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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510241951.2 (22)申请日 2015.05.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104830887 A (43)申请公布日 2015.08.12 (73)专利权人 武汉华美生物工程有限公司 地址 430223 湖北省武汉市东湖开发区高 新大道818号高科医疗器械园B11号 (72)发明人 沈鹤霄华权高徐春雷马峰 (74)专利代理机构 北京华沛德权律师事务所 11302 代理人 房德权 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01。
2、) C12N 9/18(2006.01) (56)对比文件 CN 102533838 A,2012.07.04, CN 101724649 A,2010.06.09, CN 103421757 A,2013.12.04, JP H02265491 A,1990.10.30, JP H02265492 A,1990.10.30, CN 101113455 A,2008.01.30, 童芹等.Kil蛋白介导的大肠杆菌外泌表达 系统. 生物化学与生物物理学报 .2001,第33卷 (第5期),第537-541页. D. R. Wetmore等.The role of the pro- sequenc。
3、e in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. Moiecular Microbiology .1992,第6卷(第12期),第1593- 1604页. S. Wong等.Use of the Bacillus subtilis Subtilisin Signal Peptide for Efficient Secretion of TEM P-Lactamase during Growth. JOURNAL OF BACTERIOLOGY .198。
4、6,第168卷(第2期),第1005-1009页. 任晓冰等.口蹄疫病毒表位嵌合蛋白在枯草 芽胞杆菌中的分泌表达. 中国兽医科学 .2014, 第44卷(第3期),第287-292页. 审查员 润顺琪 (54)发明名称 一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其 构建方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种乙酰胆碱酯酶的分泌型 表达载体， 包括启动子、 表达标签、 结构基因和终 止子， 在启动子和表达标签之间连接芽孢杆菌 B16中性蛋白酶前体信号肽； 其构建方法为： 1)合 成含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽和6 his标签的基因片段； 克隆乙酰胆碱酯酶成熟 肽的基因片段； 2)通过SOE-。
5、PCR方法将所述的两 个基因片段连接， 得到含有芽孢杆菌B16中性蛋 白酶前体信号肽、 6his标签和乙酰胆碱酯酶成 熟肽基因片段的序列； 3)将得到的序列经双酶切 克隆到表达质粒上， 即得。 本发明的表达载体可 高效分泌表达乙酰胆碱酯酶， 表达产物的水溶性 高， 只需要简单纯化即可。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 CN 104830887 B 2018.07.03 CN 104830887 B 1.一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体在乙酰胆碱酯酶表达中的应用， 其特征在于： 方法为： 将等量的Kil表达载体和乙酰胆碱酯酶表达载体共转化宿主细胞， 在同时含有氨苄 青霉素和卡那霉素双抗性。
6、的LB培养基上培养， 经诱导、 浓缩、 纯化得到表达产物； 所述乙酰 胆碱酯酶表达载体包括启动子、 表达标签、 结构基因和终止子， 在启动子和表达标签之间连 接芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽， 所述芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽的核苷酸 序列为SEQ ID No.1第1-81位所示， 所述启动子为T7启动子， 所述表达标签为6his标签； 所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104830887 B 2 一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构建方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种表达载体， 具体涉及一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构。
