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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510813221.5 (22)申请日 2015.11.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105331743 A (43)申请公布日 2016.02.17 (73)专利权人 新疆农业科学院植物保护研究所 地址 830052 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市沙依巴克区南昌路403号 (72)发明人 玉山江麦麦提韩盛杨渡 木巴热克阿尤普李继洋 丁新华吐尔逊阿合买提 阿布都克尤木卡德尔 买买提吐尔逊阿布拉 努尔孜亚亚力买买提 (74)专利代理机构 哈尔滨市文洋专利。
2、代理事务 所(普通合伙) 23210 代理人 何强 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (56)对比文件 CN 101875983 A,2010.11.03, CN 101906485 A,2010.12.08, CN 104805219 A,2015.07.29, CN 104357580 A,2015.02.18, 杨英华等.番茄斑萎病毒属6 种病毒的多重 RT PCR 检测. 植物检疫 .2011,第25卷(第6 期), 审查员 张蕊 (54)发。
3、明名称 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其 快速检测方法 (57)摘要 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其 快速检测方法， 它涉及一种快速检测甜瓜病毒病 的试剂盒及其快速检测方法。 它解决了现有甜瓜 病毒病多重RT-PCR检测技术可同时检测的甜瓜 病毒病种类少的问题。 一步快速检测甜瓜多种病 毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物。 快速检测方 法： 一、 提取被感染病毒叶片的总RNA； 二、 反转录 成cDNA； 三、 用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多 重RT-PCR。 本发明通过一次PCR可以同时检测出 多达7种的甜瓜病毒病， 可在田间采集、 鉴定甜瓜 病毒病种类， 具有鉴定过程简。
4、单、 步骤少、 设备要 求低、 费用少、 时间短和精确性高等优点。 权利要求书2页 说明书7页 序列表5页 附图4页 CN 105331743 B 2018.11.13 CN 105331743 B 1.一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒， 其特征在于一步快速检测甜瓜多种病毒的试 剂盒中含有7对RT-PCR引物； 用于扩 增西瓜花叶 病毒 病的 引物对 ： 上游 引物WMV1F的 核苷酸 序列为5- GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3 ， 下游引物WMV1R的核苷酸序列为5 -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT- 3 ； 用于扩 增黄瓜花叶 病毒 病的 引物对 ： 上游 引物CM。
5、V1F的 核苷酸 序列为5- GACAGTTGGGAATCGGA-3 ， 下游引物CMV1R的核苷酸序列为5 -AACAGGGAGCAAGAGGA-3 ； 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对： 上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5 - CACGAAGGACAAGGATGTGA-3 ， 下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5 -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC- 3 ； 用于扩增南瓜花叶 病毒的 引物对 ： 上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5- GGATGCCTTTGGCTATTGG-3 ， 下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5 -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA- 3 。
6、； 用于扩 增烟草花叶 病毒 病的 引物对 ： 上游 引物TMV-F的 核苷酸 序列为5- TTTTGGAGGAATGAGTTT-3 ， 下游引物TMV-R的核苷酸序列为5 -AGGGAAAAACACTATGC-3 ； 用于扩增番木瓜环斑病毒的 引物对 ： 上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5- CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3 ， 下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5 -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG- 3 ； 用于 扩 增甜 瓜 黄 斑 病毒的 引物 对 ： 上 游 引物 M Y S V F的 核 苷酸 序 列为 5- TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3 ，。
7、 下游引物MYSV R的核苷酸序列为5 -GGCCAATCTGATCCAGAGTA- 3 。 2.一步快速检测甜瓜多种病毒的方法， 其特征在于该方法按以下步骤进行： 一、 提取被感染病毒叶片的总RNA； 二、 反转录成cDNA； 三、 用7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR， 即可确定叶片是否感染了西瓜花叶病毒病、 黄 瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒 和甜瓜黄斑病毒， 以及病毒类型； 步骤三中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物WMV1F的核苷 酸序列为5 -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3，。
