耐热的芽孢杆菌及其在制备苯乳酸中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101831394 B (45)授权公告日 2011.12.21 CN 101831394 B *CN101831394B* (21)申请号 201010106503.9 (22)申请日 2010.02.05 CCTCC NO:M2010012 2010.01.18 C12N 1/20(2006.01) C12P 7/42(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (73)专利权人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 马翠卿 许平 郑兆娟 高超 李峰嵩 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 。

2、37219 代理人 王绪银 JP 特开 2000-300284 A,2000.10.31, CN 101508960 A,2009.08.19, CN 101608169 A,2009.12.23, (54) 发明名称 耐热的芽孢杆菌及其在制备苯乳酸中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一株耐热的芽孢杆菌， 该菌株 的名称为 Bacillussp.SDM， 已于 2010 年 01 月 18 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏登记号 为 CCTCCNo.M2010012。本发明还同时公开了所述 耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸 中的应用， 包括 (1) 斜面培养， (2) 种子培。

3、养， (3) 细胞悬液的制备， (4) 转化， (5) 样品处理与检测 等步骤。本发明利用该耐热的芽孢杆菌制备苯乳 酸的方法具有操作简单， 底物转化效率高、 速率 快， 产物苯乳酸产量高的特点， 在制备生物防腐剂 苯乳酸中具有很大的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马艳林 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 CN 101831394 B1/1 页 2 1.一株耐热的芽孢杆菌， 其特征在于， 该菌株的名称为Bacillus sp.SDM， 已于2010年 01 月 18 日保藏。

4、于中国典型培养物保藏中心， 保藏登记号为 CCTCC No.M 2010012。 2. 权利要求 1 所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101831394 B1/7 页 3 耐热的芽孢杆菌及其在制备苯乳酸中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一株耐热的芽孢杆菌及其应用， 尤其涉及所述耐热的芽孢杆菌在生物 转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。 背景技术 0002 苯乳酸 (phenyllactic acid， PLA)， 即 2- 羟基 -3- 苯基丙酸， 又名 3- 苯基乳酸或 - 苯乳酸， 是一种近年来引起人们关注的新型抑菌物质。与 Nisin。

5、 等细菌素相比， 具有广 范的抑菌谱， 对革兰氏阳性菌、 革兰氏阴性菌和真核微生物均有抑制作用。苯乳酸溶解性 好、 能在各种食品体系中扩散 ； 稳定性高、 具有宽广的pH范围和热稳定性。 苯乳酸还是一种 重要的化学合成前体， 在医药、 化工、 生物合成等领域具有宽广的应用范围。 0003 目前， 苯乳酸合成方法有化学合成法和生物转化法两种。化学合成法在不同程度 上存在技术复杂、 污染环境等缺点。生物转化法主要有两种方法 ： 微生物发酵和生物催化。 0004 中国专利申请号 200610088430.9 报道了利用植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 和戊糖乳杆菌 (L。

6、actobacillus pentose) 作为菌株以苯丙氨酸、 苯丙酮酸或苯 丙酮酸钠为底物， 添加碳源、 氮源及无机盐组成发酵培养基， 发酵法生产苯乳酸 ； 中国专利 申请号 200810021498.4 报道用植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)AS1.550 控制 pH 和补料发酵生产苯乳酸， 发酵时间7090小时， 最高产量为17.38克/升， 转化率51.1， 生产强度 0.241 克 / 升小时。苯丙酮酸是一种难溶物质， 其溶解度随温度的升高明显增 加， 从而可以提高苯乳酸的产量和生产速率。 耐热的芽孢杆菌最适生长温度高于乳杆菌， 同 时培养基简单， 生。

7、长速度快， 因而更适合苯乳酸生产， 然而利用耐热的芽孢杆菌生物转化苯 丙酮酸生产苯乳酸尚未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一株耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM， 以及利用其全细 胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的应用。 0006 本发明所述耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM 菌株已于 2010 年 01 月 18 日保 藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC， 地址为 ： 中国 武汉 武汉大学)， 保藏登记号为 CCTCC No.M 2010012。 0007 本发明所述耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM是从果园长期堆放腐烂水。

