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1、(10)授权公告号 CN 101787396 B (45)授权公告日 2012.03.14 CN 101787396 B *CN101787396B* (21)申请号 201010136373.3 (22)申请日 2010.03.26 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 刘秋玲 赵虎 吕德坚 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 CN 101413030 A,2009.04.22, (54) 发明名称 荧光标。
2、记14个X染色体STR基因座复合扩增 检测系统 (57) 摘要 本发明公开一种 X-STR 基因座荧光标记 复合扩增体系及其应用， 该复合扩增体系共包 含 14 个 基 因 座 ： DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS6809、 DXS7424、 DXS6789、 DXS9898、 DXS7132、 GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、 DXS10074 和 DXS10079。本发明的 14 个 X-STR 基 因座是在一个复合扩增体系中同时扩增， 快速、 方 便， PCR 产物经遗传分析仪电泳， 结果自动分析， 能标准化、 国际化，。
3、 保证不同实验室数据比较的正 确性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李康琦 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 6 页 附图 2 页 CN 101787396 B1/1 页 2 1.一种X-STR基因座荧光标记检测试剂盒， 其特征在于， 包含检测14个基因座的引物， 所述的 14 个基因座为 DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS6809、 DXS7424、 DXS6789、 DXS9898、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS101、 DXS10075、 GATA31E08、。
4、 DXS10074 和 DXS10079 ； 所述引物序列 如 SEQ ID NO ： 1 28 所示。 2.根据权利要求1所述X-STR基因座荧光标记检测试剂盒， 其特征在于所述14个基因 座引物分别用 FAM、 HEX、 TAM 或 ROX 四种荧光素标记。 3. 根据权利要求 2 所述 X-STR 基因座荧光标记检测试剂盒， 其特征在于所述检测试 剂盒中， DXS7133、 DXS6801、 DXS981 和 DXS6809 相应的引物由 FAM 荧光素标记， DXS7424、 DXS6789、 DXS9898 和 DXS7132 相 应 的 引 物 由 HEX 荧 光 素 标 记， D。
5、XS165B12、 DXS101 和 DXS10075 相应的引物由 TAMRA 荧光素标记， GATA31E08、 DXS10074 和 DXS10079 相应的引物 由 ROX 荧光素标记。 4.权利要求13所述的任一X-STR基因座荧光标记检测试剂盒在姐妹亲缘关系和祖 母 - 孙女亲缘关系鉴定中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101787396 B1/7 页 3 荧光标记 14 个 X 染色体 STR 基因座复合扩增检测系统 技术领域 0001 本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记， 尤其涉及 X 染色体遗传标 记技术， 具体涉及一种 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系。
6、及其应用。 背景技术 0002 短串联重复序列 (short tandem repeats， 简称 STR) 是由 2 7 个碱基对作为核 心单位， 串联重复形成的一类微卫星 DNA 序列， 其片段可采用 PCR 技术扩增。STR 主要由于 核心重复单位数目的变化形成了 STR 基因位点的遗传多态性， 其等位基因可用银染、 荧光 标记和放射自显影等技术分型。人类基因组中， 平均每 6 10kb 就存在有一个 STR 基因位 点， 为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因位点的丰富来源。 0003 X 染色体是人类性染色体， X 染色体短串联重复 (X-chromosomal Short Tan。
