一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用.pdf

《一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810680224.X (22)申请日 2018.06.27 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 曹春蕾赵运英曹正锋余培斌 毛银 (74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通合伙) 32257 代理人 杨慧林 (51)Int.Cl. C12N 1/18(2006.01) C12Q 1/18(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其。

2、应用 (57)摘要 本发明公开了一种具有克霉唑抗性的酿酒 酵母及其应用， 属于生物医药技术领域。 本发明 通过96孔板液体培养的方法， 对文库中以BY4743 为母菌株的4600多个单基因缺失株进行筛选， 并 且在添加2g/mL克霉唑的YPD固体培养基上进 行进一步倍比稀释验证， 确定和野生型相比， mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌对2g/ mL克霉唑具有抗性， 进而对它们抗氧化活性进行 了测定。 从本发明五个酿酒酵母所缺失的基因作 为研究基础出发， 进行克霉唑的生产改良以及其 他抗真菌新药物的研发， 同时， 也可找出其他致 病真菌中和这五个基因同源的基因。

3、， 得到单基因 缺失株， 用以验证克霉唑及其他新开发的抗真菌 药物的临床效果。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图1页 CN 108753634 A 2018.11.06 CN 108753634 A 1.一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母， 其特征在于， 所述酿酒酵母缺失了核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示的MRX14基因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的SLS1基因、 核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示的MRPL37基因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的IRC19基因或核苷酸序 列如SEQ ID NO.5所示的RML2基因中的一种或多种。 2.根据权利要。

4、求1所述的酿酒酵母， 其特征在于， 所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母 BY4743。 3.权利要求1所述的酿酒酵母在克霉唑药物生产改良中的应用。 4.权利要求1所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。 5.一种酿酒酵母MRX14基因在克霉唑药物改良中的应用， 其特征在于， 所述MRX14基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 6.一种酿酒酵母SLS1基因在克霉唑药物改良中的应用， 其特征在于， 所述SLS1基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 7.一种酿酒酵母MRPL37基因在克霉唑药物改良中的应用， 其特征在于， 所述MRPL37基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所。

5、示。 8.一种酿酒酵母IRC19基因在克霉唑药物改良中的应用， 其特征在于， 所述IRC19基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 9.一种酿酒酵母RML2基因在克霉唑药物改良中的应用， 其特征在于， 所述RML2基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108753634 A 2 一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用， 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 目前， 全球真菌感染率呈上升趋势， 尤其是深部真菌感染日渐引起关注， 真菌感染 成为威胁人类生活质量和生命健康的。

6、重要病因之一。 与之相反， 临床上能够有效治疗真菌 的药物种类相对有限， 并且部分药物不良反应较大。 0003 克霉唑(Clotrimazole， Clo)， 化学名为1-(2-氯苯基)二苯甲基咪唑， 是一种广 谱抗真菌药物。 克霉唑对多种致病真菌具有抗菌效果， 尤其是对白念珠菌的临床效果较好， 其抗菌作用机制为抑制真菌细胞膜中的麦角固醇等固醇的生物合成， 从而损伤真菌细胞膜 并且改变其通透性， 也可抑制氧化酶和过氧化酶的活性， 引起细胞内过氧化氢积聚导致细 胞亚微结构变性和细胞坏死。 对白色念珠菌的抗菌机制主要是抑制其具侵袭性的菌丝的形 成。 克霉唑目前主要供临床外用， 尤其是对由白念珠菌引。

7、起的念珠菌性阴道炎具有较为明 显的效果。 0004 然而， 由于近些年不规范使用抗菌药物， 甚至滥用抗菌药物等因素， 部分病原菌已 经逐渐对现有的抗真菌药物产生了耐药性， 有研究表明， 白念珠菌对于唑类抗真菌药物的 耐药率和最小抑菌浓度均有增高， 从而使临床上的治疗更为困难， 为了抑制白念珠菌， 需要 不断地提高抗真菌药物的剂量。 现市面上出售的药物已难以满足临床抗真菌感染治疗的需 求， 尤其是那些多重耐药菌株引起的感染， 经常因为无药可用而导致患者死亡。 因此， 对现 有抗真菌药物不断改良， 并且研发新的效果更好的抗真菌药物， 是目前医药行业至关重要 的一项课题。 0005 此外， 活性氧(。

