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一种水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子及其应用.pdf

  • 上传人:宁***
  • 文档编号:8689813
  • 上传时间:2020-12-02
  • 格式:PDF
  • 页数:9
  • 大小:982.33KB
  • 摘要
    申请专利号:

    CN201010141029.3

    申请日:

    20100406

    公开号:

    CN101880665B

    公开日:

    20120201

    当前法律状态:

    有效性:

    失效

    法律详情:

    IPC分类号:

    C12N15/113,A01H5/00

    主分类号:

    C12N15/113,A01H5/00

    申请人:

    浙江大学

    发明人:

    吴平,丁沃娜,莫肖蓉,俞志明

    地址:

    310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号

    优先权:

    CN201010141029A

    专利代理机构:

    杭州中成专利事务所有限公司

    代理人:

    金祺

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    内容摘要

    本发明公开了一种水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子,该启动子为SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了上述水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的用途:用于构建转基因水稻;该启动子能用于启动下游编码基因在水稻根毛细胞中的特异表达。

    权利要求书

    1.一种水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子,其特征在于:该启动子为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。 2.如权利要求1所述的水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的用途:用于构建转基因水稻。 3.根据权利要求2所述的水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的用途:启动下游编码基因在水稻根毛细胞中的特异表达。

    说明书

    技术领域

    本发明属于植物基因工程领域。具体的说,本发明涉及克隆水稻OsRHL1(rice root hairless 1)基因编码区的上游启动子序列,以及该上游启动子的用途。

    背景技术

    根系是植物吸收水分、养分的重要器官,而根毛又是植物根系功能区段生理活性界面 的重要组成部分。植物根尖的结构包括四部分:根冠、分生区、伸长区和成熟区。在分生 区根毛细胞与非根毛细胞开始出现形态差异;到了伸长区根毛开始形成;在成熟区生毛细 胞成熟并完全分化,根毛生长并达到成熟(Dolan et al.,1993)。根毛是根表皮细胞上的一些 管状突起,根毛发育过程大致可以划分为表皮细胞特异化、起始、尖端生长和成熟4个阶 段(Gilroy and Jones,2000)。

    根毛的存在可有效扩大表皮细胞与根际土壤的接触面积,有利于提高根系吸收土壤中 水分和矿质营养的效率以及与土壤微生物的互作(Grierson and Schiefelbein,2002)。 近年来植物根毛发生发育及养分吸收的研究取得了较大的进展。目前的研究主要是基于双 子叶模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的根毛相关突变体展开的,而以水稻(Oryza sativa)为模式植物的禾本科作物的根毛发生机制研究较少。

    采用遗传转化技术是利用优良基因(尤其是外源基因)改良物种的一条重要途径。通 过遗传转化技术改良物种除需要优良基因资源外,还需要适用于目标基因在最佳状态下发 挥功能的启动子。国际国内可供选择用于农作物性状改良的功能基因的数量逐渐在增加。 但是与之相比,可供选择的启动子数量和种类却非常有限,尤其缺乏适用于改良农作物性 状的启动子。启动子已经成为采用遗传转化技术改良物种的瓶颈之一。目前国际国内用于 农作物遗传转化的启动子主要是玉米泛素(ubiquitin)基因启动子、水稻肌动蛋白(actin) 基因启动子、病毒35S等组成型表达启动子。它们调控目标基因在所有组织中都表达,而 且没有时空限制。用这些启动子调控目标基因表达时,由于大量目标蛋白在不需要的细胞 中出现,往往容易造成物种形态和生理功能异常。虽然国际上也有少量特异启动子分离克 隆的报道,但是涉及的农作物的种类很少,数量非常有限,而且我们不具有知识产权,将 受限于生产应用。

    OsRHL1(Wona Ding et al.,2009)在专利申请号为200910095888.0的发明《一种水稻 根毛控制基因OsRH L1》曾明确告知该基因编码的蛋白在根毛发育调控上的功能。

    上文中的参考文件具体如下:

    1、Dolan,L.,Janmaat,K.,Willemsen,V.,Linstead,P.,Poethig,S.,Roberts,K.,Scheres,B. (1993).拟南芥的根细胞组织体系。《发育》119:71-84

    2、Gilroy,S.,and Jones,D.L.(2000).从根毛发育的形态到养分吸收的功能。《植物科学 发展趋势》5,56-60.

    3、Grierson,C.,and Schiefelbein,J.(2002).根毛。《拟南芥》

    4、Hiei,Y.,Ohta,S.,Komari,T.and Kumashiro,T.(1994)通过农杆菌介导的水稻高效转 化系统以及T-DNA边界序列的分析。《植物杂志》6,271-282.

    5、Terada R.and Shimamoto K.(1990).CaMV35S-GUS基因在转基因水稻中的表达。《分子 与普通遗传学》220:389-392.

    6、Wona Ding,Zhiming Yu1,Yanli Tong,Wei Huang,Hanmin Chen,Ping Wu(2009).一 个水稻bHLH转录因子调控根毛发育。《细胞研究》1309-1311.

