一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103239479 B (45)授权公告日 2014.07.02 CN 103239479 B (21)申请号 201310087025.5 (22)申请日 2013.03.19 C12N 5/09(2010.01) C12N 5/095(2010.01) (73)专利权人 邱启裕 地址 加拿大魁比克省圣洛朗市玛丽斯巴斯 蒂街区 2191 号 (72)发明人 邱启裕 全欣鑫 (74)专利代理机构 北京市盈科律师事务所 11344 代理人 储涛 CN 101469320 A,2009.07.01, JP 2005110601 A,2005.04.28, CN 18617。

2、86 A,2006.11.15, 张淑娟等 . 皮肤鳞癌动物模型构建 .昆明 医学院学报 .2009, 第 30 卷 ( 第 3B 期 ), (54) 发明名称 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细 胞的动物模型建立方法 (57) 摘要 本发明涉及一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞 癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法， 包括 ： 将收 集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬 液， 分离出 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细 胞群， 再和1x106人原代成纤维细胞， 1x10 6人原代 内皮细胞悬混在基质胶中， 再将其注射至经人性 化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中。本发明的为进。

3、 一步研究人皮肤原发性 SCC 肿瘤的分子生物学机 制成为可能。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 董海鹏 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103239479 B CN 103239479 B 1/1 页 2 1. 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法， 包括 ： 步骤一， 将收集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬液， 并用多种细胞表面 标志物标记肿瘤细胞 ； 步骤二， 将肿瘤细胞进一步和 1x106人原代成纤维细。

4、胞， 1x106人原代内皮细胞悬混在 基质胶中 ； 步骤三， 将步骤二中的悬混液注射至经人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中， 具体为 ： 在移植 SCC 细胞前 14 天， 在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶两片， 可溶性泡沫凝胶的单片尺 寸为0.50.5cm,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶Matrigel100ul,其中悬混有1x106人 原代成纤维细胞和 1x106人原代内皮细胞 , 闭合创口， 正常饲养两周以形成利于移植人皮 肤原发性 SCC 细胞的微环境。 。 2. 根据权利要求 1 所述的人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立 方法， 其特征在于 ： 步骤一执行完毕后， 从肿瘤细。

5、胞中分离出 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+ 肿瘤干细胞群， 并将该肝细胞群用于执行步骤二和步骤三。 权 利 要 求 书 CN 103239479 B 2 1/4 页 3 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型 建立方法 技术领域 0001 本发明涉及一种肿瘤干细胞动物模型的建立方法， 特别是涉及一种人原发性皮肤 鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法。 背景技术 0002 尽管肿瘤的分子水平发病机理和癌症的诊断治疗研究已经取得了很大进展， 癌症 的死亡率仍然很高， 而且仍然缺乏有效的治愈方法。手术， 放射治疗和全身治疗， 如化疗或 激素治疗的传统方法， 旨。

6、在消除或杀死快速分裂的癌细胞。这些方法在临床上都具有局限 性。所有这些传统的治疗只对早期或非转移肿瘤有效， 却对已转移的肿瘤束手无策。 0003 在过去的二三十年中， 肿瘤干细胞 （CSC） 的概念渐渐被愈来愈多的研究所证实， 目 前报道已有多种类型肿瘤分离出 CSC， 包括生殖细胞癌， 白血病和多种实体肿瘤， 比如乳腺 癌， 脑癌， 结肠癌， 肝癌， 胰腺癌， 卵巢癌等。 0004 CSC肿瘤模型认为， 癌症是由不同层次分化和增殖的细胞组成。 肿瘤组织中存在数 量稀少的癌细胞亚群， 在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色， 具有自我更新、 增殖和分化的 潜能， 虽然数量少， 却在肿瘤的发生、 发展。

7、、 复发和转移中起着重要作用， 被称为肿瘤干细胞 或肿瘤启动细胞 （TIC） 。 0005 肿瘤干细胞通过自我更新和无限增值维持着肿瘤细胞群的生命力 ； 肿瘤干细胞的 运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能 ； 肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具 有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感， 因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗 方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。能够自我更新和长期重建肿瘤。进一步研 究肿瘤干细胞的分子生物学特性及其维持肿瘤生成、 转移的机制， 开发针对肿瘤干细胞的 药物以及治疗方法对于癌症的临床治疗具有重要的意义。 0006 尽管这二三十年对一些肿瘤类型的 SCS 。