8、果的垃 圾堆周围土壤中筛选得到。该菌株细胞长杆状， 有芽孢， 能运动， 革兰氏染色阳性。在培养 基上产生为圆形、 凸起、 透明， 表面干燥光滑、 直径 2 3 毫米的菌落。它可利用葡萄糖、 木 糖、 麦芽糖、 果糖、 阿拉伯糖， 不能利用丙酸盐， 接触酶阳性， 不能水解明胶。其 16S rDNA 序 列与多株芽孢杆菌的 16S rDNA 序列比对相似性达到 96 98。 0008 本发明所述耐热的芽孢杆菌在生物转化苯丙酮酸制备苯乳酸中的应用。 0009 其中， 所述应用是利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备。

9、苯乳酸， 其方法步骤如下 ： 说 明 书 CN 101831394 B2/7 页 4 0010 (1) 斜面培养 ： 将耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 接种 到固体斜面培养基上， 在 30 60条件下， 静置培养 8 16 小时 ； 0011 (2) 种子培养 ： 刮取 1 2 环步骤 (1) 所得的斜面培养物接种到 100 300 毫升 液体种子培养基中， 在 30 60、 pH 值 5.0 7.5 的条件下， 10010 转 / 分钟振荡培养 8 20 小时， 制得种子培养液 ； 0012 (3) 细胞悬液的制备 ： 以体积比计， 。

10、按 3 5的的接种量将步骤 (2) 所得的种子 培养液接入 6 8 升发酵培养基中 ； 在 30 60、 pH 值 5.0 7.5 的条件下， 100 转 / 分 钟振荡培养 6 20 小时 ； 然后以 4,500500 转 / 分钟的转速离心 155 分钟收集菌体沉 淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重悬至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0013 (4) 转化 ： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖或木糖混合， 调 节反应混合物中底物苯丙酮酸的浓度为 50 220 毫摩尔 / 升， 辅助底物葡萄糖或木糖的 浓度为 10 80 克 / 升， 细胞悬液菌。

11、体干重为 10 80 克 / 升 ； 在 30 60、 pH 值 5.0 7.5， 10010 转 / 分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳酸 ； 转化反应 4 24 小时后制得含 有苯乳酸的细胞转化液 ； 0014 (5) 样品处理与检测 ： 取步骤 (4) 获得的细胞转化液先加热至 100， 再 1,20001000 转 / 分钟离心 52 分钟， 取上清液稀释至苯乳酸浓度为 0.5 2 毫摩尔后， 以 HPLC 检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。 0015 其中， 步骤 (1)、 (2)、 (3) 或 (4) 中所述菌体培养的温度优选 40 55。 0016 其中， 步骤 (2)、 (3) 或 。

12、(4) 中所述菌体培养的 pH 优选 5.5 7.0。 0017 其中， 步骤 (1) 中所述斜面培养的时间优选 10 14 小时。 0018 其中， 步骤 (2) 中所述种子培养的时间优选 10 15 小时。 0019 其中， 步骤 (3) 中所述菌体培养的时间优选 8 12 小时。 0020 其中， 步骤 (4) 所述反应混合物中苯丙酮酸的浓度优选 100 200 毫摩尔 / 升， 辅 助底物葡萄糖或木糖的浓度优选 30 60 克 / 升， 细胞悬液菌体干重优选为 20 60 克 / 升。 0021 其中， 步骤 (4) 中所述转化反应的时间优选为 10 20 小时。 0022 其中， 步。

13、骤 (4) 中所述的 pH 控制用碳酸钙或氢氧化钠调节。 0023 其中， 步骤 (5) 中所述的 HPLC 检测苯丙酮酸和苯乳酸含量的方法为， 稀释至苯乳 酸浓度为 0.5 2 毫摩尔的上清液用 0.22 微米滤膜过滤， 采用 Agilent 1100 液相色谱仪， 配备 ZORBAX 300SB C18(5 微米、 4.6250 毫米 ) 分离柱。具体操作条件 ： 流动相为 85的 1 毫摩尔硫酸和 15的乙腈， 流速为 0.7 毫升 / 分钟， 进样量 5 微升， 紫外检测器， 检测波长 210 纳米， 柱温箱温度为 30。利用苯丙酮酸和苯乳酸标准品做出标准曲线， 再根据标准曲 线计算出。