7、 建方法和应用。 背景技术 0002 乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase， AchE)是神经系统的一种重要水解酶， 可 快速而高效地水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine)， 从而维持神经信号传导的正常进 行。 人AchE基因位于第7条染色体的长臂上， 其开放阅读框架(ORF)为一长约2.2kb的片段， AchE结构基因全长1845bp， 从第157位的起始密码子开始到2001位的终止密码子， 共编码 614个氨基酸， 除去前导肽(72bp)、 信号肽(63bp)与分子内伴侣(18bp)， 编码成熟肽的核苷 酸序列全长为1692bp， 因此， 经表达翻译可产生由5。
8、63个氨基酸组成人AchE单体。 0003 临床上有机磷农药中毒很常见， 其中毒机理为有机磷农药与神经系统的乙酰胆碱 酯酶结合， 形成磷酰化酶， 使其失去水解乙酰胆碱的能力， 造成乙酰胆碱的蓄积， 引起M样和 N样受体的过度兴奋， 最终导致呼吸衰竭而死亡， 通常的解毒剂为阿托品和2-PAM， 这两种解 毒剂都有较强的副作用， 都不是理想的解毒剂， 外源人乙酰胆碱酯酶， 给与机体后， 能够和 血中有机磷结合通过肾脏排出， 并可迅速缓解局部乙酰胆碱蓄积， 发挥解毒作用， 因此利用 生物高技术表达乙酰胆碱酯酶成为目前解毒剂研究的热点。 适量地补充外源性的人AchE, 对中和毒剂、 挽救生命具有重要临。
9、床价值。 同时， AchE还被广泛应用在识别和检测天然样品 中氨基甲酸酯类与有机磷类农药、 杀虫剂残留的生物传感器中。 近年来的研究发现， 人脑型 AchE在阿尔兹海默氏病即早老性痴呆症的发生中起着重要作用， 在体外它可用于治疗该病 的药物筛选。 因此， 通过基因工程技术来高效生产体内极微量存在的人脑型AchE以满足上 述研究与应用具有重要意义。 发明内容 0004 为解决上述技术问题， 本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构 建方法和应用。 0005 本发明通过以下技术方案实现： 0006 一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体， 包括启动子、 表达标签、 结构基因和终止 子， 在启动。
10、子和表达标签之间连接芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽， 所述芽孢杆菌B16 中性蛋白酶前体信号肽的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。 0007 进一步地， 所述启动子为T7启动子。 0008 进一步地， 所述表达标签为6his标签。 0009 上述表达载体的构建方法， 1)合成含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽和6 his标签的基因片段； 克隆乙酰胆碱酯酶成熟肽的基因片段； 2)通过SOE-PCR方法将步骤1) 所述的两个基因片段连接， 得到含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽、 6his标签和乙 酰胆碱酯酶成熟肽基因片段的序列； 3)将步骤2)得到的序列经双酶切克隆到表达质粒上。
11、， 说明书 1/4 页 3 CN 104830887 B 3 即得。 0010 进一步地， 所述表达质粒为pET21-a。 0011 上述表达载体在乙酰胆碱酯酶表达中的应用。 0012 进一步地， 上述的应用方法为： 将等量的Kil表达载体和乙酰胆碱酯酶表达载体共 转化宿主细胞， 在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的LB培养基上培养， 经诱导、 浓 缩、 纯化得到表达产物。 0013 进一步地， 所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。 0014 本发明提供的乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体， 以芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体 信号肽引导蛋白分泌表达， 在高效分泌表达乙酰胆碱酯酶基因的同时有效地。
12、提高了表达产 物的水溶性， 表达产物分泌到培养基中， 只需要简单纯化即可。 本发明的表达系统不仅仅局 限于乙酰胆碱酯酶基因的表达， 也为其他基因表达提供一个技术平台， 具有重要的应用价 值。 具体实施方式 0015 实施例1一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构建方法和应用 0016 (一)AChE成熟肽基因片段的克隆 0017 依据实验需要， 参考GeneBank中公开发表的人AChE基因序列， 设计了1对用于扩增 乙酰胆碱酯酶成熟肽片段的引物， CGCCTGAAGACCC CCG和CAGGTCTGAGCAGCGATCCT； 以18周龄 引产的胎儿大脑组织mRNA为模板， 经RT-PCR扩增。
13、出AChE成熟肽全长， 连接到pMD18-T载体， 转化大肠杆菌DH5 ， 蓝白斑筛选得到重组子， 经酶切鉴定正确后再进行序列测定， 最终得到 AChE成熟肽基因片段， 如序列2所示。 0018 (二)乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体的构建 0019 通过基因合成方式合成含有 “芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽、 在信号肽序列 3 端连接6His标签、 在6His标签3 端连接编码AChE基因成熟肽片段的5 端的20个碱 基” 的序列， 然后采用SOE-PCR方法将AChE成熟肽基因片段与其进行连接。 方法为将PCR程序 如下： 首先在常规PCR反应体系(50 L)中加入等摩尔信号肽和成熟肽基因。