8、细胞群的研究如火如荼， 但是， 目前对于 人的皮肤鳞状上皮细胞癌 （SCC） 的 SCS 群研究甚少。已报道的从头颈部鳞状上皮细胞癌细 胞株中分离出的 SP（side population） 细胞， 口腔粘膜鳞状上皮细胞癌细胞株的 CD44+ 细 胞， ALDH1+ 细胞， 具有致瘤性强、 耐药性等类似 SCS 的特质， 但这些研究均基于肿瘤细胞株 而非原发性肿瘤。人皮肤原发性鳞状上皮细胞癌分离的 CD45+CD133+细胞虽然有富集肿瘤 干细胞的特征， 但细胞群的纯度低， 没有有效排除肿瘤组织中的成纤维细胞和内皮细胞， 无 法进一步研究其特异表达的基因谱， 小鼠致瘤成功率不高， 特异性亦成问。

9、题。 现在的研究已 公认人肿瘤周围的微环境， 包括成纤维细胞和内皮细胞在内等多种间质细胞及新生的毛细 血管对于肿瘤的发生和转移有着至关重要的作用， 本专利以此为基点， 在小鼠体内模仿人 体内部肿瘤的微环境从而建立人皮肤原发性鳞状上皮细胞癌及其肿瘤干细胞的老鼠模型。 发明内容 0007 为解决上述问题， 本发明提供一种有效移植原发性皮肤鳞状上皮细胞癌细胞及其 说 明 书 CN 103239479 B 3 2/4 页 4 肿瘤干细胞至裸鼠皮下的方法， 此动物模型的建立使进一步研究人皮肤原发性 SCC 肿瘤的 分子生物学机制成为可能。 0008 为实现上述目的， 本发明所采用以下技术方案 ： 000。

10、9 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法， 包括 ： 0010 步骤一， 将收集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬液， 并用多种细胞 表面标志物标记肿瘤细胞 ； 0011 步骤二， 将肿瘤细胞进一步和 1x106人原代成纤维细胞， 1x106人原代内皮细胞悬 混在基质胶中 ； 0012 步骤三， 将步骤二中的悬混液注射至经人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中。 0013 按 上 述 方 案，步 骤 一 执 行 完 毕 后，从 肿 瘤 细 胞 中 分 离 出 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群， 并将该干细胞群用于执行步骤二和步骤三。 001。

11、4 按上述方案， 所述人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境的建立方法 , 包括 ： 0015 在移植 SCC 细胞前 14 天， 在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶 2 片， 可溶性泡沫凝胶 尺寸为0.50.5cm,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶Matrigel100ul,其中悬混有1x106 人原代成纤维细胞和 1x106人原代内皮细胞 , 闭合创口正常饲养两周以形成利于移植人皮 肤原发性 SCC 细胞的微环境。 0016 本发明有益效果在于 ： 0017 1） 通过人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境有效并高效移植人皮肤原发性 SCC 肿 瘤致裸鼠皮下。此动物模型的建立使进一步研究人皮肤原发性 SCC 肿瘤。

12、的分子生物学机 制成为可能。建立移植人皮肤原发性 SCC 肿瘤裸鼠致瘤模型中， 首先人性化裸鼠皮下致 瘤部位的微环境 ： 在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶 , 并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶 （Matrigel） , 基质胶 （Matrigel） 是从富含胞外基质蛋白的 EHS 小鼠肿瘤中分离出基底膜 基质， 其主要成分由层粘连蛋白， 型胶原， 巢蛋白， 硫酸肝素糖蛋白等组成， 还包含生长因 子和基质金属蛋白酶等， 这些成分均有利于促进成纤维细胞和内皮细胞等间质细胞的生长 和分化， 以及新生毛细血管的形成。同时加入 1x106人原代成纤维细胞和 1x106人原代内皮 细胞， 闭合创口饲养两周， 以。

13、形成利于移植人皮肤原发性 SCC 细胞的微环境。 0018 2) 0019 首次使用悬混基质胶和两种间质细胞 （人成纤维细胞和人内皮细胞） 作为人性化 裸鼠皮下致瘤微环境的方法， 首次在肿瘤致瘤注射时使用混合两种间质细胞与人 SCC 肿瘤 细胞或肿瘤干细胞的基质胶悬液， 使建立人皮肤鳞状上皮细胞癌小鼠模型成为可能， 并且 提高了人 SCC 致瘤率， 从最低需要 106级的 SCC 肿瘤细胞降至 105级 . 0020 3） 通过多种细胞表面抗原标记筛选和流式细胞仪分选 （FACS Sorting） 分离出 高纯度 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群， 移植人性化裸。