7、dem Repeat， X-STR) 是性染色体上一类多态性遗传标记， 男性的 X-STR 以单倍型形式存在只能 从其母亲中得到， 且只能遗传给女儿， 因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有1个相同的 等位基因， 孙女 X-STR 基因座有 1 个等位基因与其祖母相同。X 染色体这种独特的遗传方 式， 使得 X-STR 在亲缘鉴定中有特殊的应用价值。 0004 在亲缘鉴定中， 有些没有父母双亲参与检测的特殊案件， 如 ： 姐妹认亲、 同父异母 的半同胞姐妹认亲、 隔代认亲 ( 祖母 - 孙女 ) 等， 用常染色体、 Y 染色体或线粒体的遗传标 记无法排除或认定， 此时只有依靠 X 染色体 S。
8、TR 才能起到直接排除或认定的作用。 0005 此外在有先天性缺陷的遗传病中， 可通过检测 X 染色体 STR 来诊断有无 X 染色体 多倍体、 X 染色体重复、 X-STR 重复序列长短等， 同时， X 染色体 STR 检测可应用于 X 连锁遗 传病、 X 染色体单亲二倍体、 X 染色体失活的亲源性等鉴定。从而为伴 X 染色体遗传病提供 产前诊断方法。 0006 因此， 可以通过分析 X 染色体上的 STR 基因座的等位基因分型来确定亲缘关系和 用于伴 X 染色体遗传病的产前诊断。 0007 X 染色体 STR 位点广泛存在真核细胞基因组中， 高度稳定且具有较高的遗传多态 性， 然而与常染色。
9、体和 Y 染色体 STR 相比， 迄今发现和应用的 X-STR 位点数量较少， 群体分 布、 突变率、 连锁平衡、 基因结构等方面的信息尚不够丰富， 在法医学、 医学等领域的应用受 限， 远不及其他 DNA 遗传标记广泛。 0008 X 染色体遗传标记的研究在国内还处于初期， 目前国际上商品化检测试剂盒仅有 德国 Argus X-8 和Argus X-12， 该类试剂盒在法医学应用实践中存在以下问 题 ： 0009 (1) 采用这类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难 ； 0010 (2) 这些 X-STR 基因位点都是基于中国群体以外的群体 ( 主要是白人群体 ) 资料 而开发的， 其中有些基因。
10、位点， 在中国群体的基因频率分布较差， 个人识别能力较低 ； 0011 (3) 国外商品化试剂盒价格昂贵。 0012 这些缺点限制了 X 染色体遗传标记在国内的应用， 不利于进一步在基层推广。 说 明 书 CN 101787396 B2/7 页 4 发明内容 0013 本发明的目的在于针对现有技术的不足， 提供一种适合于中国人群的， 可以快速、 方便针对常染色体 STR、 Y-STR 难以排除或认定亲缘关系的特殊检案 ( 姐妹认亲、 同父异母 的半同胸姐妹认亲、 隔代认亲等 ) 进行鉴定的 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系。 0014 本发明的另一个目的在于提供上述 X-STR 基因座荧。
11、光标记复合扩增体系在为伴 X 连锁遗传病、 X 染色体单亲二倍体、 X 染色体失活的亲源性鉴定等提供产前诊断， 以及姐妹 认亲、 同父异母的半姐妹认亲、 隔代认亲等亲缘鉴定中的应用。 0015 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的 ： 0016 一种 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系， 该复合扩增体系共包含 14 个基因座 ： DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS6809、 DXS7424、 DXS6789、 DXS9898、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS101、 DXS10075、 GATA31E08、 DXS10074 和 DXS1007。
12、9。 0017 本发明对上述 14 个 X-STR 基因座进行了研究， 表明这 14 个基因座在中国人群中 有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。 0018 一、 本发明复合扩增体系中 14 个基因座的选择 0019 (1) 位于同一连锁群内 0020 作为位于同一染色体的基因座， 必须考虑到连锁遗传的问题。各基因座位于同一 个连锁群之内， 呈连锁遗传， 便于以单倍型观察多态性。除 GATA31E08 外其余 13 个基因 座 DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS6809、 DXS7424、 DXS6789、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS101、。
13、 DXS10075、 DXS10074 和 DXS10079 均位于第二连锁群内， 应呈连锁遗传。 0021 本发明的 14 个基因座分布于同一染色体上不同的位置， 既有紧密连锁者， 也 有 遗 传 距 离 相 距 较 远 者。 紧 密 连 锁 的 DXS7132-DXS10075-DXS10074-DXS10079 ； DXS7133-DXS7424-DXS101和DXS6801-DXS6809-DXS6789。 它们分别位于Xq12、 Xq21和Xq22 区。 紧密连锁的基因座构成单倍型， 在亲缘鉴定中有利于分析亲代与子代之间的遗传关系。 0022 (2) 易于扩增 0023 除上述14个。