14、， 94预变性 5min， 9445s， 681min， 7245s， 共进行10个循环， 72延伸10min； 以此产物为模板， 以 分别含酶切位点EcoR I和Hind III的一对引物引物1和引物2进行二次PCR， 94预变性 5min， 9445s， 601min， 7245s， 共进行30个循环， 最后72延伸10min。 引物1： GCTAGAATTCGTGGGTTTAGGTAAGAAATT， 引物2： GGCCAAGCTTCAGGTCTGAGCAGCGATCT。 0020 将回收的目的片段及表达载体pET21a， 经限制性内切酶EcoR I和Hind III， 在37 水浴同时分。
15、别酶切4小时， 用T4DNA连接酶将酶切后的目的基因与表达载体pET21a按体积 比4:1进行连接， 1612小时， 将连接产物10 L与200 L感受态菌DH5 混匀， 将转化菌液平铺 于含氨苄青霉素100 g/mL的琼脂板表面， 37倒置培养12小时以上。 得到AChE表达载体。 0021 (三)Kil基因表达载体的构建 0022 以大肠杆菌基因组序列为模板， 设计一对含酶切位点的引物扩增Kil基因编码区 序列， 引物序列： A， 5 GCCGAATTCTTATAAGGATCGAGATGAGGA AACGTTTCTTT 3 和B， 5 GCCGGATCCGCAGAAAAAAAGGATCTC。
16、AAG AAGA 3 ， 该基因和pUC18载体一起同时双酶切， T4DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌感受态细胞， 挑选克隆鉴定后提取质粒备用。 说明书 2/4 页 4 CN 104830887 B 4 0023 (四)与Kil表达载体共转化大肠杆菌 0024 将等量的Kil表达载体和AChE表达载体共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞， 在 同时含有60mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的卡那霉素双抗性的LB培养基上筛选单菌落。 筛选 得到的单克隆菌落， 37过夜培养后， 按照1:100的接菌量接入同时含有60mg/L的氨苄青霉 素和50mg/L的卡那霉素双抗性液体LB培养基中， 37。
17、225rpm培养2.5小时， 加入适量IPTG进 行诱导， 在T7启动子的启动下， 开始表达乙酰胆碱酯酶蛋白。 取诱导后的培养液离心取上 清， 超滤管浓缩后得到表达产物。 0025 乙酰胆碱酯酶在共表达的Kil蛋白的作用下， 可以穿透细胞膜和胞外膜， 分泌到培 养基中， 完成分泌表达。 0026 (五)表达产物纯化 0027 将浓缩后的表达产物上镍离子亲和柱纯化， 利用亲和层析一步纯化即可以得到具 有生物活性的重组蛋白。 具体方法为： 用去离子水洗涤， 洗去20的乙醇、 除尽基质中的空 气， 5柱体积的离子缓冲液(50mM NiSO4)挂柱， 5倍柱体积的去离子水洗涤， 去游离的Ni离 子； 。
18、10柱体积的结合缓冲液(20mM Tris-HCl， 0.5M NaCl， 5mM咪唑， pH8.0)平衡； 上样： 20 柱体积的洗液(20mM Tris-HCl， 0.5M NaCl， 20-50mM咪唑， pH8.0)洗涤， 至无蛋白检出， 收 集流出液； 然后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl， 0.5M NaCl， 5001000mM咪唑， pH8.0)洗脱， 每次1ml， 检测洗脱液中蛋白浓度并收集洗脱缓冲液。 0028 (六)表达蛋白的检测 0029 将洗脱的产物按照下表操作进行酶活性的检测。 0030 a.乙酰胆碱酯酶测定校正曲线绘制， 取试管6支， 按表1-1操作。 0。
19、031 表1-1 胆碱酯酶测定校正曲线绘制 0032 0033 混匀， 静置5min后， 用540nm波长比色， 以空白管调零， 读取各管吸光度， 用相应的 酶活力单位绘制校正曲线。 0034 b.乙酰胆碱酯酶测定按表1-2操作。 0035 表1-2 乙酰胆碱酯酶测定操作步骤 说明书 3/4 页 5 CN 104830887 B 5 0036 0037 混匀， 离心沉淀， 取上清液比色， 用540nm波长， 以空白管调零， 读取对照管和测定 管吸光度， 将对照管和测定管吸光度之差查校正曲线， 求得酶活力单位。 0038 单位定义1ml酶液中的胆碱酯酶在37与底物作用1h， 每水解1 mol的乙。
20、酰胆碱为 1个酶活力单位。 测定酶活为285U， 酶活性较高。 0039 最后所应说明的是， 以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照实例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖 在本发明的权利要求范围当中。 说明书 4/4 页 6 CN 104830887 B 6 0001SEQUENCE LISTING 0002 武汉华美生物工程有限公司 0003 一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构建方法和应用 0004 2 0005 PatentIn version。