14、鼠皮下建立肿瘤干细胞 动物模型， 最低可以 100 个 SCC 肿瘤干细胞致瘤。此方法采用四种 CD 表面抗原的阴性筛 选， 可极大纯化 SCC 肿瘤干细胞群， 尽有可能的去除肿瘤组织中各种肿瘤间质细胞， 流式 细胞仪分析结果显示 99-100% 细胞为皮肤鳞状上皮细胞 （图 1C） 。此高纯度的人 SCC 肿 瘤干细胞群在本专利的裸鼠致瘤模型中致瘤率高出 SCC 肿瘤细胞 339 倍。此模型使研究 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞生物学特性及信号传导通路成为可能， 并提供靶向 性药物筛选治疗人原发性 SCC 肿瘤干细胞的体内实验的模型， 对进一步研发靶向性治疗人。

15、 说 明 书 CN 103239479 B 4 3/4 页 5 SCC 肿瘤干细胞奠定了基础。 附图说明 0021 图 1 ： 流式细胞仪分选 （FACS Sorting） 与多种细胞表面抗原标记鉴定和分离高纯 度CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群， 其中图A ： .流式细胞仪分选 （FACS Sorting） 方法二维位图示意图， 红色方框显示分选细胞为 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+， 左边为同型 PE 荧光阴性对照 ； 图 B. 流式细胞仪分选后 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群的纯 度检测结果图， 二维。

16、位图显示 CD133 阳性细胞纯度为 94.8%。X 轴为 CD24-FITC 荧光， Y 轴 为 CD133-PE 荧光 ； 图 C. 用细胞角蛋白 （潘） 抗体 （识别所有的基本的细胞角蛋白的抗体鸡 尾酒组合） 标记的 CD133+和 CD133- 细胞， 流式细胞仪分析显示 99-100% 的 CD133+细胞为潘 抗体阳性， 说明流式细胞仪分选后CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群为鳞状上皮细 胞单一群体。左部图为细胞分门为 CD133+( 上， 白色方框 ) 和 CD133-( 下， 白色方框 )， X 轴 为 CD24-APC/Cy7; 右部图细胞来自 。

17、CD133+分门细胞 （左部图上方白色方框） ， X 轴为潘抗体 (PAN)Y 轴为 CD133-PE， 左边白色方框为潘抗体阴性细胞分门， 右边白色方框为潘抗体阳性 细胞分门 ； 0022 图 2 ： 辐照 NIH3T3 饲养层细胞上进行无血清 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+干细胞 培养 . 左上图为人正常角质上皮细胞在 NIH3T3 饲养层细胞上培养， 只形成单层细胞群 ; 左 下图为人皮肤鳞状上皮细胞癌 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+干细胞在 NIH3T3 饲养层细胞 上无血清培养， 形成肿瘤干细胞球 （Sphere） ; 右边上下二图分别为左。

18、下图里上、 下方框的 肿瘤干细胞球的放大图 ； 0023 图 3 ： 体外肿瘤干细胞球形成和裸鼠体内移植瘤试验检验显示此 CD133+肿瘤干细 胞亚群具有肿瘤干细胞样特性， 人皮肤鳞状上皮细胞癌在本专利裸鼠模型的致瘤率为 67% （106移植细胞数） 至 33%（105移植细胞数） ， 而人皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞在本专利 裸鼠模型的致瘤率为 100% （106-105移植细胞数） ， 66.7% （104-103 移植细胞数） 和 33% （100 移植细胞数） 。A. 人皮肤鳞状上皮细胞癌细胞 （蓝色条柱） 的肿瘤干细胞球形成个数显著低 于 CD133 阳性肿瘤干细胞 （绿色条柱） 的。

19、肿瘤干细胞球形成个数。B.CD133+肿瘤干细胞 （蓝 色条柱） 裸鼠致瘤率显著高于皮肤鳞状上皮细胞癌总体肿瘤细胞 （绿色条柱） 。 具体实施方式 0024 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不 用于限制本发明。 0025 收集新鲜临床病人皮肤鳞状上皮细胞癌样本， 立即用手术刀和剪刀尽量切碎肿瘤 成1-2mm2的碎块， 并在200Unit/ml胶原酶III和50U/ml分离酶中以37孵育30分钟,用 GentleMACS 组织分离器 (Miltenyi-Biotec。