8、reactive oxygen species,ROS)在调控细胞过程中有非常重要的 作用， 例如细胞凋亡、 氧化应激等， 目前也是分子医学和生命科学等最前沿的研究领域之 一。 研究发现， 如果ROS在细胞中过量积累， 会对细胞内的蛋白质、 核酸等生物大分子造成氧 化损伤， 且研究发现由ROS引起的细胞内的氧化损伤和细胞程序性死亡与心脏病、 肌萎缩侧 索硬化症等疾病相关联， 同时， ROS在细胞衰老的过程和在癌症的发展过程中起到至关重要 的作用。 0006 由于条件致病真菌白念珠菌和酿酒酵母的基因同源性较高， 抗病机制相似， 但白 念珠菌没有单倍体， 其遗传操作不如酿酒酵母容易。 因此， 很多。

9、白念珠菌的基因研究， 都是 先从酿酒酵母基因组出发， 研究酿酒酵母基因的功能， 从而再研究白念珠菌中同源基因的 功能。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)， 隶属于半知菌亚门， 芽孢菌纲， 隐球酵母目， 隐球酵母科， 酵母属， 也称啤酒酵母或芽殖酵母(budding yeast)， 因其具有单细胞、 繁殖 快、 有单倍体和双倍体两种状态存在等优点， 被当做真核模式生物。 酿酒酵母全基因组的测 序完成及对其基因组和蛋白组学的研究探索， 为其他真核生物尤其是高等生物及人类的基 因组结构和功能的研究和探索提供了基础， 尤其是为人类疾病的研究提供了模型。 然而， 目 前酿酒酵。

10、母中哪些基因改变对抗真菌药物酮康唑具有抗性并不明确， 无法有针对性的利用 说明书 1/4 页 3 CN 108753634 A 3 酿酒酵母对酮康唑药物进行改良。 发明内容 0007 为了克服上述问题， 本发明利用添加2 g/mL克霉唑的YPD培养基， 对酿酒酵母基因 缺失株进行大规模筛选， 得到了五种对2 g/mL克霉唑具有抗性的基因缺失菌株， 说明缺失 该基因之后， 2 g/mL克霉唑对其没有抗菌效果。 因此， 从这五个基因出发， 用以改良克霉唑 及新的抗真菌药物的研发， 可以解决临床上一部分真菌抗药性的问题。 0008 本发明的第一个目的是提供一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母， 所述酿酒酵母。

11、缺失 了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的MRX14基因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的SLS1基 因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的MRPL37基因、 核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的IRC19 基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RML2基因中的一种或多种。 0009 在本发明的一种实施方式中， 所述酿酒酵母的宿主为酿酒酵母BY4743。 0010 本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母在克霉唑药物生产改良中的应用。 0011 本发明的第三个目的是提供所述的酿酒酵母在抗真菌药物生产中的应用。 0012 本发明的第四个目的是提供一种酿酒酵母MR。

12、X14基因在克霉唑药物改良中的应 用， 所述MRX14基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0013 本发明的第五个目的是提供一种酿酒酵母SLS1基因在克霉唑药物改良中的应用， 所述SLS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0014 本发明的第六个目的是提供一种酿酒酵母MRPL37基因在克霉唑药物改良中的应 用， 所述MRPL37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 0015 本发明的第七个目的是提供一种酿酒酵母IRC19基因在克霉唑药物改良中的应 用， 所述IRC19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 0016 本发明的第八个目的是提供一种酿酒酵。

13、母RML2基因在克霉唑药物改良中的应用， 所述RML2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示 0017 在本发明的一种实施方式中， 是以从美国Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母双 倍体单基因缺失菌株文库出发， 对该文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进 行96孔板液体培养筛选： 在添加1 g/mL克霉唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时 进行抗性筛选。 0018 本发明的有益效果在于： 0019 本发明提供的五个基因缺失菌株对临床上使用的抗真菌药物克霉唑具有抗性， 因 此， 可从这五个酿酒酵母基因作为研究基础出发， 进行克霉唑的生产改良以及其他抗真菌。

14、 新药物的研发， 同时， 也可找出其他致病真菌中和这五个基因同源的基因， 得到单基因缺失 株， 用以验证克霉唑及其他新开发的抗真菌药物的临床效果。 附图说明 0020 图1为mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌在2 g/mL克霉唑D固体培养基中的 表型； 0021 图2为mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌抗氧化活性测定结果。 说明书 2/4 页 4 CN 108753634 A 4 具体实施方式 0022 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施， 但所举实施例不。

