技术领域
本发明涉及分子生物学中基因扩增技术领域，具体涉及一种降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法。
背景技术
PCR一直是生物技术领域最有效的DNA序列获取方法，随着技术的进步，PCR有了很多的更新和应用。高通量测序技术是近10多年来，生物技术领域最为广泛应用的技术，自2005年诞生以来，通过测序科学家可以看到单核苷酸多态性、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。
多重PCR是指在一管反应体系里，平行进行2-数千以上的PCR反应，它有效的解决了多位点，多基因的靶向捕获需求。但PCR重数越多，则PCR的引物二聚体越严重，如图1所示，引物二聚体其实就是一对引物或者引物自身的3’端部分碱基互补结合，在Taq酶的作用下从3’末端延伸所形成的小分子量的双链DNA片段。
当多重PCR重数高到几百上千时，3端的部分碱基互补理论上常不可避免。引物二聚体的产生，会使得目标产物产量降低甚至没有，同时也影响多重PCR的重数。目前有很多解决引物二聚体的方法，如加入DMSO(二甲亚砜)，采用热启动聚合酶，提高退火温度等，但都未从根源上解决引物间互补问题。
专利号CN201510761091.5“一种三轮扩增的多重PCR方法”的在审中国专利提供了一种多重PCR的方法，但并没有解决多重PCR时，引物二聚体产生的问题。专利号：CN201210193352.4专利名为“一种通用多重PCR方法”的专利描述了一种在引物5端加通用序列来获得通用扩增引物，通过不同的PCR循环来实现平行多重扩增的方法，且该方法由于增加了引物长度，可能导致引物二聚体的产生几率变大。专利号：ZL 2015 1 0555967.0，CN201410586158.1，CN201410236110，CN 201010262894等等，都是基于少量扩增子的多重基因检测方法。在国外专利中，PCT/US2014/067666的专利提出了一种采用OMGA环来实现多重扩增的方法，也能实现大量PCR的平行扩增。
在上述专利中，CN201510761091.5需要扩3轮PCR才能实现文库构建用于测序。并没有从本底上避免引物二聚体的产生。PCT/US2014/067666由于采用了较长的引物，容易产生引物二聚体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法，用以解决现有多重PCR反应过程容易产生引物二聚体，构建基因文库覆盖性以及均一性差的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法，所述方法包括：
获取正向引物和反向引物，将所述正向引物和反向引物沿着5，-3，延伸方向上设计为模板杂交区和模板延伸区；
在所述模板杂交区上间隔有多个dSpacer和/或C3Spacer修饰，并在所述模板杂交区和模板延伸区之间有一个dSpacer或者C3Spacer修饰。
优选的，所述模板杂交区的长度为15-30碱基，TM值范围在60-65度。
优选的，所述模板延伸区的长度为10-20个碱基，TM值范围在45-55度。
优选的，所述模板杂交区和模板延伸区之间的dSpacer或者C3Spacer后面的碱基为T，将碱基T替换为碱基U。
优选的，所述引物的使用终浓度为100-300nmol。
优选的，所述多重聚合酶链式反应的条件为先低退火温度后高退火温度。
优选的，所述多重聚合酶链式反应采用Taq类聚合酶或者高保真类聚合酶。
优选的，所述模板杂交区中，每间隔10个碱基有一个dSpacer或者C3Spacer修饰。
本发明具有如下优点：
本发明的降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法，其大大降低了引物二聚体的产生几率，提高了构建基因文库的覆盖性以及均一性。
附图说明
图1为本发明的引物修饰A和引物未修饰BPCR引物二聚体产生比较示意图。
图2为本发明的修饰引物的结构示意图。
图3为利用本发明的降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法建库流程示意图。
图4为本发明的修饰引物及未修饰引物扩增产物电泳图，A1、A2是未修饰的引物扩增产物，B1、B2是修饰后的引物扩增产物，M是50bp MARKER。
图5为未修饰引物基因扩增产物的电泳图，其中，0为未加基因组的负对照，A1、A2、A3为未修饰MIX 3个基因组的扩增产物，M是50bp MARKER。
图6为修饰引物基因扩增产物的电泳图，其中，0为未加基因组的负对照，B1、B2、B3为修饰MIX 3个基因组的扩增产物，M是50bp MARKER。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中，“引物二聚体”是PCR的潜在副产物，引物二聚体由于引物中互补碱基而彼此杂交的引物分子组成。
本发明中，dSpacer或者C3Spacer修饰是引物合成中的一种修饰，其是起一种碳骨架作用，与DNA五碳糖及其磷酸二酯键提供的单碱基长度类似，这样可以补平一个碱基位，让DNA碱基在无碱基匹配时不存在因缺核苷酸导致的拉力或者压力。