14、基因座外， 实验初期发明人还选择了另外一些位于X染色体第二连锁 群内的基因座， 如 ARA、 DXS6800、 DXS9905、 DXS7130、 DXS6797、 DXS9895 等。但单基因座扩增 结果发现， 这些基因座的扩增存在着一些问题， 有的扩增的产物量少， 显带过浅， 甚至有时 很难得到扩增产物， 如 DXS7130 ； 有的很容易出现非特异带 ( 如影子带 )， 如 DXS6797 ； 而上 述 14 个基因座易于扩增稳定性好， 结果清晰， 非特异性带很少。 0024 因此最后选择了 DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS6809、 DXS7424、 DXS6。
15、789、 DXS9898、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS101、 DXS10075、 GATA31E08、 DXS10074 和 DXS10079 这 14 个易于 扩增， 分型较好的基因座进行复合扩增。 0025 (3) 扩增产物片段长度不重叠 0026 复合扩增各基因座片段大小的差距应大于 20bp， 各基因座的等位基因之间才不会 发生重叠， 干扰分型。 0027 本发明的 X-STR 基因座复合扩增体系根据各基因座扩增产物片段长度大小， 用同 一荧光标记不同扩增产物片段长度 ( 相差大于 20bp) 的基因座， 保证复合扩增各基因座的 等位基因之间不会发生重叠， 不会。
16、干扰分型。用四种不同颜色的荧光标记多个基因座的引 说 明 书 CN 101787396 B3/7 页 5 物， 保证同一反应体系能同时扩增多个基因座， 而不影响各基因座的分型。本发明的 14 个 基因座引物分别用FAM、 HEX、 TAM、 ROX四种不同颜色的荧光标记。 体系中14个X-STR基因座 其荧光组合方式为 FAM 荧光素标记 DXS7133、 DXS6801、 DXS981 和 DXS6809， HEX 荧光素标记 DXS7424、 DXS6789、 DXS9898 和 DXS7132， TAMRA 荧光素标记 DXS165B12、 DXS101 和 DXS10075， ROX 。
17、荧光素标记 GATA31E08、 DXS10074 和 DXS10079。 0028 本发明提供一种同时分析多个 X 染色体 STR 基因座的荧光标记复合扩增体系， 包 括用于复合扩增分析的 14 个 X-STR 基因座的引物， 全部 14 个基因座的引物混合在一个试 管内。复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增， 其中每对引物中的 引物正链的 5 端用相应的荧光素标记。 0029 二、 本发明复合扩增基因座的扩增 0030 本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系是采用复合PCR技术在同一反应管 中同时扩增 14 个 X-STR 基因座。 0031 (1)PCR 反应体系。
18、 0032 反应总体积为 25l ： PCR 反应缓冲液 5.0l， 引物混合物 5.0lDNA 聚合酶 0.3l， 模板 DNA 2.0l， 消毒纯净水 12.7l。 0033 上述 DNA 聚合酶可选用本领域技术人员常用的 DNA 聚合酶， 如金牌 DNA 聚合酶 (Ampli Taq)。 0034 (2)PCR 扩增参数 ： 0035 95 11min 0036 0037 60 45min 0038 (3)ABI PRISM 3100 遗传分析仪电泳分型扩增产物 0039 a. 样品准备 ： 0040 0041 混匀后瞬时离心， 每管加 10.0l 混合物， 再加 PCR 产物 1.0l。
19、， 瞬时离心。95 变性4min， 放置冰盒中冷却3min， 取10.0l变性后的样品转移至96孔样品板， 装载入ABI PRISM 3100 遗传分析仪进行电泳。 0042 b. 电泳条件 ： 14.7kV， 130A， 14.8mW。 0043 c. 结果分析 ： GeneMapperIDv3.1 软件。 0044 本发明的 14 个基因座已在发明人实验室应用于群体学调查并获得中国群体的分 型结果， 结果证明这些基因座多态性较高， 适合于中国人群的检测， 并应用于实际检案取得 说 明 书 CN 101787396 B4/7 页 6 理想的结果。 0045 本发明的 X-STR 基因座荧光标。
20、记复合扩增体系也可以制成试剂盒， 为姐妹认亲和 隔代认亲提供新的检测系统， 为 X 染色体相关性遗传病进行产前诊断。 0046 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 0047 1. 灵敏度高 ： 本发明的 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系在模板量为 0.1ng 时 可检出全部 14 个基因座 ； 0048 2.个体识别率高 ： 本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系中的14个X-STR 基因座单倍型个体识别率达到 0.9999992 ； 0049 3. 本发明的 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系已在发明人实验室用于检测多 代家系和多个小孩家系的样本。结果在 120 例。