14、发酵液中苯丙酮酸和苯乳酸的含量。 0024 在上述利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催 化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的过程中， 种子培养使用的液体种子培养基配方为 ： 葡萄 糖或木糖 50 克 / 升， 酵母粉 10 克 / 升， 蛋白胨 5 克 / 升， 碳酸钙 25 克 / 升。固体斜面培养 基配方为在液体种子培养基基础上添加质量体积比 1.8的琼脂。115条件下灭菌 20 分 钟。发酵培养基配方为 ： 葡萄糖或木糖 50 克 / 升， 酵母粉 10 克 / 升， 碳酸钙 25 克 / 升。 0025 目前报道的苯乳酸生产菌。

15、主要是乳杆菌 (Lactobacillus)， 但乳杆菌发酵生产苯 说 明 书 CN 101831394 B3/7 页 5 乳酸的温度一般在30， 容易污染杂菌。 本发明提供的耐热的芽孢杆菌生长温度高， 是一种 新的可用于苯乳酸生产的微生物， 目前尚未见报道。 0026 本发明优势在于 ： 0027 本发明所选芽孢杆菌要求的培养基成分简单、 生长周期短， 生产成本低 ； 0028 由于本发明所选芽孢杆菌具有较高的培养温度 (45 60 )， 提高了反应过程 速率， 缩短了生产周期 ； 0029 底物苯丙酮酸是难溶物质， 由于该催化过程反应温度高， 增加了底物的溶解度， 提高了产物苯乳酸的浓度。。

16、 利用本发明所选耐热的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SDM CCTCCNo. M 2010012全细胞催化体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 最终苯乳酸产量可达到30克/升， 苯 乳酸得率可达 90以上， 生产强度为 1.56 克 / 升小时 ； 0030 由于菌体培养温度高， 可不对培养基进行灭菌， 减少了能量的消耗和营养物质 的损失， 降低了能耗和生产成本 ； 0031 利用全细胞催化法生产苯乳酸， 反应体系成分单一， 后续分离提取费用低。 附图说明 0032 本发明所述耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM 已于 2010 年 01 月 18 日保藏于 中国典型培养物保藏中心。

17、 ( 简称 CCTCC， 地址为 ： 中国武汉武汉大学 )， 保藏登记号为 CCTCC No.M 2010012。 0033 图 1 为利用耐热的芽孢杆菌 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化 体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸所得结果及苯丙酮酸和苯乳酸标准品的液相色谱图。A 为苯 丙酮酸标准品， B 为苯乳酸标准品， C 为细胞转化液样品。 具体实施方式 0034 下面通过实施例进一步阐明本发明， 但不仅限于此。 0035 实施例 1 0036 芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM 的筛选及鉴定 ： 0037 从某果园长期堆放腐烂水果的垃圾堆周围取。

18、得土样， 称取2克土样放入50毫升液 体培养基中， 100转/分钟， 55富集培养810小时后加入质量体积比为1的苯丙酮酸， 100 转 / 分钟振荡培养 10 小时， 重复这一过程 3 5 次。将培养的菌液稀释 10,000,000 倍 涂布固体培养基上， 在 55条件下静置培养 12 小时。选取长出的单菌落接种 50 毫升的发 酵培养基中， 振荡培养10小时后加入1质量体积比的苯丙酮酸， 100转/分钟振荡培养15 小时后检测生成的苯乳酸含量， 筛选能够转化苯丙酮酸生成苯乳酸的菌株。最终获得一株 转化能力较好、 能大量积累苯乳酸的菌株。 该菌株细胞长杆状， 有芽孢， 能运动， 革兰氏染色 。