8、 下游引物WMV1R的核苷酸序列为5 - GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3 ； 用于扩 增黄瓜花叶 病毒 病的 引物对 ： 上游 引物CMV1F的 核苷酸 序列为5- GACAGTTGGGAATCGGA-3 ， 下游引物CMV1R的核苷酸序列为5 -AACAGGGAGCAAGAGGA-3 ； 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对： 上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5 - CACGAAGGACAAGGATGTGA-3 ， 下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5 -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC- 3 ； 用于扩增南瓜花叶 病毒的 引物对 ： 上游引物SqMV-1-F的核苷酸。
9、序列为5- GGATGCCTTTGGCTATTGG-3 ， 下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5 -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA- 3 ； 用于扩 增烟草花叶 病毒 病的 引物对 ： 上游 引物TMV-F的 核苷酸 序列为5- 权利要求书 1/2 页 2 CN 105331743 B 2 TTTTGGAGGAATGAGTTT-3 ， 下游引物TMV-R的核苷酸序列为5 -AGGGAAAAACACTATGC-3 ； 用于扩增番木瓜环斑病毒的 引物对 ： 上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5- CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3 ， 下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5 -。
10、TTCCACTGTGTGTCTCTCCG- 3 ； 用于 扩 增甜 瓜 黄 斑 病毒的 引物 对 ： 上 游 引物 M Y S V F的 核 苷酸 序 列为 5- TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3 ， 下游引物MYSV R的核苷酸序列为5 -GGCCAATCTGATCCAGAGTA- 3 ； 步骤三多重RT-PCR扩增体系为25L， 包括2L的模板cDNA、 2L的引物对、 浓度为 1.0mmol/L的dNTPs、 酶活为1U的Taq DNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+； 步骤三多重RT-PCR反应程序为94预变性4min， 94变性40s、 50退火复性35s、 7。
11、2 延伸60s， 35个循环； 72延伸7min。 3.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法， 其特征在于步骤二中采 用随机引物与反转录酶进行反转录。 4.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法， 其特征在于步骤三多重 RT-PCR扩增体系中引物对由扩增西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒 病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液按10: 9:8:8:5:5:3体积比组成。 5.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法， 其特征在于步骤三中PCR 反应在Biometra PCR仪上进行。 6.根据权利。
12、要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法， 其特征在于步骤三中PCR 产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测， EB染色后， 使用Bio-Rad凝胶成像系统观察。 7.根据权利要求2所述的一步快速检测甜瓜多种病毒的方法， 其特征在于步骤二在PCR 管中加入3 g总RNA， 采用0.4 L oligo(dT)18引物和0.6 L随机六聚体引物反转录cDNA。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105331743 B 3 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种快速检测甜瓜病毒病的试剂盒及其快速检测方法。 背景技术 0002 甜瓜病毒病一直是限制甜瓜生产的主要因。
13、素， 目前国内外没有一种有效的方法可 以防治甜瓜病毒病。 病毒病在瓜产区复合感病的情况比较普遍。 目前检测甜瓜病毒病病毒 种类的方法有双抗体夹心法(DAS-ELISA)和硝酸纤维素膜法(NCM-ELISA)法、 血清抗原检测 等方法； 但这些方法操作复杂、 费用高、 需要时间较长。 0003 多重RT-PCR技术可同时检测几种致病菌， 大大缩短了检验时间和流程， 节省了供 试材料， 尤其适合一些难分离， 难获取的种质材料或病源分离物的快速检测。 但是， 由于多 重RT-PCR体系中存在多对引物， 因此各引物对必须保持高度的特异性(以避免非特异性的 扩增)； 而且各对引物所扩增出的目的片段的大小。
14、差异性要大， 可以通过电泳或其他方法区 分(避免条带重叠或误判)； 还要避免所用引物间的相互作用； 各引物对须保持相对一致的 扩增效率等要求。 并且， 不同长度的模板核酸片段、 不同引物对所要求的退火温度也不一 样。 加之其他限制因素， 多重RT-PCR技术难以在甜瓜病毒病的实际检测中有优异的表现， 可 同时检测的甜瓜病毒病种类极少。 引物对越多扩增难度就越大， 因此， 目前所知植物病毒多 重RT-PCR检测技术最多只能一次同时检测5种。 发明内容 0004 本发明是为了解决现有甜瓜病毒病多重RT-PCR检测技术可同时检测的甜瓜病毒 病种类少的问题， 而提供的一种一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂。
15、盒及其快速检测方法。 0005 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物； 0006 用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物WMV1 F的核苷酸序列为5 - GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3 ， 下游引物WMV1 R的核苷酸序列为5 -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT- 3 ； 0007 用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物CMV1 F的核苷酸序列为5 - GACAGTTGGGAATCGGA-3 ， 下游引物CMV1 R的核苷酸序列为5 -AACAGGGAGCAAGAGGA-3 ； 0008 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对： 上游引物ZYM。