21、姐妹样本中 14 个 X-STR 基因座分型均有 1 个相同等位基因。58 例祖母 - 父亲 - 孙女的三代家系中祖母的 X-STR 均通过父亲稳定地传 递给孙女。这结果表明本研究所选的基因座稳定性好， 突变率低， 分型结果准确， 能满足实 际检案的需要 ； 0050 4. 本发明在国内首先研制出一组 14 个 X-STR 基因座同时在单一反应管中的复合 扩增的五色荧光标记 X-STR 复合扩增检测体系， 达到目前国际上荧光标记 X-STR 基因座复 合扩增试剂盒的最高水平 ； 0051 5. 本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、 方便， PCR 产物可用 310、 377、 ABI PRI。
22、SM 3100、 3130 等遗传分析仪电泳， 结果自动分析， 能标准化、 国际化， 保证不同实验室数 据比较的正确性 ； 0052 6. 本发明可制备一套试剂盒， 可进行商品化， 可以填补国内没有 X-STR 基因座荧 光复合扩增试剂盒的空白， 也可补充国际 X-STR 基因座荧光复合扩增试剂盒的不足， 作为 具有中国特色的 X-STR 基因座复合扩增试剂盒， 可用于亲子鉴定、 个体识别、 性别鉴定、 X 连 锁遗传病的基因定位， 特别是用于产前诊断和姐妹认亲、 同父异母的半姐妹认亲、 隔代认亲 等亲缘鉴定 ； 0053 7. 本发明的 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系可以为伴 X 连。
23、锁遗传病、 X 染色 体单亲二倍体、 X 染色体失活的亲源性鉴定等提供产前诊断方法， 也为解决仅靠常染色体 STR、 Y-STR 难以排除或认定亲缘关系的某些特殊检案 ( 姐妹认亲、 同父异母的半同胞姐妹 认亲、 隔代认亲等 ) 的亲缘鉴定提供新的鉴定方法， 具有广泛的应用前景。 附图说明 0054 图 1 为实施例中祖母样本的 14 个 X-STR 基因座复合扩增图谱 ； 0055 图 2 为实施例中孙女样本的 14 个 X-STR 基因座复合扩增图谱。 具体实施方式 0056 实施例1 应用含有14个基因座的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系进行姐妹 认定和祖母与孙女的鉴定。 0057 。
24、原理 ： X 染色体是人类性染色体， X-STR 是性染色体上一类多态性遗传标记， 男性 的 X-STR 以单倍型形式存在只能从其母亲中得到， 且只能遗传给女儿， 因此同父所生的姐 妹在 X-STR 基因座上有 1 个相同的等位基因。如果可疑姐妹样本中所有 X-STR 基因座中有 说 明 书 CN 101787396 B5/7 页 7 1 个相同的等位基因， 则不能排除其来自同一父亲， 如果有 3 个以上的 X-STR 基因座中无相 同等位基因， 则可以排除其来自同一父亲。同样孙女 X-STR 基因座有 1 个等位基因与其祖 母相同， 故可疑奶奶与孙女样本中所有X-STR基因座中有1个相同的等。
25、位基因， 则不能排除 她们的亲缘关系， 如果有3个以上的X-STR基因座中无相同等位基因， 则可以排除她们的亲 缘关系。 0058 操作步骤 ： 0059 1.DNA 提取 0060 Chelex-100 法 ： 剪取 4X4mm 的血痕或唾液斑， 加 200l 10 Chelex-100， 56烤 箱过夜， 置于 PCR 仪中 100 10min， 振荡 30sec， 10000r/min 离心 2min， 4保存备用。 0061 2.PCR 扩增 0062 PCR 扩增反应总体系为 25l ： PCR 反应缓冲液 (Buffer)5.0l， 引物混合物 (Primer Pair Mix)5。
26、.0l， 金牌DNA聚合酶(Ampli Taq)0.3l， 模板DNA 2.0l， 消毒纯净水 12.7l。 0063 上述 PCR 缓冲液的配方为 ： dNTP 200mol/L， MgCl21.5mmol/L， 1Buffer。 0064 上述引物混合物中， 各个基因座的引物序列及其荧光标记如表 1 所示。 0065 表 1 14 个 X-STR 基因座引物序列和荧光标记 0066 基因座 引物序列 荧光标记 DXS7133 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 FAM R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 DXS6801 F， 其核苷酸序列如 SEQ 。