15、作为对本发明的限定。 0023 在本发明中， 首先采用96孔板液体筛选的方法， 对文库中以BY4743为母菌株的 4600多个单基因缺失株进行筛选， 在添加1 g/mL克霉唑的YPD液体培养基上对菌株进行培 养24小时， 和野生型相比， 发现mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌对克霉唑具有抗性， 然后在添加2 g/mL克霉唑的YPD固体培养基上进行进一步倍比稀释验证， 确定和野生型相 比， mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌对2 g/mL克霉唑具有抗性， 进而对它们抗氧化 活性进行了测定。 0024 YPD培养基组成： 每升。

16、YPD培养基含有20g蛋白胨， 20g葡萄糖和10g酵母提取物， 定 容后1105Pa灭菌30min。 固体培养基每升加入20g的琼脂粉。 0025 实施例1： 96孔板液体培养基初筛 0026 1.96孔板每个孔中加入200 L YPD液体培养基， 每个孔中接种活化缺失株文库中 不同菌株， 过夜培养菌株至饱和。 0027 2.预先配置YPD液体培养基和YPD+1 g/mL克霉唑的液体培养基， 分别加至两个96 孔板中， 每个孔加培养基180 L。 0028 3.两个96板上相同位置分别加入20 L相同浓度的已活化的同一种缺失株菌液， 同 时， 在每块96孔板的固定位置加入一个野生型对照， 3。

17、0过夜培养。 0029 4.过夜培养之后的96孔板用涡旋仪轻轻混匀， 用酶标仪测定每个孔的OD600数值。 0030 5.YPD培养基培养的菌株OD600数值减去相应YPD+1 g/mL克霉唑培养的同一菌株 的OD600数值， 和野生型差值比较， 差值小于-0.3以上的， 视为抗性菌株。 0031 在添加1 g/mL克霉唑的YPD液体培养基上对菌株进行培养24小时， 发现mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌对克霉唑具有抗性。 0032 实施例2： 倍比稀释筛选验证 0033 1.预先在YPD固体平板上活化初筛得到的抗性菌株及野生型菌株。 0034 2.接种已活。

18、化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中， 220r/min， 30过夜培养至饱和。 0035 3.用无菌水十倍梯度稀释培养饱和的菌液， 使每个菌株分别稀释成5106、 5 105、 5104、 5103和5102cells/mL 5个梯度浓度。 0036 4.分别取2 L每个菌株不同梯度的稀释菌液在预先配制好的YPD和YPD+2 g/mL克 霉唑的平板上点板， 最后一行加上野生型对照， 30培养48小时。 0037 5.观察菌落生长情况， 拍照， 从初筛结果中验证出真正对于克霉唑抗性的菌株。 0038 由图1所示， 在添加2 g/mL克霉唑的YPD固体培养基上进行进一步。

19、倍比稀释验证， 确定和野生型相比， mrx14、 sls1、 mrpl37、 irc19、 rml2五株菌对2 g/mL克霉唑均具有抗性。 0039 实施例3： 抗性菌株细胞中ROS测定 0040 1.预先在YPD固体平板上活化得到的抗性菌株及野生型菌株。 0041 2.接种已活化的抗性菌株及野生型对照菌株单菌落于3mL YPD液体培养基中， 220r/min， 30过夜培养至饱和。 说明书 3/4 页 5 CN 108753634 A 5 0042 3.饱和菌液以十分之一的量转接两份， 其中一份加入终浓度为1 g/mL的克霉唑， 两份中都加入终浓度为2 g/mL的DHE， 避光培养至对数生长。

20、期。 0043 4.3步骤培养的分别取菌液1.5mL， 室温下4 000r/min收集菌体。 0044 5.用500 L PBS缓冲液洗2次， 重悬到500 L的PBS中。 0045 6.每个菌液取200 L分别加入黑色和透明的96孔板中。 0046 7.黑色96孔板用荧光酶标仪进行测定荧光， 激发波长490nm， 发射波长610nm， PMT 自动， 透明的96孔板用来测定OD600值。 0047 8.每个菌株的荧光值除以OD600值， 得到了其细胞内ROS含量的多少和加入克霉唑 之后细胞内ROS变化。 0048 和野生型相比， mrx14、 mrpl37、 irc19三株菌加入克霉唑之后，。

21、 细胞内的氧化损伤 更加严重， 而sls1和rml2加入克霉唑之后， 细胞内的氧化损伤反而降低了。 因此， 可以推测 菌株sls1和rml2的抗克霉唑机制可能和细胞内氧化损伤降低有关。 基因SLS1和RML2可用以 研究后续由氧化损伤引起的疾病。 0049 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例， 本发明的保护范 围不限于此。 本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明 的保护范围之内。 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说明书 4/4 页 6 CN 108753634 A 6 序列表 江南大学 一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用 5 SIPOSe。