    发明内容

    本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子,利用 该启动子(OsRHL1基因启动子)能进行高效的根毛细胞表达的植物转化。

    为了解决上述技术问题,本发明提供一种水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子,该 启动子为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

    作为本发明的水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的改进:启动子还包括在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等 位基因和衍生物。

    作为本发明的水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的进一步改进:启动子还包括是 在高严谨条件下可与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交、且具有相同功能的核苷酸序列。

    本发明还同时公开了上述水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的用途:用于构建转 基因水稻。

    作为本发明的水稻根毛发育控制基因OsRHL1的启动子的用途的改进:该启动子的功 能在于能启动下游编码基因在水稻根毛细胞中的特异表达。

    本发明的启动子是水稻根毛发育调控基因OsRHL1的基因编码区的上游序列。通过构 建含有该启动子的植物表达载体,将其转化到转基因水稻中,对转基因材料的普通叶、剑 叶、花和根等多种不同组织进行了GUS组织化学染色检测,结果证实了该启动子在根毛 细胞中的特异性表达。根毛是根系吸收土壤中水分和矿质营养以及与土壤微生物互作的重 要组织部位。通过遗传转化技术改良物种除需要优良基因资源外,还需要适用于目标基因 在最佳状态下发挥功能的启动子。水稻根毛特异性启动子可应用于农作物养分吸收改良, 这对于提高作物产量及降低施肥造成的污染都具有较大实际意义。

    利用本发明的启动子构建转基因水稻,具有如下优点:可以启动下游相应基因特异性 地高效表达于根毛,而不启动该相应基因在其它部位的表达。根毛是植物吸收土壤中水分 和矿质营养的重要组织,对根毛这一特异组织进行改良的方法可以应用于未来改良根毛对 土壤中养分的吸收能力,同时又不会对其它器官组织产生不利的影响。在本发明中我们在 OsRHL1启动子的下游摆了一个报告基因(GUS),由于该GUS基因在表达的部位可被染成 蓝色,所以可以直观显示出启动子的组织特异性。而该报告基因(GUS)如果接在传统的 组成型表达启动子(如35S启动子等)下时,则会调控GUS基因在茎、叶、花、种子等所 有器官中都表达,并且在根中的表达也不会仅局限于根毛组织(Terada and Shimamoto 1990)。用这些组成型表达启动子调控目标基因表达时,由于大量目标蛋白在不需要的细 胞中出现,往往容易造成物种形态和生理功能异常。而本发明的应用旨在将来启动子下游 接上特定的养分吸收基因,使之特异增强表达于根毛中,这种仅针对根毛的靶向性遗传改 良具有很大的应用价值。

    附图说明

    下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

    图1是pBI101.1-GUS plus载体示意图。

    图2是OsRHL1启动子融合GUS基因转基因材料的染色结果;

    a、主根分生区以上;b,根毛区;c,根毛;d,根毛区的石蜡纵切图;bar=100μm (b)bars=40μm(c,d)。

    具体实施方式

    本发明以下实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology,和J.Sambrook等编写 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。

    实施例1、

    根据OsRHL1基因的起始密码子ATG前面的序列设计两端分别含HindIII和KpnI酶切 识别位点(下划线)的引物,以野生型Kasalath的根基因组DNA为模板,扩增出全长2443bp 的OsRHL1基因启动子,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

    引物序列如下:

    上游引物:AACGGTACCTGGCACTGATATTCTAATGGT

    下游引物:AACGTCGACGCTTAGCTTAGCTTAGCTGAAG

    利用LA Taq DNA Polymerase把整个启动子DNA序列扩增出来,PCR条件是94℃变 性4min,然后进入循环反应即94℃30s,50℃30s,72℃2.5min,循环数为30,最后 再延伸7min结束。PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳并割胶回收目的条带,连接pMD19-T 载体,连接产物热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,划板挑阳性单克隆测序。鉴定出的 正确克隆与实验室改造的pBI101.1-GUS plus载体(图1)分别用HindIII和KpnI双酶 切,回收后连接,连接产物热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,划板挑阳性单克隆。酶 切鉴定为阳性的单克隆菌液扩繁后抽质粒,电击转化入农杆菌EHA105感受态细胞。该农 杆菌菌株用于水稻转基因。

    pBI101.1-GUS plus载体改造方法具体如下:将pCAMBIA1305.1上的GUS plus序列 用PCR的方法扩增出,上游引物5’端头加了BamH I和Kpn I酶切接头,下游引物5’端头 加了Sac I酶切接头。PCR产物用BamH I和Sac I酶切后连入用相同酶切的pBI101.3中。 经过改造后的载体统一称为pBI101.1-GUS plus载体。其多克隆位点与GUS plus读码框之 间经测序鉴定。

    所用引物序列为:

    GUS plus-up  AACGGATCCACGGTACCATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTC

    GUS plus-low ACGGAGCTCTCACACGTGATGGTGATGGTGATGG。

    水稻愈伤经过预培养、农杆菌侵染、共培养、筛选具有卡那霉素抗性的愈伤、分化、 生根、练苗移栽,得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用 Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。获得的转基因苗后代用GUS染液染色后见 图2所示,表明OsRHL1基因启动子驱动的GUS在根的伸长区和成熟区的根毛中表达。

    由于根毛着生部位是在根的根毛区,所以在图2a中可见在根伸长区域以上才出现GUS (蓝色)的表达,进一步放大看到图2b及图2c中所示根毛中的GUS表达,从图2d的纵 向石蜡切片可以看到只有表皮的根毛细胞处有GUS表达,根内部的皮层细胞则没有表达。 虽然在石蜡切片的过程中伸展在外的根毛细胞已不是保留得很完整,但是根表皮细胞及内 部的皮层细胞均是完整的。根毛细胞与根部的其它细胞层之间GUS表达的差异是很明显 的。

    最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明 不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。

    序列表

    SEQ ID NO:1

    tggcactgat attctaatgg tgatcgaatg aataatcctc ttgctaattg tgattcacaa     60

    tatattttaa cagttcacag ttcactctct ctccaatgaa actctgaatc ttctgcaact    120

    gctgataact gatcacattt acactttcat cggatgccga atgactgcat taatcgatct    180

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    tggccagtat gcgcatgtgt gcacgcacac aaggcagcca tggattaaag gccaagctgc    300

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    一种 水稻 根毛 发育 控制 基因 OsRHL1 启动子 及其 应用
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