16、V-F的核苷酸序列为5 - CACGAAGGACAAGGATGTGA-3 ， 下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5 -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC- 3 ； 0009 用于扩增南瓜花叶病毒的引物对： 上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5 - GGATGCCTTTGGCTATTGG-3 ， 下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5 -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA- 3 ； 0010 用于扩增烟草花叶病毒病的引物对： 上游引物TMV-F的核苷酸序列为5 - TTTTGGAGGAATGAGTTT-3 ， 下游引物TMV-R的核苷酸序列为5 -AGGGAAAAACACTATG。
17、C-3 ； 0011 用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对： 上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5 - 说明书 1/7 页 4 CN 105331743 B 4 CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3 ， 下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5 -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG- 3 ； 0012 用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对： 上游引物MYSV F的核苷酸序列为5 - TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3 ， 下游引物MYSV R的核苷酸序列为5 -GGCCAATCTGATCCAGAGTA- 3 。 0013 用上述一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒快速检测的方法： 0014 。
18、一、 提取被感染病毒叶片的总RNA； 0015 二、 反转录成cDNA； 0016 三、 用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR， 即可确定叶片是否感染了西瓜 花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番 木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒， 以及病毒类型； 0017 步骤三中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物WMV1 F 的核苷酸序列为5 -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3 ， 下游引物WMV1 R的核苷酸序列为5 - GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3 ； 0018 用于扩增黄瓜花叶病。
19、毒病的引物对： 上游引物CMV1 F的核苷酸序列为5 - GACAGTTGGGAATCGGA-3 ， 下游引物CMV1 R的核苷酸序列为5 -AACAGGGAGCAAGAGGA-3 ； 0019 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对： 上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5 - CACGAAGGACAAGGATGTGA-3 ， 下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5 -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC- 3 ； 0020 用于扩增南瓜花叶病毒的引物对： 上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5 - GGATGCCTTTGGCTATTGG-3 ， 下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5 -。
20、GCCTCCTCGTGGCTTTGTA- 3 ； 0021 用于扩增烟草花叶病毒病的引物对： 上游引物TMV-F的核苷酸序列为5 - TTTTGGAGGAATGAGTTT-3 ， 下游引物TMV-R的核苷酸序列为5 -AGGGAAAAACACTATGC-3 ； 0022 用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对： 上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5 - CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3 ， 下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5 -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG- 3 ； 0023 用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对： 上游引物MYSV F的核苷酸序列为5 - TTGAGGCAGGATC。
21、TGAAGTC-3 ， 下游引物MYSV R的核苷酸序列为5 -GGCCAATCTGATCCAGAGTA- 3 ； 0024 步骤三多重RT-PCR扩增体系为25 L， 包括2 L的模板cDNA、 2 L的引物对、 浓度为 1.0mmol/L的dNTPs、 酶活为1U的Taq DNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+； 0025 步骤三多重RT-PCR反应程序为94预变性4min， 94变性40s、 50退火复性35s、 72延伸60s， 35个循环； 72延伸7min。 0026 西瓜花叶病毒病(WMV)、 黄瓜花叶病毒病Cucumber mosaic viroid(CMV)、 小西。
22、葫 芦黄花叶病毒病(ZYMV)、 南瓜花叶病毒(SqMV)、 烟草花叶病毒病(TMV)、 番木瓜环斑病毒 (PRSV)和甜瓜黄斑病毒(MYSV)是甜瓜病毒病中常见的种类， 而且在我国感染、 发病率高。 0027 本发明一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒针对西瓜花叶病毒病(WMV)、 黄瓜花 叶病毒病Cucumber mosaic viroid(CMV)、 小西葫芦黄花叶病毒病(ZYMV)、 南瓜花叶病毒 说明书 2/7 页 5 CN 105331743 B 5 (SqMV)、 烟草花叶病毒病(TMV)、 番木瓜环斑病毒(PRSV)和甜瓜黄斑病毒(MYSV)设计了7对 特异性引物。 扩增西瓜花叶病。