21、 3.3 0006 1 0007 123 0008 DNA 0009 Bacillus sp. B16 0010 1 0011gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgccgctt cctttatgag tttaaccatc 60 0012agtcttccgg gtgttcaggc ccatcatcat catcatcatc atcgcctgaa gacccccggg 120 0013ggc 123 0014 2 0015 1689 0016 DNA 0017 human 0018 2 0019cgcctgaaga cccccggggg ccctgtctct g。
22、ctttcctgg gcatcccctt tgcggagcca 60 0020cccatgggac cccgtcgctt tctgccaccg gagcccaagc agccttggtc aggggtggta 120 0021gacgctacaa ccttccagag tgtctgctac caatatgtgg acaccctata cccaggtttt 180 0022gagggcaccg agatgtggaa ccccaaccgt gagctgagcg aggactgcct gtacctcaac 240 0023gtgtggacac catacccccg gcctacatcc cccacc。
23、cctg tcctcgtctg gatctatggg 300 0024ggtggcttct acagtggggc ctcctccttg gacgtgtacg atggccgctt cttggtacag 360 0025gccgagagga ctgtgctggt gtccatgaac taccgggtgg gagcctttgg cttcctggcc 420 0026ctgccgggga gccgagaggc cccgggcaat gtgggtctcc tggatcagag gctggccctg 480 0027cagtgggtgc aggagaacgt ggcagccttc gggggtgacc。
24、 cgacatcagt gacgctgttt 540 0028ggggagagcg cgggagccgc ctcggtgggc atgcacctgc tgtccccgcc cagccggggc 600 0029ctgttccaca gggccgtgct gcagagcggt gcccccaatg gaccctgggc cacggtgggc 660 0030atgggagagg cccgtcgcag ggccacgcag ctggcccacc ttgtgggctg tcctccaggc 720 0031ggcactggtg ggaatgacac agagctggta gcctgccttc gga。
25、cacgacc agcgcaggtc 780 0032ctggtgaacc acgaatggca cgtgctgcct caagaaagcg tcttccggtt ctccttcgtg 840 0033cctgtggtag atggagactt cctcagtgac accccagagg ccctcatcaa cgcgggagac 900 0034ttccacggcc tgcaggtgct ggtgggtgtg gtgaaggatg agggctcgta ttttctggtt 960 0035tacggggccc caggcttcag caaagacaac gagtctctca tcagccg。
26、ggc cgagttcctg 1020 0036gccggggtgc gggtcggggt tccccaggta agtgacctgg cagccgaggc tgtggtcctg 1080 0037cattacacag actggctgca tcccgaggac ccggcacgcc tgagggaggc cctgagcgat 1140 0038gtggtgggcg accacaatgt cgtgtgcccc gtggcccagc tggctgggcg actggctgcc 1200 0039cagggtgccc gggtctacgc ctacgtcttt gaacaccgtg cttccac。
27、gct ctcctggccc 1260 0040ctgtggatgg gggtgcccca cggctacgag atcgagttca tctttgggat ccccctggac 1320 0041ccctctcgaa actacacggc agaggagaaa atcttcgccc agcgactgat gcgatactgg 1380 序列表 1/2 页 7 CN 104830887 B 7 0042gccaactttg cccgcacagg ggatcccaat gagccccgag accccaaggc cccacaatgg 1440 0043cccccgtaca cggcgggggc 。
28、tcagcagtac gttagtctgg acctgcggcc gctggaggtg 1500 0044cggcgggggc tgcgcgccca ggcctgcgcc ttctggaacc gcttcctccc caaattgctc 1560 0045agcgccaccg acacgctcga cgaggcggag cgccagtgga aggccgagtt ccaccgctgg 1620 0046agctcctaca tggtgcactg gaagaaccag ttcgaccact acagcaagca ggatcgctgc 1680 0047tcagacctg 1689 序列表 2/2 页 8 CN 104830887 B 8 。