19、阳性。在培养基上产生为圆形、 凸起、 透明， 表面干燥光滑、 直径 2 3 毫米的菌落。它可利 用葡萄糖、 木糖、 麦芽糖、 果糖、 阿拉伯糖， 不能利用丙酸盐， 接触酶阳性， 不能水解明胶。其 16S rDNA 序列与多株芽孢杆菌的 16S rDNA 序列比对相似性达到 96 98。将该菌株命 名为耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM。 0038 在上述筛选能够转化苯丙酮酸制备苯乳酸的菌株的方法中， 使用的液体培养基配 方为 ： 葡萄糖 20 克 / 升， 酵母粉 10 克 / 升， 碳酸钙 10 克 / 升， pH 为 6。固体培养基配方为 说 明 书 CN 10183139。

20、4 B4/7 页 6 在该培养基基础上添加质量体积比 1.8的琼脂。 0039 在上述筛选能够转化苯丙酮酸生产苯乳酸的菌株的方法中， 使用的发酵培养基配 方为 ： 葡萄糖 80 克 / 升， 酵母粉 20 克 / 升， 碳酸钙 40 克 / 升， pH 为 6。 0040 上述筛选得到的耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM 已于 2010 年 01 月 18 日保 藏于中国典型培养物保藏中心 ( 简称 CCTCC， 地址为 ： 中国武汉武汉大学 )， 保藏登记号为 CCTCC No.M 2010012。 0041 实施例 2 0042 利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp。

21、.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系 转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 其方法步骤如下 ： 0043 (1) 斜面培养 ： 将耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 接种 到固体斜面培养基上， 在 55条件下， 静置培养 10 小时 ； 0044 (2) 种子培养 ： 刮取 2 环步骤 (1) 所得的斜面培养物接种到 300 毫升液体种子培 养基中， 在 55、 pH 值 7.0 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 11 小时， 制得种子培养液 ； 0045 (3) 细胞悬液的制备 ： 取步骤 (2) 所得的种子培养液。

22、， 按 4的体积比的接种量接 入 8 升发酵培养基中 ； 在 55、 pH 值 7.0 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 11 小时 ； 然后以 4,500 转 / 分钟的转速离心 15 分钟收集菌体沉淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重悬 至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0046 (4) 转化 ： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合， 调节反应 混合物中底物苯丙酮酸的浓度为 200 毫摩尔 / 升， 辅助底物葡萄糖的浓度为 60 克 / 升， 细 胞悬液菌体干重为 60 克 / 升 ； 在 55、 pH 值 7.0， 100 转 / 分。

23、钟的条件下催化苯丙酮酸制备 苯乳酸 ； 转化反应 20 小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液 ； 0047 (5)样品处理与检测 ： 取步骤(4)获得的细胞转化液先加热至100， 再1,2000转 / 分钟离心 5 分钟， 取上清液稀释至苯乳酸浓度为 0.5 2 毫摩尔后， HPLC 检测苯丙酮酸含 量和苯乳酸含量。 0048 其中， HPLC 检测苯丙酮酸和苯乳酸含量的方法为， 稀释至 0.5 2 毫摩尔的上清 液用 0.22 微米滤膜过滤， 采用 Agilent 1100 液相色谱仪， 配备 ZORBAX 300SB C18(5 微米、 4.6250 毫米 ) 分离柱。具体操作条件 ： 流动相。

24、为 85的 1 毫摩尔硫酸和 15的乙腈， 流 速为 0.7 毫升 / 分钟， 进样量 5 微升， 紫外检测器， 检测波长 210 纳米， 柱温箱温度为 30。 利用苯丙酮酸和苯乳酸标准品做出标准曲线， 再根据标准曲线计算出发酵液中苯丙酮酸和 苯乳酸的含量。 0049 在上述利用耐热的芽孢杆菌 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化 体系转化苯丙酮酸制备苯乳酸的过程中， 种子培养使用的液体种子培养基配方为 ： 葡萄糖 或木糖 50 克 / 升， 酵母粉 10 克 / 升， 蛋白胨 5 克 / 升， 碳酸钙 25 克 / 升。固体斜面培养基 配方为在液体。

25、种子培养基基础上添加质量体积比1.8的琼脂。 115条件下灭菌20分钟。 发酵培养基配方为 ： 葡萄糖或木糖 50 克 / 升， 酵母粉 10 克 / 升， 碳酸钙 25 克 / 升。 0050 转化结束后， 苯乳酸产量为 29.6 克 / 升， 苯乳酸得率为 89.1， 生产强度为 1.56 克 / 升小时。 0051 转化结果的液相色谱图见图 1。 0052 实施例 3 说 明 书 CN 101831394 B5/7 页 7 0053 利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系 转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 其方法步骤如下 ： 。