22、quenceListing 1.0 1 318 DNA （Saccharomyces cerevisae） 1 atgccactat ttgcaaggct ctgccagcct caatcaagaa gaatgttttc atctatatct 60 tctttctctg ctctatctgt gttacgccca caaaccggta tgctcttaaa cagttcacca 120 ttgaagactc cgtccttcac accgttggga tttggcttaa taggtcaaag aagatggaaa 180 tcaaggggta acacctatca acctagtaca tt。

23、gaaacgga agagaacttt tggtttcttg 240 gctagggcca agagcaaaca gggctctaag atattgaaaa ggaggaagct caaaggtagg 300 tggtttttgt ctcattga 318 2 1932 DNA （Saccharomyces cerevisae） 2 atgtggaaat tcaacaaaaa gctcgcccgt cttacttacc gtctttattc aagctcaggc 60 ccaagctcgc cccttcatgg gaagaagaaa ctgccgcaaa atctgaaatt cgtcgtct。

24、tg 120 aaccctaccc aatctgggct agtgaaaaat gatcagaagc agcctagaca caggccgtct 180 aagaaacgta gccataagga aactggagat aacaacctcg atttcggctc gaaactcctt 240 gtcttcgaaa agcagaattc actagattcc gcattgaact ccatccgatt gaagaaaccg 300 acaagcgcca gtctgccctc cctggaatac aatgcccttc tccaatcgct tacatcaagc 360 tacaatcgct ac。

25、caactgcg cgagttcatc tccacacatc agccagactc ctcttcacat 420 ctgacgcact ggaagaaaag caagctgtcc caatatataa ttgaaaaaat ctggaattgc 480 caaccaattt caacacccac cactcccaca ggcatcaagt ccacatcatt gactttccag 540 ttcgattctc ctagagaaat tttcctttta ctcatcactc aaaatggtaa aatactcacc 600 aacttcaata agctcgggct gacattcatc 。

26、atctccattc aggataacga attgaccgtc 660 aagggttcgc ctagcttgct caaatacgca gaaatatcct taaacaaaat atggtcaaac 720 atcactcatg aaaatgtgcg tatgtattcc ctcatgccat caaaagacgt catcaacctt 780 attcagaagg aaactcacac tttttttgaa tacctcccgg acttgcaaat gtacaagatt 840 tcagccctaa gcaccaagaa aatatccatg gccaaagtct ttttattaa。

27、a tgccgtcgct 900 tctaatccta acacaactca acaccaccac acaatagcct caccagcact caagacagaa 960 ctctatccgt tcaacaatac tctagagaac ttggactggc taaacaagtc acaagattgg 1020 序列表 1/3 页 7 CN 108753634 A 7 gcaagattac agtcagttgt ccctaaaaat tgcacagatc tgatgactcc cactgaaaac 1080 gccacaccag aattgacaga tgcgcaggtc agccaattc。

28、g aatcttcctt gtctaaaaat 1140 ataccatctc tctccccttc cgactctatt tcccaatctt tatcaataac gctaggtcac 1200 tccttacagt ccgcgtcttt ttctagtatt ttccaacctc taatacataa gagttttatt 1260 tcaaaattac tgaatctacc aatgtacaaa gaatcatcat catcagccgt acctgtgcct 1320 gtgcctcttg atcaacatct aataacaaat gcgcatcaat ccttcataca gct。

29、gaacttc 1380 actcctgtgc cgcccacctc tggctcctcc tcgtcccctt ttttgcagat ttggttcgag 1440 attgacgaat tcgataacat tgttaccacc tcaatgaggc ctcttttgaa attacaagaa 1500 aattctgtta tcttaagaac tccacaatgc cagacagact ataagatcac gtcagattac 1560 attcaagatc ttttacctga tttcgaccag accaatccgg atgcttggtt atctgaacaa 1620 aaa。

30、ggcctcc aagaatttct tctcaagtca cactggaagt taaacaaata tcagaatctt 1680 atgaaaaaaa tcaacatttc tttaccagat aacctaatac agcaatacca attgactgat 1740 gttttgaccc atcgtgtctt gaatttacga tttcctacga acactgccca agatgataaa 1800 tacatcattc aatattcaga tatcagccgc ggatttttga acaatggctc ctacagacaa 1860 ttagatttca tcaatgtg。