23、毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为1149bp， 扩增黄 瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为980bp， 扩增小西葫芦黄花叶病毒病 的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为789bp， 扩增南瓜花叶病毒的引物对所扩增出的核 苷酸片段长度为604bp， 扩增烟草花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为 397bp， 扩增番木瓜环斑病毒的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为300bp， 扩增甜瓜黄斑 病毒的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为250bp。 7对特异性引物扩增出的核苷酸片段长 度迥异， 长度相近片段的最小差异为50bp， 在凝胶电泳的过程中可以清楚地区分扩增到的 核苷酸条带。 。
24、0028 本发明通过一次PCR可以同时检测出多达7种的甜瓜病毒病， 可在田间采集、 鉴定 甜瓜病毒病种类， 具有鉴定过程简单、 步骤少、 设备要求低、 费用少、 时间短和精确性高等优 点。 0029 本发明检测方法在甜瓜产区复合感染病毒的检测中及甜瓜病毒病的发生规律研 究中， 具有节省时间、 降低成本、 灵明度高， 简便与效率高的优点。 附图说明 0030 图1是实施例1检测结果凝胶电泳图， 图中泳道中A标样为健康植株， 图中泳道CK中 标样为阴性对照， 图中泳道14中标样均为被7种甜瓜病毒病侵染的植株。 0031 图2是实施例2检测结果凝胶电泳图， 图中泳道中A标样为健康植株， 图中泳道17。
25、 中标样依次为被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病 毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒侵染的植株。 0032 图3是实施例3检测结果凝胶电泳图。 0033 图4是实施例4检测结果凝胶电泳图， 图中泳道17中标样多重RT-PCR扩增体系中 模板cDNA的体积依此为0.5 L、 0.75 L、 1 L、 1.25 L、 1.5 L、 1.75 L和2 L。 0034 图5是实施例5检测结果凝胶电泳图， 图中泳道17中标样多重RT-PCR扩增体系中 Mg2+的浓度依此为1.0mmol/L、 1.5mmol/L、 2.0mmol/L、 2.5mmo。
26、l/L、 3.0mmol/L、 3.5mmol/L和 4.0mmol/L。 0035 图6是实施例6检测结果凝胶电泳图， 图中泳道17中标样多重RT-PCR扩增体系中 dNTP的浓度依此为0.2mmol/L、 0.4mmol/L、 0.6mmol/L、 0.8mmol/L、 1.0mmol/L、 1.2mmol/L和 1.4mmol/L。 0036 图7是实施例7检测结果凝胶电泳图， 图中泳道17中用于扩增西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病 毒和甜瓜黄斑病毒的引物对的浓度比依此为1:1:1:1:1:1:1(引物对总体积5 。
27、L)、 2:2:2:1: 1:1:1(引物对总体积5 L)、 10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积5 L)、 1:1:1:1:1:1:1(引物对总 体积2 L)、 2:2:2:1:1:1:1(引物对总体积2 L)、 10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积2 L)、 1:1: 1:1:1:1:1； (引物对总体积7 L)。 0037 图8是实施例8检测结果凝胶电泳图， 图中泳道17中标样多重RT-PCR扩增体系中 Taq DNA聚合酶的酶活依此为0.25U、 0.5U、 0.75U、 1.0U、 1.25U、 1.5U、 1.75U。 说明书 3/7 页 6 CN 105331743 。
28、B 6 具体实施方式 0038 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0039 具体实施方式一： 本实施方式一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT- PCR引物； 0040 用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物WMV1 F的核苷酸序列为5 - GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3 ， 下游引物WMV1 R的核苷酸序列为5 -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT- 3 ； 0041 用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物CMV1 F的核苷酸序列为5 - GACAGTTGGGAATCGGA-3 ， 下游引物CMV1 R的。
29、核苷酸序列为5 -AACAGGGAGCAAGAGGA-3 ； 0042 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对： 上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5 - CACGAAGGACAAGGATGTGA-3 ， 下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5 -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC- 3 ； 0043 用于扩增南瓜花叶病毒的引物对： 上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5 - GGATGCCTTTGGCTATTGG-3 ， 下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5 -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA- 3 ； 0044 用于扩增烟草花叶病毒病的引物对： 上游引物TMV-F的核苷酸序列。
30、为5 - TTTTGGAGGAATGAGTTT-3 ， 下游引物TMV-R的核苷酸序列为5 -AGGGAAAAACACTATGC-3 ； 0045 用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对： 上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5 - CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3 ， 下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5 -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG- 3 ； 0046 用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对： 上游引物MYSV F的核苷酸序列为5 - TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3 ， 下游引物MYSV R的核苷酸序列为5 -GGCCAATCTGATCCAGAGTA- 3 。 0047。
