同。表1显示了CU、kansacB、CD 三段序列的PCR反应中的循环反应的条件及对应的扩增产物长度。
表1CU、kansacB、CD的PCR反应中的循环条件及扩增产物长度
融合片段反应条件扩增片段的长度 CU 30次:95℃20sec，56℃20sec，72℃30sec 1051bp CD 30次:95℃20sec，60℃20sec，72℃30sec 1161bp kansacB 30次:95℃20sec，60℃20sec，72℃30sec 3527bp
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后用DNA胶回收试剂盒回收与纯化上述 三个目的片段，纯化后的PCR产物用作后续的无引物融合PCR反应的模板。
(3)测定上述三种回收产物中目的片段浓度，在50μL体系中加入等摩尔的 CU、kansacB、CD三种序列片段，不添加引物，进行三种片段的互补延伸， 以形成全长的融合PCR产物(中间产物)，按以下组分建立PCR反应体系：
将上述混合物充分混匀，按以下程序进行PCR扩增：
95℃预变性2min，
95℃变性20sec，56℃退火20sec，72℃延伸2min，15次循环，
72℃继续延伸3min。
扩增获得的中间产物置于-20℃保存备用，作为下一步扩增的模板。
(4)以上述中间产物为模板，用第一组合序列上下游引物(即P1和P4)进行 融合片段的全长扩增。反应条件如下：
将上述反应体系混匀，进行PCR反应，PCR反应条件为：
95℃预变性2min，
95℃变性20sec，57℃退火20sec，72℃延伸2min，30个循环，
72℃延伸2min。
扩增所得的DNA融合片段为CU-kansacB-CD，长度为5600bp左右，该融 合片段用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收并纯化PCR扩增产物，纯化后 的DNA片段于-20℃保存备用。CU、kansacB、CD及融合片段 CU-kansacB-CD(即第一组合序列)的电泳图如图2所示，其中M泳道为Marker， 泳道1为kansacB序列，泳道2为CU序列，泳道3为CD序列，泳道4为第 一组合序列。
2．大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
(1)从新鲜的LB平板上挑取一个大肠杆菌DH5α的单菌落，接种于含有 50mlLB培养液的锥形瓶中，于37℃摇动(250r/min)培养，过夜。
(2)高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用。
(3)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细 胞用。
(4)转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB的1-2升锥形瓶中，于37°C 下振荡培养2-6小时(300r/min)。
(5)当OD600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却 15~30min，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。
(6)将大肠杆菌细转移至冰冷的离心管中，在4°C，5000g下离心15分钟， 弃上清液。
(7)用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体 积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
(8)重复上述步骤，离心，弃上清液，重复步骤(7)用灭菌的冰水重悬浮细 胞，离心，弃上清液。
(9)用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞，离心，小心弃去上清 液。
(10)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml，将细胞按150μL等份装 入微量离心管，于-80°C保存。
3.第一敲除质粒的获得
将融合片段CU-kansacB-CD克隆到平末端载体PEASY-Blunt上，转化至步 骤2制得的感受态大肠杆菌DH5α中，扩增该转化的大肠杆菌DH5α，提取质 粒，对质粒酶切验证并测序，验证后，保存，用于下一步处理，该连接至载体 上的融合片段命名为PEASY-CU-kansacB-CD。
将载体PEASY-CU-kansacB-CD，用BamHI和sacI双酶切，获得重组片段 后，与经过同样的双酶切处理的质粒pMAK705，用T4DNA连接酶连接，得 到第一敲除质粒，命名为pMAK-EM，转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，酶 切验证正确后置于-20°C冰箱中保存备用。该转化后的大肠杆菌BL21(DE3)即 为第一敲除质粒。
4.第二组合序列的获得
按照以下序列合成P7和P8引物：
P7 ATGATTGACCAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO：11，
P8 CGTCTGATTTGGTCAATCATTAGAACAG SEQ ID NO：12。