26、0054 (1) 斜面培养 ： 将 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 接种到固体斜面培养基 上， 在 50条件下， 静置培养 12 小时 ； 0055 (2) 种子培养 ： 刮取 1 环步骤 (1) 所得的斜面培养物， 接种到 200 毫升液体种子培 养基中， 在 50、 pH 值 6.0 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 11 小时， 制得种子培养液 ； 0056 (3) 细胞悬液的制备 ： 取步骤 (2) 所得的种子培养液， 按 3.5的体积比的接种量 接入 7 升发酵培养基中 ； 在 50、 pH 值 6.0 的条件下， 100 转 / 分钟振。

27、荡培养 10 小时 ； 然后 以 4,500 转 / 分钟的转速离心 15 分钟收集菌体沉淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重 悬至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0057 (4) 转化 ： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合， 调节反应 混合物中底物苯丙酮酸的浓度为 180 毫摩尔 / 升， 辅助底物葡萄糖的浓度为 50 克 / 升， 细 胞悬液菌体干重为 55 克 / 升 ； 在 50、 pH 值 6.0， 100 转 / 分钟的条件下催化苯丙酮酸制备 苯乳酸 ； 转化反应 18 小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液 ； 0058 其它方法步骤均与。

28、实施例 2 相同。 0059 转化结束后， 以实施例 2 所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸 产量为 27.2 克 / 升， 苯乳酸得率为 90.9， 生产强度为 1.51 克 / 升小时。 0060 实施例 4 0061 利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系 转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 其方法步骤如下 ： 0062 (1) 斜面培养 ： 将 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 接种到固体斜面培养基 上， 在 55条件下， 静置培养 13 小时 ； 0063 (2) 种子培养 。

29、： 用步骤 (1) 所得的斜面培养物， 刮取 1 环接种到 300 毫升液体种子 培养基中， 在 55、 pH 值 6.0 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 12 小时， 制得种子培养液 ； 0064 (3) 细胞悬液的制备 ： 取步骤 (2) 所得的种子培养液， 按 3的体积比的接种量接 入 6 升发酵培养基中 ； 在 55、 pH 值 6.0 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 10 小时 ； 然后以 4,500 转 / 分钟的转速离心 15 分钟收集菌体沉淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重悬 至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0065 (4) 转化 。

30、： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合， 调节反应 混合物中底物苯丙酮酸的浓度为 140 毫摩尔 / 升， 辅助底物葡萄糖的浓度为 40 克 / 升， 细 胞悬液菌体干重为 40 克 / 升 ； 在 55、 pH 值 6.0， 100 转 / 分钟的条件下催化苯丙酮酸制备 苯乳酸 ； 反应 14 小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液 ； 0066 其它方法步骤均与实施例 2 相同。 0067 转化结束后， 以实施例 2 所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸 产量为 21.8 克 / 升， 苯乳酸得率为 93.6， 生产强度为 1.56 克 / 升小时。 0068。

31、 实施例 5 0069 利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系 转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 其方法步骤如下 ： 0070 (1) 斜面培养 ： 将 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 接种到固体斜面培养基 说 明 书 CN 101831394 B6/7 页 8 上， 在 50条件下， 静置培养 11 小时 ； 0071 (2) 种子培养 ： 刮取 2 环步骤 (1) 所得的斜面培养物， 接种到 200 毫升液体种子培 养基中， 在 50、 pH 值 5.5 的条件下， 100 转 / 分钟振荡。

32、培养 10 小时， 制得种子培养液 ； 0072 (3) 细胞悬液的制备 ： 取步骤 (2) 所得的种子培养液， 按 4.5的体积比的接种量 接入 6 升发酵培养基中 ； 在 50、 pH 值 5.5 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 9 小时 ； 然后 以 4,500 转 / 分钟的转速离心 15 分钟收集菌体沉淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重 悬至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0073 (4) 转化 ： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物木糖混合， 调节反应混 合物中底物苯丙酮酸的浓度为 100 毫摩尔 / 升， 辅助底物木糖的浓度为 30。