当正向引物和反向引物在其3’端具有互补区域时，可能发生引物二聚体的形成。由于引物的高浓度，该互补区域可以是短至2-3个核苷酸以导致引物二聚体扩增。当该互补区域是至少4或5个核苷酸时，不需要的引物二聚体扩增几乎必然发生。本发明的降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法，可以很好地解决引物二聚体的扩增的问题。
如图1和图2所示，本发明的降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法，其包括：获取正向引物和反向引物，将正向引物和反向引物均划分为模板杂交区和模板延伸区；在模板杂交区上间隔有多个dSpacer和/或C3Spacer修饰，并在模板杂交区和模板延伸区之间有一个dSpacer或者C3Spacer修饰。本发明通过降低模板延伸区的引物长度，并在正向引物和反向引物上有上多个dSpacer和/或C3Spacer修饰，由于聚合酶不能识别这类修饰碱基，导致引物无法有效的互补延伸下去，在不降低模板结合能力的同时，有效降低了引物二聚合体产生的几率。
具体的，在模板杂交区中，每间隔10个碱基有一个dSpacer或者C3Spacer修饰。模板杂交区每10个碱基有一个dSpacer或者C3Spacer修饰，在模板杂交区和模板延伸区之间有一个dSpacer或者C3Spacer修饰，用于阻断引物之间非特异性结合造成的引物二聚体。通过加入dSpacer或者C3Spacer修饰后互补序列退火后进行高温连接，形成新的可用于高通量测序的文库构建，同时降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体的扩增，实现双区域退火，特异性好。
在设计的引物中，从5，-3，延伸方向上依次为模板杂交区和模板延伸区，模板杂交区的长度为15-30碱基，TM值范围在60-65度。模板延伸区的长度为10-20个碱基，TM值范围在45-55度，用于模板区域的延伸，多重聚合酶链式反应的条件为先低退火温度后高退火温度，多重聚合酶链式反应采用Taq类聚合酶或者高保真类聚合酶。
较佳的，模板杂交区和模板延伸区连接处设有dSpacer或者C3Spacer，在该dSpacer或者C3Spacer后面的碱基为T时，将碱基T替换为碱基U。如图3所示，为了配合高通量测序文库构建，模板杂交区和模板延伸区之间有一个dSpacer后面的碱基是紧挨着T，在合成时，将T替换为U以利于后面的酶切后直接连接。可直接USER酶切和连接，省去了常规建库的末端修复，磷酸化与加A过程。
本发明中，引物的使用终浓度为100-300nmol，多个引物混合形成多重PCR混合物，在聚合酶作用下，进行PCR扩增，可用的聚合酶为常见的Taq类聚合酶或者高保真类聚合酶，例如：赛默飞的白金Taq酶，(ThermoFisher，PlatinumTMTaq DNA Polymerase Cat:10966018)，NEB的OneTaq热启动DNA聚合酶(cat:#M0481)，NEB的Q5聚合酶，(cat:#M0492)。如图3所示，PCR产物用USER酶切，去除U后形成3’端A突出的PCR结构。同时，结合连接酶与接头连接，直接形成带有接头的文库，连接产物进行磁珠纯化，并PCR放大，形成最终文库产物。
实施例1：采用本发明降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法
1、设计PCR引物如下：
A：未修饰引物互补对，其中标记下划线是模板延伸区，非划线部分是模板杂交区
未修饰正向引物：
F:GGCAGGAGACTGGCGGTGGACCAGGTGGAGCCGAA
GCCTGTAAACAGGC
未修饰反向引物
R:AAAAGTTGCCAAGGTAGCTCAGTCTTGTGCTGCT
GCCTGTTTACAGGCC
B：修饰后的引物互补对，其中标记下划线是模板延伸区，非划线部分是模板杂交区
修饰后正向引物
Modify_F：GGCAGGAGACTGGCGG(dSpacer)GGACCAGGTGGAGCCGAA(dSpacer)GGCCTGTAAACAGGC
修饰后反向引物
Modify_R：AAAAGTTGCCAAGGTAGC(dSpacer)CAGTCTTGTGCTGCT(dSpacer)GCCTGTTTACAGGCC
2、利用上述引物进行如下PCR反应：
采用0.2ml PCR管，A/B组中每对引物在超净台里按照如下体系配置反应：超保真2X预混液20μl；Primer F(300nM)8μl；Primer R(300nM)8μl；H2O，总共40μl。
扩增程序设置：95℃3min；95℃15s，60℃20s，72℃4min，2-4步骤20个循环。72℃4min，10℃保存。
每对引物做2个平行实验，PCR结束后，所有产物进行电泳检测检测图，如图4所示，与未修饰的A引物比，由dSpacer修饰的B引物对在50-100bp之间并未产生引物二聚体N。
实施例2采用本发明降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法