其中P1与P7作为引物对，P8与P4作为引物对，利用与上述步骤1中相 同的融合PCR的方法，将CU序列与CD序列连接起来，得到长度约2000bp 的融合片段CU-CD，即第二组合序列。
5.第二敲除质粒的获得
利用与步骤3相同的操作步骤，将融合片段CU-CD克隆到平末端载体 PEASY-Blunt上，测序正确后，将该融合片段利用双酶切连接到质粒pMAK705， 构建第二敲除质粒，酶切验证正确后置于-20°C冰箱中保存备用。
6.电转化获得第一次双交换大肠杆菌
(1)按照上述步骤2的操作步骤制备BL21(DE3)感受态细胞。
(2)在冰上解冻BL21(DE3)感受态细胞，向管中添加1-10μL第一敲除质粒 pMAK-EM，与电转化仪样本池一起在冰上培育约5分钟。
(3)转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中。
(4)加载P1000，准备300μL LB或2xYT。
(5)对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆，25μFd，2.5千伏)。
(6)将电穿孔样品池中菌液立加入到300μL的LB培养基中，37℃，160 r/min振荡培养40分钟至1小时以复原。
(7)转移细胞至适当的选择培养基上培养。
(8)取100μL菌液涂布于含有氯霉素抗性的LB平板上，37℃过夜培养， 挑选重组子。从含氯霉素抗性平板上随机挑取若干单菌落，将细胞转移至装有 50μL无菌水的0.5ml管中，振荡使细胞分散；将管置于沸水加热5min使细胞 裂解、DNase变性；吸取1ul菌落做PCR验证，验证正确后进行下一步操作。
7、第一次双交换大肠杆菌的筛选
将上述步骤(8)获得的电转化大肠杆菌混合液涂布于含氯霉素和卡那霉素 的双抗LB培养基平板(Cm，25ug/ml;Km，50ug/ml)上，44℃过夜培养。从平板 上挑选出多个单菌落，转接到100ml的含Cm和Km的液体LB培养基中，30℃、 200rpm过夜培养到稳定期，再涂板筛选出单交换重组大肠杆菌；挑选出这些 重组子后过夜培养，再吸取0.1ml的过夜培养物转接到100ml的新鲜LB培养 基中，30℃、200rpm过夜培养，此操作重复2-3次；最后，将培养物涂布于含 Km的LB平板上，44℃、200rpm过夜培养；将挑选出的单克隆对应转接在氯 霉素抗性的LB平板上，44℃倒置培养，用以检测44℃时的氯霉素抗性，筛选 出在30℃和44℃培养条件下表型均为Kmr、Cms抗性(即具有卡那霉素抗性， 但不具有氯霉素抗性)的重组菌株，经PCR鉴定正确后，即获得整合有第一组 合序列的重组大肠杆菌，标记为BL3。
8、ClpP基因缺失大肠杆菌的获得
采用与步骤6相同的电转化方法，将上述步骤5获得的第二敲除质粒转入 至步骤7的标记为BL3的菌株中，即整合有第一组合序列的第一次双交换大肠 杆菌中，将转化后的大肠杆菌涂布于氯霉素抗性平板上，44℃过夜培养筛选出 单交换重组子；从平板上挑选出多个单菌落，转接到100ml的含Cm液体LB 培养基中，30℃、200rpm过夜培养到稳定期，重复该转接3-4次后，取传代的 细胞稀释后涂布于含8%-10%蔗糖的固体培养基上，筛选出KansacB序列被敲 除的双交换重组大肠杆菌，即最终的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)，标记 为BL4。
实施例2
1.ClpP基因缺失大肠杆菌的分子验证
(1)PCR检测
按照以下序列合成ClpP的特异性引物对P9和P10：
正向引物P9： CGGTAAAGCGTCTGATTT SEQ ID NO：13，
反向引物P10： GCACAGTTGCGCCTCTGGC SEQ ID NO：14。
挑取实施例1中步骤8中抗性平板筛选出的阳性菌落，转接于1ml含卡那 霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。取1μL菌液作为模板，首先以ClpP 的特异引物P9和P10进行PCR鉴定，再以实施例1中的引物P1和引物P4进 行PCR鉴定，以0.6%琼脂糖凝胶检测PCR产物。用野生型BL21(ED3)的菌 液作为模板，做为阴性对照。最后突变菌扩增得到3500bp左右的条带，证明已 得到ClpP敲除菌。
2.Southern blotting检测
为了进一步检测ClpP是否与宿主大肠杆菌染色体发生了同源重组，分别 提取未转化的菌株和实施例1中步骤8筛选出的标记为BL4的重组菌株的基因 组DNA，经特定的限制性酶切位点酶切后，以ClpP（SEQ ID NO：15）为探 针，进行Southern blotting分析。具体实验步骤如下：
(1)基因组DNA的提取
将实施例1步骤8获得的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)（即标记为 BL4的重组菌株）和野生型BL21(DE3)分别接种于LB液体培养基，37℃培 养36h至对数生长期，再采取试剂盒方法分别提取两种菌株的总DNA。以 琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测DNA浓度和质量。
(2)ClpP探针DNA片段的制备
提取重组菌和野生菌的基因组，作为PCR扩增的模板，建立PCR反应体 系：
将上述混合物充分混匀，按以下程序进行PCR扩增：