31、aa ccccagtgaa acctcactaa aaacctttat caatgatgtt 1920 ttaagctttt aa 1932 3 318 DNA （Saccharomyces cerevisae） 3 atgttggcgc gcagtttggg ttacaggttg atatcgacca gtcgtatctt atataataaa 60 cccacggtta agtcagtggt gtcgtcgtgt cctgcgggaa catcgcttaa cttaaacata 120 tggaagagcg gtaaagacgc agtggcactc gaggacaagg agtatcca。

32、aa ttggttatgg 180 agcgtattgg atagtgatca cgttgtcgaa catgcggctg aggacccaga gggacaggct 240 ctcttaaaga gaagaaagaa cataaggaag gcgaacaggc agcgaatcaa gcaaaacaat 300 ttcttgagcc aactttaa 318 4 693 DNA （Saccharomyces cerevisae） 4 atgcgtaagc cttctattac gataacaaca gcaaaagcta ttataactcc agactatact 60 cttattaaat 。

33、cgcattctaa ataccaactt ccttcacgtt ttcaaaagct agatgcagac 120 tcacctgaga gaagtacagt tgttaagcta ttttaccgcc gatttatgag gcttaagcct 180 ttcatatcga atgtgaaaat ggttaaagat acttacaggg attatgttcg atataagttt 240 atgaaagaaa actacgaact caaacgatac ttggtattca atcctgatgg cttgaggtcg 300 aaaatcaatc ttgagcttct cagcaacac。

34、g aaatgttgtg aaaggatact ccccgtgact 360 gagatgcaaa gaaccttgga atttgttctg aagagctgtt catacttgcc cgaaacaaaa 420 序列表 2/3 页 8 CN 108753634 A 8 gttcaaaagt gggatattgc aagggacaac acatattgca ggcaaatttt aaagaacctt 480 ttaacaatgc aatatgaaaa gtacagatcg attttgcata gaggaatagg ccatgatgag 540 cttgacgtca aattctctca 。

35、tttgaaaact acttctagtc cgctaactaa gctaaataaa 600 accgaaaaga aaaagattcc gcttttcaaa gtatttagtg atttcgatac aacattgata 660 tatctcaatg agacattagg tacaaggtta taa 693 5 1182 DNA （Saccharomyces cerevisae） 5 atgttggtgc tagggtctct tagatcggcg ctgtcgtgca gttccacagc atcgcttatt 60 agtaagagaa acccttgtta tccatacggt 。

36、atactctgtc gaactctatc tcagagtgtt 120 aaattgtggc aagagaatac ttcaaaagat gactccagtt tgaacattac tccacgatta 180 ctaaagatta tacctaacga tactgatatc gtgactcttg agaagcagga tgaattgatt 240 aaaagacgtc gtaaactttc gaaagaagtg acccagatga agaggctaaa acccgtctca 300 cctggtttga gatggtaccg ttcccccatt tatccatatt tgtacaaag。

37、g tcgtccggtt 360 agagccctaa ctgttgttcg aaagaagcac ggtggtagaa ataattcagg aaaaatcact 420 gtccgtcacc aaggtggtgg ccatagaaat agaacgaggc tgatagactt taacagatgg 480 gaaggtggtg cacaaacggt gcaaaggatt gagtacgatc cgggtagatc ctctcatatc 540 gccctattga agcataatac taccggcgaa ttgtcttata ttattgcttg tgatgggtta 600 cgc。

38、ccaggcg atgtggtcga atccttcaga agaggtattc ctcaaacttt actgaatgaa 660 atgggcggga aagtagaccc tgctatcttg agtgttaaga ctacccaaag aggcaactgt 720 ctacctattt ccatgatccc cataggtact attattcaca acgttggcat aacacccgtt 780 ggacctggaa aattttgtcg ctctgctggt acatatgcca gagtccttgc gaaattacct 840 gaaaaaaaga aagctattgt t。

39、agattacaa agcggtgaac atcgttatgt gtctttagag 900 gctgtcgcta ccattggcgt ggtctccaat attgaccatc aaaacagatc tcttggtaaa 960 gccggcagat caagatggtt agggataaga cccactgtta gaggtgttgc catgaataaa 1020 tgtgaccatc ctcacggtgg tggccgtggt aaatccaagt ctaataaatt atcaatgtct 1080 ccatggggac aactggcaaa ggggtacaag actagaaggg gtaaaaatca aaatagaatg 1140 aaagtaaaag acagaccaag aggcaaagat gcaagattat aa 1182 序列表 3/3 页 9 CN 108753634 A 9 图1 图2 说明书附图 1/1 页 10 CN 108753634 A 10 。