20、 公司 )D 程序以进一步分离组织 , 常温下 300g 离心 5 分钟 , 弃去上清液 , 沉淀下的组织细胞团块继续用 5ml0.05% 胰蛋白酶在 37消化 5 分钟 , 并用 40m 的细胞过滤网以除去组织残存 , 过滤分离成单细胞悬液。 0026 肿瘤单细胞悬液在 4下 300g 离心 10 分钟， 弃去上清液， 用 FACS 液 （含有 5%FBS 的 PBS 液） 洗一次， 复悬于 FACS 液中。加入 10g/ml 浓度的多种细胞表面抗原 CD133/1(A 说 明 书 CN 103239479 B 5 4/4 页 6 C133)-PE(Miltenyi-Biotec公司),CD。

21、24-FITC(Biolegend公司),CD31-PE/Cy7(Biolegend 公司 ),CD61-APC(Invitrogen 公司 ), 和 CD45-APC/Cy7(Biolegend 公司 ) 以及 Fc 受体阻 断剂 (Miltenyi-Biotec 公司 ) 以阻断非特异性结合。 0027 在 4孵育 1 小时， 加入 1mlFACS 液洗涤一次， 4下 300g 离心 10 分钟， 弃去上 清液， 复悬于 FACS 液及加入 7AAD 以用于流式细胞仪分选 （FACS Sorting） 。用 BD 公司的 FACSAria-II 流式细胞分选仪分选， 首先选出 7AAD 阴。

22、性细胞为活细胞群， 再由此分选出 （gating） CD31-CD24- 细胞， 第三步从 CD31-CD24- 细胞中再分选出 （gating） CD45-CD61- 细 胞， 最后从 CD31-CD24-CD45-CD61- 细胞中分选出 CD133+ 和 CD133- 的细胞， 以此成功分离 出了 CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+ 肿瘤干细胞群 （图 1） 。 0028 肿瘤干细胞群进一步在辐照处理的 NIH3T3 饲养层细胞上进行无血清干细胞培 养 , 干细胞活性检测以及裸鼠体内移植瘤试验、 体外肿瘤干细胞球形成等检验显示此 CD133+ 肿瘤干细胞亚群具有肿瘤干细。

23、胞样特性 （图 2， 3） 。 0029 在移植人皮肤原发性 SCC 裸鼠致瘤模型的建立中， 首先人性化裸鼠皮下致瘤部位 的微环境 ： 在移植SCC细胞前14天， 在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶 （0.5cm0.5cm， 2） , 并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶 （Matrigel） 100ul, 再悬混有 1x106人原代成纤维细胞 和 1x106人原代内皮细胞。闭合创口， 正常饲养两周以形成利于移植人皮肤原发性 SCC 细 胞的微环境。两周后在相同部位注射悬混有人 SCC 肿瘤细胞 （从 106至 102） ， 1x106人原代 成纤维细胞和 1x106人原代内皮细胞的基质胶混合液。11 周。

24、后可根据肿瘤的形成和大小收 获肿瘤。此方法最低所需人 SCC 肿瘤细胞为 105（图 3B, 绿色条柱） 。 0030 用多种细胞表面标志物标记人皮肤原发性 SCC 肿瘤细胞， 用流式细胞仪分选 （FACS Sorting） 分离出CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群。 此方法采用表面抗原的 阴性筛选， 可极大纯化 SCC 肿瘤干细胞群， 尽有可能的去除肿瘤组织中各种肿瘤间质细胞， 流式细胞仪分析结果显示99-100%细胞为皮肤鳞状上皮细胞 （图1C） 。 此高纯度的人SCC肿 瘤干细胞群在本专利的裸鼠致瘤模型中致瘤率高出 SCC 肿瘤细胞 339 倍。 0031 注射肿瘤细胞时， 一并注射1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞的基 质胶 （Matrigel） 混合液。此步骤可进一步强化该部位人性化 SCC 致瘤的微环境。单独注 射 1x106人原代成纤维细胞虽然能 106人 SCC 肿瘤细胞致瘤， 但是却不能使高纯度人 SCC 肿 瘤干细胞群在裸鼠体内生成肿瘤， 即使用 106细胞数亦为 0 致瘤率。 说 明 书 CN 103239479 B 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103239479 B 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103239479 B 8 。