94℃变性5min，
94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环， 72℃继续延伸10min。
所得PCR扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测片段大小及质量， 并用试剂盒回收纯化，用于制备探针a或置于-20℃保存备用。
(3)探针的标记
应用Roche公司生产的地高辛DNA标记及检测试剂盒(DIG High Prirne DNA Labeling and Detection Starter kit I，Cat.No.1745832)进行DNA探针的标 记及检测。以非放射性的DIG-dUTP为底物，利用随机掺入法进DNA标记， 通过酶联免疫杂交的方法检测。步骤如下：
模板DNA变性：取16μL(10ng-3μg)作为标记反应模板的探针DNA，将 其置于PCR薄壁管中，于沸水中变性10min后，迅速置于混有少量NaCl的冰 上，使之迅速冷却。然后瞬时离心2-5sec，使模板DNA聚于管底；
标记反应：首先混匀DIG-High Prime(vial1)，再加4μL该试剂于变性后的 模板DNA中，混匀后，4℃瞬时离心，37℃温育16-20h；
终止反应：向反应体系中加2μL0.2M EDTA(pH8.0)，终止反应，完成标 记反应。探针贮存于-20℃。
(4)基因组DNA酶切与电泳
根据总DNA的浓度建立大肠杆菌基因组DNA的HindIII酶切反应体系， 置于37℃中消化5h至酶切反应完全，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测DNA 是否完全酶切。若酶切反应不完全，可适当延长消化时间。基因组DNA以HindIII 完全酶切后以80V的电压在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳2.5h。
(5)DNA从琼脂糖凝胶向尼龙膜转移：
切去凝胶右下角，做好标记。用蒸馏水漂洗凝胶；
将凝胶浸于0.25M HCl中轻摇10min，而后更换0.25M HC1再摇10min；
将凝胶置于数倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中，变性2次，每 次20min，变性期间不断轻摇；
将凝胶转入中和液(1M Tris-HCl，1.5M NaCl，pH8.0)中作用2×30min， 室温下轻轻摇动；
将尼龙膜用中和液快速浸润后，准确放置在相同大小的凝胶背面(点样孔朝 下)。在尼龙膜上放置三张浸润过的滤纸，滤纸上放置干净的纸巾，纸巾上压上 500-1000g的重物；
作用16h后将膜取下，紫外灯下交联；
交联后的尼龙膜可直接用于Southern杂交或夹于滤纸中间，放在塑料袋中 封口保存。
(6)Southern杂交：
将尼龙膜放在杂交管中，按10ml/100cm2膜的量加入预热的预杂交液 (DIG Easy Hyb)，在42℃杂交箱中预杂交30min；
在预杂交临近结束时，将标记好的探针放在沸水浴中变性5min，然后立即 置于冰上，冷却后瞬时离心；
将变性的探针加入预热的预杂交液(DIG Easy Hyb)中，标记探针的终浓 度一般为5-25ng/ml迅速混匀，配制杂交液；
倒出预杂交液，按3.5ml/100cm2膜将3ml杂交液倒入杂交管中，37-42℃ 杂交24h。杂交结束后，倒出杂交液，于-20℃冻存。杂交液可重复使用。再 次使用前按变性探针的方法变性杂交液或者将杂交液于68℃变性l0min。
(7)严谨性洗脱
取出尼龙膜，置于一干净的盒中，室温下，2×SSC，0.1%SDS缓冲液洗脱 2×5min；
倒出溶液，加入足量的0.1×SSC，0.1%SDS缓冲液，于68℃水浴摇床中 洗脱2×15min。
(8)免疫检测：
杂交和严谨性洗膜后，倒出溶液，加入洗涤缓冲液(0.1mol/L马来酸，0.15 mol/L NaCl，pH7.5，0.3%(v/v)吐温20)中漂洗1-5min；
倒出溶液，加入100ml封闭缓冲液(马来酸缓冲液稀释l0X封闭溶液：10× Blocking solution，现配现用)，轻微振荡30min；
按1:5000(150mU/ml)将抗体(Anti-Digoxigenin-AP)加入封闭溶液中配制成 抗体溶液，倒出溶液，加入20ml抗体溶液，轻微振荡30min；
倒出溶液，加入100ml洗涤缓冲液，轻微振荡，漂洗2×15min；
倒出溶液，加入20ml检测缓冲液(0.1mol/LTris-HCI，0.1mol/L NaCl， pH9.5)，平衡1min；
将200μL显色底物溶液(NBT/BCIP stock)加入至10ml检测缓冲液中配制 成显色溶液，取出尼龙膜，放在尽可能小的容器中，加入10ml新配制的显色 溶液，暗处静置反应；
终止反应：当有信号出现后，用50ml双蒸水或者TE缓冲液洗膜，以终止 显色。
以ClpP全长基因为探针进行Southern杂交的检测结果如图3所示，M为 Marker，泳道1为野生型大肠杆菌，该泳道中出现了1条阳性带，泳道2为本 发明实施例1制备的ClpP基因缺失大肠杆菌，该泳道中没有条带。表明突变菌 的基因组中不存在ClpP基因，该基因被成功敲除。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。