31、 具体实施方式二： 本实施方式一步快速检测甜瓜多种病毒按以下步骤进行： 0048 一、 提取被感染病毒叶片的总RNA； 0049 二、 反转录成cDNA； 0050 三、 用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR， 即可确定叶片是否感染了西瓜 花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番 木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒， 以及病毒类型； 0051 步骤三中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物WMV1 F 的核苷酸序列为5 -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3 ， 下游引物WMV1 R的核苷酸序列为5 。
32、- GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3 ； 0052 用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对： 上游引物CMV1 F的核苷酸序列为5 - GACAGTTGGGAATCGGA-3 ， 下游引物CMV1 R的核苷酸序列为5 -AACAGGGAGCAAGAGGA-3 ； 0053 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对： 上游引物ZYMV-F的核苷酸序列为5 - CACGAAGGACAAGGATGTGA-3 ， 下游引物ZYMV-R的核苷酸序列为5 -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC- 3 ； 说明书 4/7 页 7 CN 105331743 B 7 0054 用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：。
33、 上游引物SqMV-1-F的核苷酸序列为5 - GGATGCCTTTGGCTATTGG-3 ， 下游引物SqMV-1-R的核苷酸序列为5 -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA- 3 ； 0055 用于扩增烟草花叶病毒病的引物对： 上游引物TMV-F的核苷酸序列为5 - TTTTGGAGGAATGAGTTT-3 ， 下游引物TMV-R的核苷酸序列为5 -AGGGAAAAACACTATGC-3 ； 0056 用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对： 上游引物PRSV-F的核苷酸序列为5 - CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3 ， 下游引物PRSV-R的核苷酸序列为5 -TTCCACTGTGT。
34、GTCTCTCCG- 3 ； 0057 用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对： 上游引物MYSV F的核苷酸序列为5 - TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3 ， 下游引物MYSV R的核苷酸序列为5 -GGCCAATCTGATCCAGAGTA- 3 ； 0058 步骤三多重RT-PCR扩增体系为25 L， 包括2 L浓度为1000ng/ L的模板cDNA、 2 L的 引物对、 浓度为1.0mmol/L的dNTPs、 酶活为1U的Taq DNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+； 0059 步骤三多重RT-PCR反应程序为94预变性4min， 94变性40s、 50退火复性35s、 7。
35、2延伸60s， 35个循环； 72延伸7min。 0060 具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式二的不同点是： 步骤二中采用随机 引物与反转录酶进行反转录。 其它步骤及参数与实施方式二相同。 0061 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式二或三的不同点是： 步骤三多重RT- PCR扩增体系中引物对由扩增西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液按10:9:8: 8:5:5:3体积比组成。 其它步骤及参数与实施方式二或三相同。 0062 扩增西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病。
36、毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液中引物的浓度都是10 M。 0063 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式二至四之一的不同点是： 步骤三中 PCR反应在Biometra PCR仪上进行。 其它步骤及参数与实施方式二至四之一相同。 0064 具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式二至五之一的不同点是： 步骤三中 PCR产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测， EB染色后， 使用Bio-Rad凝胶成像系统观察。 其它步 骤及参数与实施方式二至五之一相同。 0065 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式二至六之一的不同点是： 步骤二在 PCR管。
37、中加入3 g总RNA， 采用0.4 L oligo(dT)18引物和0.6 L随机六聚体引物反转录cDNA。 其它步骤及参数与实施方式二至六之一相同。 0066 实施例1 0067 采用本发明试剂盒和方法对同时被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦 黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜 病毒病侵染的甜瓜植株， 以及健康植株和阴性对照进行检测。 0068 检测结果如图1所示， 健康植株和阴性对照中均未有条带出现， 泳道14中都有7 条明亮、 清晰的条带， 且条带大小与西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病 毒病、 南瓜花叶病。