27、ID NO ： 3 所示 FAM R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 DXS981 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示 FAM R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 6 所示 DXS6809 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示 FAM R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 8 所示 DXS7424 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 9 所示 HEX R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 10 所示 DXS6789 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 11 所示 HEX R， 其核苷酸序列如。
28、 SEQ ID NO ： 12 所示 说 明 书 CN 101787396 B6/7 页 8 DXS9898 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 13 所示 HEX R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 14 所示 DXS7132 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 15 所示 HEX R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 16 所示 GATA165B12 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 17 所示 TAMRA R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 18 所示 DXS101 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 19 所示 TA。
29、MRA R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 20 所示 DXS10075 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 21 所示 TAMRA R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 22 所示 GATA31E08 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 23 所示 ROX R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 24 所示 DXS10074 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 25 所示 ROX R， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 26 所示 DXS10079 F， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 27 所示 ROX R， 其核苷酸序列。
30、如 SEQ ID NO ： 28 所示 0067 3.PCR 扩增参数 ： 95预变性 11min， 94变性 1min， 61复性 1min， 72延伸 1min， 30 个循环， 再 60延伸 45min。 0068 4.ABI PRISM 3100 遗传分析仪电泳 0069 1) 开机 ： 开启稳压电源打开电脑 ( 进入 Win2000 系统 ) 开启 3100 主机电源 ( 仪器进入自检状态 ) 启动 3100DATACollection 数据采集软件。 0070 2) 装置准备 ： 定期清洗和安装 0071 把注射器、 毛细管、 Buffer 糟等拆下， 用纯水清洗， 晾干， 灌胶 。
31、： 注射器里注入 相当体积的 POP-4 胶， 排出空气。Buffer 糟里盛 1Buffer 溶液。双击 Run 3100Data CollectionVersion2.0软件点击菜单栏中的Wizards点击Fill Capillary wizards， 对毛细管注胶毛细管定位和样品编辑。 0072 3) 样品准备 ： 0073 说 明 书 CN 101787396 B7/7 页 9 0074 混匀后瞬时离心， 每管加10.0l混合物， 再加PCR产物1.0l， 瞬时离心。 95变 性 4min， 放置冰盒中冷却 3min， 取 10.0l 变性后的样品转移至 96 孔样品板， 装载入 31。
32、00 遗传分析仪进行电泳。 0075 4) 电泳条件 ： 14.7kV， 130A， 14.8mW。 0076 5) 结果分析 ： 用 GeneMapperIDv3.1 软件进行基因分型。 0077 分析结果如图 1 和 2 所示， 从图中可以看出孙女样本 14 个 X-STR 基因座的分型均 有 1 个等位基因与争议祖母相同， 故支持争议祖母与女孩存在祖母与孙女关系。 0078 具体案例 ： 0079 案情 ： 2009 年 12 月， 某女士带 1 个小女孩进行鉴定， 检点是否为她的孙女。 0080 具体鉴定过程采用前述的操作步骤 ： DNA 提取PCR 扩增PCR 扩增产物电 泳结果分析。