33、 克 / 升， 细胞悬 液菌体干重为 20 克 / 升 ； 在 50、 pH 值 5.5， 100 转 / 分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳 酸 ； 转化反应 10 小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液 ； 0074 其它方法步骤均与实施例 2 相同。 0075 转化结束后， 以实施例 2 所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸 产量为 15.8 克 / 升， 苯乳酸得率为 95， 生产强度为 1.58 克 / 升小时。 0076 实施例 6 0077 利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系 转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 。

34、其方法步骤如下 ： 0078 (1) 斜面培养 ： 将 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 接种到固体斜面培养基 上， 在 40条件下， 静置培养 11 小时 ； 0079 (2) 种子培养 ： 刮取 2 环步骤 (1) 所得的斜面培养物， 接种到 200 毫升液体种子培 养基中， 在 40、 pH 值 5.5 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 13 小时， 制得种子培养液 ； 0080 (3) 细胞悬液的制备 ： 取步骤 (2) 所得的种子培养液， 按 5的体积比的接种量接 入 7 升发酵培养基中 ； 在 40、 pH 值 5.5 的条件下， 100。

35、 转 / 分钟振荡培养 8 小时 ； 然后以 4,500 转 / 分钟的转速离心 15 分钟收集菌体沉淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重悬 至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0081 (4) 转化 ： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物木糖混合， 调节反应混 合物中底物苯丙酮酸的浓度为 160 毫摩尔 / 升， 辅助底物木糖的浓度为 45 克 / 升， 细胞悬 液菌体干重为 50 克 / 升 ； 在 40、 pH 值 5.5， 100 转 / 分钟的条件下催化苯丙酮酸制备苯乳 酸 ； 反应 16 小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液 ； 0082 其它方法步骤。

36、均与实施例 2 相同。 0083 转化结束后， 以实施例 2 所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸 产量为 24.5 克 / 升， 苯乳酸得率为 92.1， 生产强度为 1.53 克 / 升小时。 0084 实施例 7 0085 利用耐热的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)SDM CCTCC No.M 2010012 全细胞催化体系 转化苯丙酮酸制备苯乳酸， 其方法步骤如下 ： 0086 (1) 斜面培养 ： 将 Bacillus sp.SDM CCTCC No.M 2010012 接种到固体斜面培养基 上， 在 40条件下， 静置培养 14 小时 ； 0087 (2) 种子培。

37、养 ： 刮取 1 环步骤 (1) 所得的斜面培养物， 接种到 200 毫升液体种子培 养基中， 在 40、 pH 值 6.5 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 14 小时， 制得种子培养液 ； 说 明 书 CN 101831394 B7/7 页 9 0088 (3) 细胞悬液的制备 ： 取步骤 (2) 所得的种子培养液， 按 4.5的体积比的接种量 接入 8 升发酵培养基中 ； 在 40、 pH 值 6.5 的条件下， 100 转 / 分钟振荡培养 12 小时 ； 然后 以 4,500 转 / 分钟的转速离心 15 分钟收集菌体沉淀， 用 50mM、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲转液重 。

38、悬至菌体干重为 100 克 / 升 ； 0089 (4) 转化 ： 将 (3) 所得细胞悬液与底物苯丙酮酸及辅助底物葡萄糖混合， 调节反应 混合物中底物苯丙酮酸的浓度为 120 毫摩尔 / 升， 辅助底物葡萄糖的浓度为 30 克 / 升， 细 胞悬液菌体干重为 30 克 / 升 ； 在 40、 pH 值 6.5， 100 转 / 分钟的条件下催化苯丙酮酸制备 苯乳酸 ； 反应 12 小时后制得含有苯乳酸的细胞转化液 ； 0090 其它方法步骤均与实施例 2 相同。 0091 转化结束后， 以实施例 2 所述检测方法检测苯丙酮酸含量和苯乳酸含量。苯乳酸 产量为 18.3 克 / 升， 苯乳酸得率为 92， 生产强度为 1.53 克 / 升小时。 说 明 书 CN 101831394 B1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 。