38、毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒一一对应。 0069 实施例2 说明书 5/7 页 8 CN 105331743 B 8 0070 采用本发明试剂盒和方法对分别被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦 黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒侵染的甜 瓜植株， 以及健康植株进行检测。 0071 检测结果如图2所示， 健康植株未有条带出现， 泳道17中分别在不同位置个出现 1条明亮、 清晰的条带， 且条带大小与西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病 毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒。
39、一一对应。 0072 实施例3 0073 采用本发明试剂盒和方法对新疆不同地区瓜产区采集样品的甜瓜病毒病种类进 行鉴定， 并采用已知西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶 病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒特异性引物分别对采集样品进行 PCR检测。 0074 本发明试剂盒和方法的检测结果如图3所示， 其结果与用已知西瓜花叶病毒病、 黄 瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒 和甜瓜黄斑病毒特异性引物分别进行PCR检测的结果一致。 说明本发明方法检测结果准确、 可靠。 0075 实施例4 0076。
40、 对同时被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病 毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行 检测。 0077 本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中模板cDNA的 体积分别为0.5 L、 0.75 L、 1 L、 1.25 L、 1.5 L、 1.75 L和2 L。 0078 检测结果如图4所示， 只有RT-PCR扩增体系中模板cDNA的体积为2 L的泳道中同时 出现了7条明亮、 清晰的条带。 0079 实施例5 0080 对同时被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南。
41、瓜花叶病 毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行 检测。 0081 本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中Mg2+的浓度分 别为1.0mmol/L、 1.5mmol/L、 2.0mmol/L、 2.5mmol/L、 3.0mmol/L、 3.5mmol/L和4.0mmol/L。 0082 检测结果如图5所示， 只有RT-PCR扩增体系中Mg2+的浓度为2.0mmol/L的泳道中同 时出现了7条清晰的条带。 0083 实施例6 0084 对同时被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病 毒、 烟。
42、草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行 检测。 0085 本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中dNTP的浓度 分别为0.2mmol/L、 0.4mmol/L、 0.6mmol/L、 0.8mmol/L、 1.0mmol/L、 1.2mmol/L和1.4mmol/L。 0086 检测结果如图6所示， 只有RT-PCR扩增体系中dNTP的浓度为1.0mmol/L的泳道中同 时出现了7条清晰的条带。 说明书 6/7 页 9 CN 105331743 B 9 0087 实施例7 0088 对同时被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西。
43、葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病 毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行 检测。 0089 本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中引物对由扩 增西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病毒、 烟草花叶病 毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒的引物对溶液分别按1:1:1:1:1:1:1(引物对总体积 5 L)、 2:2:2:1:1:1:1(引物对总体积5 L)、 10:9:8:8:5:5:3(引物对总体积5 L)、 1:1:1:1: 1:1:1(引物对总体积2 L)、 2:2:2:1:1:1:1(引。
44、物对总体积2 L)、 10:9:8:8:5:5:3(引物对总 体积2 L)、 1:1:1:1:1:1:1； (引物对总体积7 L)的体积比组成。 0090 检测结果如图7所示， RT-PCR扩增体系中引物对的体积比为10:9:8:8:5:5:3(引物 对总体积2 L)的6号泳道中同时出现了7条最为明亮、 清晰的条带。 0091 实施例8 0092 对同时被西瓜花叶病毒病、 黄瓜花叶病毒病、 小西葫芦黄花叶病毒病、 南瓜花叶病 毒、 烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒7种甜瓜病毒病侵染的甜瓜植株进行 检测。 0093 本实施例与本发明方法的不同点在于步骤三多重RT-PCR扩增体系中T。
45、aq DNA聚合 酶的酶活分别为0.25U、 0.5U、 0.75U、 1.0U、 1.25U、 1.5U、 1.75U。 0094 检测结果如图8所示， 只有RT-PCR扩增体系中Taq DNA聚合酶的酶活为1U的泳道中 同时出现了7条明亮、 清晰的条带。 说明书 7/7 页 10 CN 105331743 B 10 0001 序列表 1/5 页 11 CN 105331743 B 11 0002 序列表 2/5 页 12 CN 105331743 B 12 0003 序列表 3/5 页 13 CN 105331743 B 13 0004 序列表 4/5 页 14 CN 105331743 B 14 0005 序列表 5/5 页 15 CN 105331743 B 15 图1 图2 说明书附图 1/4 页 16 CN 105331743 B 16 图3 图4 说明书附图 2/4 页 17 CN 105331743 B 17 图5 图6 说明书附图 3/4 页 18 CN 105331743 B 18 图7 图8 说明书附图 4/4 页 19 CN 105331743 B 19 。