本实施例中，采用120多对修饰引物和未修饰的引物，进行基因组PCR。修饰的引物如前描述，采用dSpacer修饰，并在正向引物和反向引物的模板杂交区和模板延伸区设计dSpacer，由于本实施例无需建库后续操作，所以紧挨的dU修饰可有可无。
1、引物MIX制备，每条引物稀释到100uM，然后非修饰的和修饰的正向引物和反向引物，将修饰引物和非修饰引物各自按照1：1混合成MIX A和B，每条引物取4ul混合至总体积4ml，终浓度100nM。
2、对每个引物混合MIX，进行如下PCR反应；
采用0.2ml PCR管，A/B每对引物在超净台里按照如下体系配置反应：超保真2X预混液5μl；PrimerMixA或者B 8μl；人基因组DNA20ng，H2O，总共30μl。
扩增程序设置：95℃3min；95℃15s，60℃20s，72℃4min，2-4步骤2个循环。95℃15s，50℃20s，60℃20s，72℃4min，5-8步骤18个循环，72℃4min，10℃保存。
每对引物做3个平行实验，并带一个不加基因组的负对照。PCR结束后，所有产物进行电泳检测检测图，如图5所示，未修饰的引物组MIX PCR，200左右目的带不明显L，50-100之间的引物二聚体非常多。如图6由修饰的B引物组MIX在200左右目的明显L，且在50-100bp之间并未产生引物二聚体N或者非常弱。
实施例3利用本发明的降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法建库流程
本实施例采用440多对修饰引物进行基因组PCR，并进行USER酶切和建库，完成完整的建库流程，并测序检验。修饰引物如前描述，采用dSpacer修饰，并在模板杂交区和模板延伸区有dSpacer和紧挨的dU修饰。
表1：基因组PCR的部分未修饰引物：
片段 F R Y300 TCCCTCAGTGGATACTTGCAGGCAGGCTTT GAGCTGTCAGCCTGCCTAAGCAGAGGAAAA Y369 TCTGCCTCTGCCATTTTCCTCTGCTTAGGCAGGC ACAATCAGGCCTGATGTCCTGAGACTAGGGTA Y293 CATGGATGTCTGGTGTGGCAATTTCTCAACATCATCTGC AGGCAAGTCCTTGCACGGGCTATCTGGGAAAGGCAG Y332 TGTTCTTGACTTCCCTGTCTCACTTCATCCTGC TGCTCAACTTGGACTTGCCTTTGTCATGGT Y305 ATTTACCTCTAATTCCGTTCCCAGTTGAGCAG ACTCTATGACCCAGAATGAAAACCCAAGGGGA Y308 TGTTTCATTGTCTGCAGTGAACCCAGGAAGAGA CATGACATGAAGCACCTGCTCAACTGGGAACTG
表2：基因组PCR的部分修饰引物：
1、引物MIX制备，每条引物稀释到100Um,然后按照1：1混合成PrimerMIX，每条引物取4ul混合至总体积2ml，终浓度200nM。
2、对每个引物混合MIX，进行PCR反应；
采用0.2ml PCR管，将修饰引物和非修饰引物中的每对引物在超净台里按照如下体系配置反应：超保真2X预混液15μl；PrimerMix 8μl；人基因组DNA 20ng；H2O，总共30μl。
扩增程序设置：95℃3min；95℃15s，60℃20s，72℃4min，2-4步骤2个循环。50℃20s，60℃20s，72℃4min，5-8步骤18个循环，72℃4min，10℃保存。
3、USER酶切
按照下列的配比准备反应混合物，第2步PCR产物30ul；USER酶(NEB，CAT：#M5505)1ul；将PCR仪器调至37度，热盖设置42-45度，反应15min。
4、文库接头连接
按照下列的配比准备反应混合物：第3步USER酶切产物31ul；USER酶1ul；T4DNA ligase buffer 10ul；Adapter oligo mix(15uM)3ul；DNA ligase 1ul；加水至总体积100ul。
将PCR仪器调至16度，反应120min，反应结束后，反应产物加150ul Ampure XP Beads Beads，按照纯化操作进行产物纯化，最终用20ul体系洗脱DNA。
5、文库PCR反应：步骤4纯化的DNA产物20ul；超保真2X预混液25μl；文库Primer F(10uM)2.5μl；文库Primer R(10uM)2.5μl；H2O，总共30μl。
PCR反应条件：
本发明中，PCR反应产物加150ul Ampure XP Beads Beads，按照纯化操作进行产物纯化，最终用20ul体系洗脱DNA。纯化步骤按照生工生物PCR纯化试剂盒操作步骤进行。
文库可进行高通量测序，测序结果统计如表3和表4所示，显示本发明的扩增方法多重PCR捕获的基因组覆盖度接近100％，均一性超过98％，本发明中，均一性是指片段测序深度大于平均测序深度20％的片段数目与总片段数目的百分比。
表3：测序统计表
表4：测序数据原始表(部分)
本发明的利用本发明的降低多重聚合酶链式反应中引物二聚体扩增的方法，进行基因组PCR中，基因组的覆盖度高，接近100％，均一性超过98％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。