33、。 0081 结果解析如图 1 和 2 所示， 从图可知， 争议祖母与女孩样本 DXS7133、 DXS6801、 DXS981、 DXS6809、 DXS7424、 DXS6789、 DXS9898、 DXS7132、 GATA165B12、 DXS101、 DXS10075、 GATA31E08、 DXS10074 和 DXS1007914 个 X-STR 基因座的分型均有 1 个相同等位基因。即孙 女样本14个X-STR基因座的分型结果均有1个等位基因能从争议祖母中找到， 且14个基因 座 (DXS7133/DXS6801/DXS981/DXS6809/DXS7424/DXS6789/D。
34、XS9898/DXS7132/GATA165B12/ DXS101/DXS10075/GATA31E08/DXS10074/DXS10079) 的单倍型 9/11/13/36/15/15/12/14/1 0/23/17/10/16/18 或 9/11/13/36/15/19/12/14/10/23/17/10/16/18 尚未见报道， 在本实 验室检测 500 个无关个体仍未出现， 故其频率小于 0.2， LR 值 500。支持争议祖母与女 孩存在祖母与孙女关系。 说 明 书 CN 101787396 B1/6 页 10 一种 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系及其应用序列表 中山大学 一。
35、种 X-STR 基因座荧光标记复合扩增体系及其应用 28 PatentIn version 3.5 1 21 DNA 人工序列 1 agcttcctta gatggcattc a 21 2 21 DNA 人工序列 2 cttccagaat cagaagtctc c 21 3 21 DNA 人工序列 3 catttcctct aacaagtctc c 21 4 20 DNA 序 列 表 CN 101787396 B2/6 页 11 人工序列 4 cagagagtca gaatcagtag 20 5 25 DNA 人工序列 5 tcagaggaaa agaagtagac atact 25 6 22。
36、 DNA 人工序列 6 ttctctccac ttttcagagt ca 22 7 20 DNA 人工序列 7 tgaaccttcc tagctcagga 20 8 20 DNA 人工序列 8 tctggagaat ccaattttgc 20 9 22 DNA 序 列 表 CN 101787396 B3/6 页 12 人工序列 9 ctgcttgagt ccaggaattc aa 22 10 23 DNA 人工序列 10 gaacacgcac atttgagaac ata 23 11 24 DNA 人工序列 11 gttggtactt aataaaccct cttt 24 12 25 DNA 。
37、人工序列 12 aagaagttat ttgatgtcct attgt 25 13 20 DNA 人工序列 13 cgagcacacc tacaaaagct 20 14 20 序 列 表 CN 101787396 B4/6 页 13 DNA 人工序列 14 tcgattaggt tcagttccca 20 15 22 DNA 人工序列 15 agcccatttt cataataaat cc 22 16 24 DNA 人工序列 16 aatcagtgct ttctgtacta ttgg 24 17 24 DNA 人工序列 17 tatgtatcat caatcatcta tccg 24 18 2。
38、5 DNA 人工序列 18 ttaaaatcat tttcactgtg tatgc 25 19 序 列 表 CN 101787396 B5/6 页 14 23 DNA 人工序列 19 actctaaatc agtccaaata tct 23 20 23 DNA 人工序列 20 aaatcactcc atggcacatg tat 23 21 19 DNA 人工序列 21 aggaggggct agacaagtg 19 22 20 DNA 人工序列 22 cagattatgc ttgggcctgt 20 23 20 DNA 人工序列 23 aggggagaag gctagaatga 20 序 列 。
39、表 CN 101787396 B6/6 页 15 24 20 DNA 人工序列 24 cagctgacag agcacagaga 20 25 20 DNA 人工序列 25 acttcctact gccccacctt 20 26 24 DNA 人工序列 26 gtttcccctc agagagctga caca 24 27 20 DNA 人工序列 27 agattgtgcc aatgctctcc 20 28 24 DNA 人工序列 28 gtttgcctgt gttgtaacat cctt 24 序 列 表 CN 101787396 B1/2 页 16 图 1 说 明 书 附 图 CN 101787396 B2/2 页 17 图 2 说 明 书 附 图 。